全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（4）：762–766 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–11–01；修回日期：2013–03–18
基金项目：现代农业产业技术体系建设专项（CARS-26-13）；NSFC–河南人才培养联合基金项目（U1204319）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：guqsh@126.com；clearshu167@163.com）
瓜类褪绿黄化病毒 p22 基因在大肠杆菌中的表
达及抗血清的制备
施 艳 1，王振跃 1，袁 媛 1，刘珊珊 3，孙 虎 2,*，古勤生 3,*
（1 河南农业大学植物保护学院，郑州 450002；2 河南省农业科学院植物保护所，郑州 450002；3中国农业科学院郑
州果树所，郑州 450009）
摘 要：以被瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）侵染的甜瓜叶片为供试材
料，采用 RT-PCR 方法克隆其 P22 蛋白基因，并将其连接到原核表达载体 pGex-4T-3 上，PCR 验证及克隆
测序确定开放阅读框的正确性。将重组载体 pGexp22 转化大肠杆菌 BL21 菌株，诱导表达，SDS-PAGE 分
析表明，经 IPTG 诱导，p22 基因在大肠杆菌 BL21 中得到了高效表达。以表达的蛋白作为抗原，免疫家
兔，制备了 CCYV P22 的特异性抗血清。ACP-ELISA 检测结果表明，血清效价高达 1.28 × 105。Western blot
检测甜瓜叶片，结果表明抗血清能够特异性地检测 CCYV 侵染的甜瓜叶片中的 CCYV P22 蛋白。
关键词：甜瓜；瓜类褪绿黄化病毒；P22；原核表达；抗血清
中图分类号：S 652 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）04-0762-05

Expression of p22 Gene of Cucurbit chlorotic yellows virus in Escherichia
coli and Preparation of Antiserum
SHI Yan1，WANG Zhen-yue1，YUAN Yuan1，LIU Shan-shan3，SUN Hu2,*，and GU Qin-sheng3,*
（1College of Plant Protection，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；2Plant Protection Institute，
Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；3Zhengzhou Fruit Research Institute，Chinese
Academy of Agriculture Sciences，Zhengzhou 450009，China）
Abstract：p22 gene was amplified by RT-PCR from CCYV infected melon leaves and cloned into the
prokaryotic expression vector pGex-4T-3. After verification by PCR and sequencing，the recombinant
plasmid was transformed to Escherichia coli strain BL21 for protein expression. The SDS-PAGE analyses
showed that 48 kD specific fusion protein was highly expressed after induction by IPTG. The expressed
protein was purified from SDS-PAGE and the antiserum against the protein was raised in rabbit. The titer
of antiserum was 1.28 × 105 estimated by ACP-ELISA. Western blot analysis confirmed that the antiserum
reacted specifically with P22 protein of CCYV.
Key words：melon；Cucurbit chlorotic yellows virus；P22；prokaryotic expression；antiserum

瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV）是长线形病毒科（Closteroviridae）


4 期 施 艳等：瓜类褪绿黄化病毒 p22 基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备 763

毛形病毒属（Crinivirus）的一个新种，病毒粒体为长线形，基因组由两条正义单链 RNA 组成，RNA1
和 RNA2 基因组长度分别为 8 607 nt 和 8 041 nt。该病毒所致病害的典型症状为叶片褪绿黄化。CCVY
依靠烟粉虱（Bemisia tabaci）以半持久性方式进行传播（Gyoutoku et al.，2009）。
CCYV 最先由日本报道（Okuda et al.，2010），随后在中国台湾的甜瓜、黄瓜、西瓜等瓜类作物
上也发现了该病毒（Huang et al.，2010），并且经过分子生物学验证，明确为 CCYV 的不同分离物。
2008 年在中国上海地区的瓜类大棚里首次观察到系统褪绿黄化症状，2009 年 10 月底在上海、浙江
宁波和山东寿光开始大面积出现这种症状，病害发生率在 50% ~ 100%，危害严重，2011 年在河南
郑州温室大棚中