全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（6）：1099–1106 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–03–12；修回日期：2012–05–06
基金项目：黑龙江省自然科学基金项目（C201039）；东北农业大学创新团队项目（CXT002-2-2）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yxh100@sohu.com；jxm0917@163.com）
结球甘蓝春化相关基因 BoVIN3 的克隆及其表
达分析
赵荣秋，胡 远，蒋欣梅*，于锡宏*
（东北农业大学园艺学院蔬菜生理与设施园艺研究室，哈尔滨 150030）
摘 要：根据已报道的拟南芥春化相关基因 VIN3 设计引物，通过 RT-PCR 方法首次从结球甘蓝中克
隆得到两条春化相关基因BoVIN3的 cDNA ORF编码区序列，各 1 680 bp，GenBank登录号分别为 JQ394927
和 JQ394928，可编码由 560 个氨基酸组成的蛋白质；与拟南芥 VIN3 基因在核酸水平上同源性分别达到
85.55%和 79.95%；与拟南芥氨基酸序列同源性分别为 80.72%和 72.96%。半定量 RT-PCR 表达分析表明
BoVIN3 受春化作用的诱导，只在感应低温的茎尖生长点表达，在其它部位不表达，并且其转录产物随春
化时间延长逐渐积累，在春化 42 d 时达到峰值；而在不同浓度 GA3和 KT 诱导下不表达；FLC 受春化作
用的抑制，并且 BoVIN3 受诱导表达后才能使 FLC 的表达受到抑制，暗示在结球甘蓝中 BoVIN3 可能参与
春化调控开花的生物学过程，属于春化特异基因，只响应低温诱导而转录。
关键词：结球甘蓝；VIN3；春化作用；基因表达
中图分类号：S 635.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）06-1099-08

Cloning and Expression Analysis of BoVIN3 from Cabbage
ZHAO Rong-qiu，HU Yuan，JIANG Xin-mei*，and YU Xi-hong*
（Vegetable Physiology and Installation Horticulture Laboratory，College of Horticulture，Northeast Agricultural
University，Harbin 150030，China）
Abstract：The mid harvest season cabbage variety‘Guangrong 1’was used in this experiment.
Fourteen leaves cabbage plants were vernalized in the incubator at 8 .℃ Two vernalization-related genes
were isolated by RT-PCR. Sequencing analysis results showed that their ORF were both 1 680 bp in
length，which encoded 560 amino acids，and GenBank accession number are JQ394927 and JQ394928
respectively. Their nucleotide sequences shared 85.55% and 79.95% identity with AtVIN3 respectively，and
the deduced amino acid sequence showed homology to AtVIN3 with 80.72% and 72.96%. The expression
patterns of the BoVIN3 genes were investigated by semi-quantity RT-PCR，results showed that BoVIN3
gene could express induced by low temperature treatment，and expressed in the stem apex specifically，
transcript levels increased with increasing treatment time. The transcription reach the peak at 42 d of
vernalization. At the same time the expression of FLC was suppressed after BoVIN3 was induced by low
temperature treatment，results suggest that both genes maybe involved in the biological process of flowering

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regulation in vernalization. However both BoVIN3 could not be induced by GA3 and KT treatment. It
indicated that cabbage BoVIN3 was specific vernalization genes，whose transcripts could specially
response to vernalization.
Key words：cabbage；VIN3；vernalization；gene expression

开花是高等植物实现由营养生长向生殖生长转变的重要过程，在拟南芥开花调控网络中，
MADS-box 类的转录因子 FLOWERING LOCUS C（FLC）处于枢纽地位，是开花调控环节中的关键
基因（Michaels & Amasino，1999）。FLC 分别通过结合到 SOC1 启动子的 CArG 盒上和 FT 第一个
内含子部分区域（包含 CArG 盒结构）上来抑制它们的表达（Hepworth et al.，2002；Helliwell et al.，
2006），从而抑制花分生组织决定基因，进而延迟植物成花。长时间低温处理促进植物开花的过程称
为春化作用，春化作用主要是引起开花抑制基因 FLC 染色质结构的改变，以解除其对植物开花的抑
制效应（Bastow et al.，2004）。研究表明，春化作用可以诱导 VERNALIZATION INSENSITIVE 3（VIN3）
的表达，VIN3 与 VERNALIZATION 1（VRN1）和 VERNALIZATION 2（VRN2）一起形成复合体作用
于 FLC 染色质上的组蛋白，使其去乙酰化和甲基化，从而抑制 FLC 的表达（Bastow et al.，2004；
Sung & Amasino，2004；Kim et al.，2006）。
VIN3 编码一个 PHD-finger 蛋白，可以参与核小体组蛋白的甲基化去乙酰化等修饰，引起染色
质结构的重塑。VIN3 被诱导后，FLC 染色质组蛋白上的 H3K9 和 H3K27 发生二甲基化和三甲基化，
植株表现为早花（Bastow et al.，2004；Sung & Amasino，2004；Kim et al.，2006；Wang et al.，2007；
Schmitz & Amasino，2008）。在 vin3 突变体与野生型植株的研究中，野生型植株在 VIN3 表达后，
FLC 染色质组蛋白 H3K9、H3K14 发生了去乙酰化，而突变体中没有这一现象，所以认为 VIN3 也
是 FLC 染色质组蛋白 H3K9、H3K14 的去乙酰化所必需的（赵仲华 等，2006）。
Fu 等（2007）从小麦中克隆得到了 VIN3 的 3 个同源基因：TmVIL1、TmVIL2 和 TmVIL3，水稻
Oryza sativa 中也获得了 4 个 VEL 家族的基因：OsVIL1、OsVIL2、OsVIL3 和 OsVIL4，它们编码的
蛋白均具有 PHD 结构域保守的 C4HC3 的基序特性。拟南芥和禾本科植物中的 VIN3/VEL 家族蛋白
都具有保守的 PHD 结构域，这对认识 PHD-finger 蛋白功能及其在春化途径中的作用是至关重要的。
根据拟南芥及其芸薹属相关领域的研究报道，本试验中重点针对开花网络核心基因 FLC 及其春
化作用途径上游的关键基因 VIN3 进行研究，首次从十字花科芸薹属作物结球甘蓝中克隆了春化相
关基因 VIN3，通过生物软件对 VIN3 基因进行了序列分析，并通过 RT-PCR 方法检测在结球甘蓝中
的表达情况及其与春化作用的关系，为研究结球甘蓝绿体春化的分子机理提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
以结球甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）中熟品种‘光荣 1 号’为试验材料，于日光
温室播种育苗，幼苗长至 1 ~ 2 片真叶时分苗于 8 cm × 8 cm 营养钵中，苗期常规管理。根据前期进
行的结球甘蓝不同苗龄对低温感应试验的结果，在 13 片真叶茎粗小于（12.83 ± 0.14）mm 时植株不
能感受低温春化，所以选取 14 片真叶，茎粗大于（13.73 ± 0.17）mm 的大小均匀一致的幼苗放入光
照培养箱中进行绿体春化处理。低温春化处理条件为日均 8 ℃（昼 10 /℃夜 6 ℃），光照时间为 12 h，
光强 72 μmol · m-2 · s-1。春化处理过程中每 4 d 取茎尖及靠近茎尖的嫩叶 0.1 g，立即用液氮冰冻，然
后转移至–80 ℃冰箱中保存备用。
6 期 赵荣秋等：结球甘蓝春化相关基因 BoVIN3 的克隆及其表达分析 1101

1.2 RNA提取和反转录
参照刘生财（2009）的方法提取结球甘蓝茎尖总 RNA。以总 RNA 为模板，Oligo(dT)18 为引物，
按照 RevertaidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit dNTP（10 mmol · L-1）试剂盒（MBI 公司）
说明利用 M-MuLV 反转录酶进行反转录，获得 cDNA 第一链。
1.3 结球甘蓝 BoVIN3的 PCR扩增和测序
根据拟南芥 VIN3 基因的 mRNA 序列（NM-125121.3）的 ORF 编码区，采用 Primer 5.0 软件设
计引物。正向引物为：5′-ATGCAAGCTGCTTCGCTCTCAAAGATCT-3′，反向引物为：5′-TTAATGCCA
AAGCTTGAGGCAGAT-3′，委托上海生工合成。PCR 分离结球甘蓝 BoVIN3 的 ORF 编码区序列。
反应体系为：4 µL 模板，5 µL 10 × PCR Buffer，1 µL 10 mmol · L-1 的 dNTP，正反向引物各 1 µL，1
µL Kod plus 酶，加水至 50 µL。PCR 反应程序为 94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，
68 ℃延伸 2 min，35 个循环；72 10 min℃ ；4 10 min℃ 。PCR 扩增（1.0%琼脂糖凝胶电泳检测），目
的片段回收后连接在 pMD18T-Vector 上，转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，挑取阳性克隆委托上海
生工测序。序列分析采用DNAMAN等工具软件和NCBI上的BLAST（http：// blast. ncbi. nlm. nih. gov/
Blast. cgi）进行。
1.4 半定量 RT-PCR检测低温处理及不同激素处理下 BoVIN3的表达
应用 RT-PCR 技术对结球甘蓝 BoVIN3 基因的表达进行半定量分析。低温处理过程中每 4 d 取茎
尖及靠近茎尖的嫩叶、第 8 ~ 9 节位的真叶、及此节位的茎杆用于 RNA 提取。激素处理时选取 14
片真叶的幼苗常温条件下叶面喷施处理至叶片充分淋湿为止，为使溶液充分接触叶片，在溶液中加
入 1 ~ 2 滴‘吐温 20’。每 3 d 处理 1 次，共 3 次。具体处理方法如下：用 50、100 mg · L-1 的赤霉素
（GA3）和 20、80 mg · L-1 的激动素（KT）喷施处理。于处理当天和以后每 6 d 取茎尖及靠近茎尖
的嫩叶用于 RNA 提取。反转录，获得 cDNA 第一链（同 1.2），以其为模板，使用结球甘蓝 BoVIN3
基因的特异引物进行半定量 RT-PCR 反应，引物为 BoVIN3-1F：5′-CCACGCATTGTCTAACCAGC-3′，
BoVIN3-1R：5′-GCACACTCCAAATGACAAGAC-3′，BoVIN3-2F：5′-GAGTGTAAGTGAGAGGAGGG-
3′，BoVIN3-2R：5′-TTACGGTCAGGACGAGAGGT-3′；以结球甘蓝 Actin 基因为内标基因，ActinF：
5′-CTGGTTTCGCCGGTGATGATGC-3′，ActinR：5′-ATTTCCCGCTCGGCTGTGGTG-3′；反应体系为：
0.5 ~ 1 µL 模板、2.5 µL 10 × PCR Buffer、1.5 µL 25 mmol · L-1 的 MgＣl2、2.5 µL 2 mmol · L-1 的 dNTP、
正反向引物各 1 µL、0.1 µL rTaq 酶，加水至 25 µL。
1.5 半定量 RT-PCR检测低温处理下 FLC的表达
应用 RT-PCR 技术对结球甘蓝 FLC 基因的表达进行半定量分析。以 1.4 中结球甘蓝低温春化处
理取样后所提 RNA 反转录获得的相同的 cDNA 为模板，使用结甘蓝 FLC 基因的特异引物进行半定
量 RT-PCR 反应，反应体系和内标基因同 1.4。引物为 FLCF：5′-CGACAAGTCACCTTCTCCAAAC-3′；
FLCR：5′-CGGAAGATTGTCGGAGATTTGT-3′。
2 结果与分析
2.1 结球甘蓝春化基因 BoVIN3的克隆
根据 GenBank 上公布的拟南芥 VIN3 基因序列设计特异性引物，以低温春化处理 36 d 的结球甘
蓝茎尖总 RNA 为模板，反转录获得 cDNA 第一链进行 PCR 反应，扩增出相应的基因片段。扩增产
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物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，得到预期大小
的长为 1 700 bp 左右的目的条带（图 1）。
回收产物，经连接转化、测序，结果表明
从芸薹属植物结球甘蓝中克隆了两条 BoVIN3
基因，编码区全长各 1 680 bp，GenBank 登录
号分别为 JQ394927 和 JQ394928。
两条基因核酸序列比对相似性达 87.58%，
氨基酸序列比对相似性达 82.70%，命名为结球
甘蓝 BoVIN3-1 和 BoVIN3-2。
2.2 结球甘蓝春化基因 BoVIN3的序列分析
在 NCBI 上 BLAST 表明，所克隆的基因
与拟南芥或芸薹属植物的春化相关基因 VIN3 具有较高的同源性。BoVIN3-1 和 BoVIN3-2 与拟南芥
AtVIN3（accession number：NM_125121.3）在核酸水平上同源性分别达到 85.55%和 79.95%。其推
测的氨基酸序列与拟南芥 VIN3（Q9FIE3）的同源性分别达到 80.72%和 72.96%（图 2）；与芸薹属
红菜薹 VIN3（C4PFF9）分别达到 83.5%和 96.73%；与蔓田芥 VIN3（D6RRE9）分别达到 85.96%和

图 2 不同植物 VIN3氨基酸序列同源性比较
ⅰ：结球甘蓝 VIN3-1（JQ394927）；ⅱ：结球甘蓝 VIN3-2（JQ394928）；ⅲ：拟南芥（Q9FIE3）；ⅳ：红菜薹（C4PFF9）。
Fig. 2 Homology comparison of BoVIN3 cDNA in different plants
ⅰ：Brassica oleracea var. capitata VIN3-1（JQ394927）；ⅱ：Brassica oleracea var. capitata VIN3-2（JQ394928）；
ⅲ：Arabidopsis thaliana（Q9FIE3）；ⅳ：Brassica rapa var. purpuraria（C4PFF9）.
图 1 结球甘蓝 BoVIN3基因的 RT-PCR产物电泳图
M：DNA marker 5 000；1、2：目的基因。
Fig. 1 Electrophoresis of RT-PCR products of BoVIN3 in cabbage
M：DNA marker 5 000；1，2：Target genes.
6 期 赵荣秋等：结球甘蓝春化相关基因 BoVIN3 的克隆及其表达分析 1103

89.38%。结球甘蓝 BoVIN3 与其它植物 VIN3 类蛋白部分氨基酸序列系统发育分析表明，BoVIN3-1
与拟南芥 VIN3 具有最高的同源性，BoVIN3-2 与芸薹属植物红菜薹具有最高的同源性（图 3），与其
他的 VIN3 类蛋白同源性相对偏低（30% ~ 40%）。与拟南芥和小麦中 VIN3 类蛋白序列比较表明，本
试验中克隆的两条基因其氨基酸序列中包括 VIN3 的 PHD 区域（图 4）。

图 3 结球甘蓝 BoVIN3与其它植物 VIN3类蛋白氨基酸序列系统发育关系
Bo：结球甘蓝；Br：红菜薹；At：拟南芥；Ag：蔓田芥；PtPOP：毛果杨；Tm：小麦。
Fig. 3 Phyolgenetic relationships between Brassica oleracea var. capitata L. BoVIN3 and other VIN3 or VIN3-like proteins
Bo：Brassica oleracea var. capitata；Br：Brassica rapa var. purpuraria；At：Arabidopsis thaliana；
Ag：Arabis gemmifera；PtPOP：Populus trichocarpa；Tm：Triticum monococcum ssp. monococcum.



图 4 不同植物 VIN3类蛋白 PHD结构域氨基酸序列比对
Fig. 4 Alignment of PHD-finger domain among different plants VIN3 proteins

2.3 结球甘蓝春化基因 BoVIN3表达模式分析
通过半定量 RT-PCR 检测了 BoVIN3 在结球甘蓝各组织的表达及其与春化作用的关系，结果表
明，春化诱导结球甘蓝 BoVIN3 基因表达。如图 5 所示，BoVIN3-1，BoVIN3-2 只在有丝分裂活性区
域——茎尖生长点中表达，而在真叶和茎中均不表达；当春化处理 32 d 时，BoVIN3-1 和 BoVIN3-2
几乎没有表达，从 36 d 才开始出现转录，到 42 d 春化临界期时表达已经达到比较高的丰度，随后
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开始下降，BoVIN3-1，BoVIN3-2 具有相同的表达模式。用 50、100 mg · L-1 的赤霉素（GA3）和 20、
80 mg · L-1 的激动素（KT）喷施处理后，BoVIN3-1，BoVIN3-2 基因均不表达（图 6）。


图 5 低温处理下结球甘蓝 BoVIN3基因在茎尖生长点（A）、真叶（B）、和茎（C）中的表达
Fig. 5 Expression of Bo VIN3 in cabbage stem tip（A），leaf（B）and stem（C）under low temperature treatment

图 6 GA3处理（左）和 KT处理（右）下结球甘蓝 BoVIN3基因在茎尖生长点中的表达
Fig. 6 Expression of BoVIN3 in cabbage stem tip under GA3（left）and KT（right）treatment
a：50 mg · L-1 GA3；b：100 mg · L-1 GA3；c：20 mg · L-1 KT；d：80 mg · L-1 KT.

2.4 低温春化过程中结球甘蓝 FLC基因的表达分析
研究结球甘蓝低温春化处理过程中 FLC 基因的表达模式，RT-PCR 扩增结果显示其表达受春化
作用的抑制（图 7），春化过程中 FLC 基因持续表达，当低温处理 36 d 时表达量有所下降，随春化
处理时间延长表达量逐渐减少并在春化临界期时几乎检测不到。VIN3 受诱导表达后，FLC 的表达受
到抑制，且 VIN3 基因的表达水平与低温时间的长度和 FLC 的抑制程度成正比。说明植物在生长发
6 期 赵荣秋等：结球甘蓝春化相关基因 BoVIN3 的克隆及其表达分析 1105

育过程中确保 FLC 的高表达来避免植物在还未完全积累物质能量时过早开花。

图 7 低温处理下结球甘蓝 FLC基因的表达
Fig. 7 Expression of cabbage FLC under low temperature treatment
3 讨论
结球甘蓝属于绿体春化型植物，幼苗需长到一定大小方能感应低温通过春化，我们根据已报道
的种子春化型植物拟南芥春化相关基因 VIN3 设计引物，通过 RT-PCR 方法首次从结球甘蓝中克隆了
VIN3 春化相关基因，并对其表达特性进行初步研究。
序列分析表明，本试验中克隆的春化相关基因 BoVIN3-1 和 BoVIN3-2 与拟南芥或其它芸薹属植
物中相应基因具有很高的同源性。BoVIN3-1 和 BoVIN3-2 与 AtVIN3 属于同一基因，BoVIN3-1 和
BoVIN3-2 包括 PHD 关键区域。PHD 锌指结构域是 14 种已知的锌指结构域中的一种，存在于 400
多种真核生物蛋白质中，在进化过程中高度保守（Kaadige & Ayer，2006）。拟南芥和小麦 VIN3/VIL
类蛋白都含有 PHD 锌指蛋白 C4HC3（Cys4-His-Cys3）的锌结合基序（Fu et al.，2007）。此结构域
涉及多种功能，包括蛋白质的甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等，BoVIN3 很有可能通过此区域作
用于 FLC。
本研究中发现，长时间（大于 36 d）的低温春化处理会诱导结球甘蓝 BoVIN3 的表达，并使 FLC
表达量降低，到达春化临界期 42 d 时 BoVIN3 的表达量达到峰值，随后下降。在模式植物拟南芥中
很早以前就有过这种现象的相关报道（Sung & Amasino，2004），经过春化处理后，FLC 染色质组蛋
白 H3K9、H3K27 的二甲基化和三甲基化水平升高，植株表现为早花。该过程依赖于关键基因 VIN3，
VIN3 具有感受低温时程的特性。冬性一年生拟南芥只有经过足以产生春化效应的一段时期的低温处
理后，VIN3 才会被诱导表达，一般时间为 20 d（Sung & Amasino，2004）。如处理时间不够，VIN3
不会被诱导表达，也就不会产生下游的春化效应。当 VIN3 被诱导表达后，FLC 的表达随即被抑制，
因而 VIN3 的作用是在春化过程中识别低温处理的时间进而抑制对春化关键基因 FLC 的表达（赵仲
华 等，2006）。
春化作用是一个低温诱导体内特异基因表达的过程，RT-PCR 半定量分析表明，结球甘蓝中春
化相关基因 BoVIN3-1 和 BoVIN3-2 与拟南芥和其它芸薹属植物中的 VIN3 基因具有类似的表达模式
（李勇，2009）。BoVIN3 在没有春化处理之前没有表达，春化处理之后具有较高水平的表达，这说
明 BoVIN3 在低温冷处理条件才能被诱导。BoVIN3 编码含有 PHD 结构域的蛋白，该区域可以参与
FLC 染色质上组蛋白的甲基化和去乙酰化修饰，从而调控 FLC 的转录水平，使其表达处于较低状态
（Sung & Amasino，2004）。FLC 是 MADS-box 转录因子，FLC 是开花抑制基因，春化处理之后，
由于 FLC 被抑制，最终促进植物提前开花，而 FLC 对开花的抑制效应与其表达量的多少呈正相关
（Scortecci et al.，2003），低温处理之后，FLC 因为 VIN3 的诱导而被低温抑制，其表达量进一步降
低，且随低温处理时间的增加其表达量逐渐降低，直至最后检测不到，最终进一步促进甘蓝春化启
动。以上结果表明，在结球甘蓝中存在春化诱导基因 BoVIN3，参与对 FLC 的后生性抑制，并且使
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得这种抑制通过细胞有丝分裂得以维持（Sung & Amasino，2005；Sung et al.，2006）。
不同浓度 GA3 和 KT 处理下该基因均检测不到任何转录本，说明结球甘蓝 BoVIN3 基因的启动
子可能不包含激素响应元件，不受激素的诱导表达。GA3 是通过激活开花决定基因 LFY 的启动子，
加强 LFY 的转录活性，从而启动开花（Miguel et al.，1998）。很多基因只有在特定的器官、发育特
定时期或受特定环境因子的诱导时才表达，在长时间的低温条件下，结球甘蓝 BoVIN3 基因才能在
有丝分裂活性区域——茎尖生长点被诱导表达，说明结球甘蓝 BoVIN3 属于春化特异基因，只响应
低温诱导而转录。

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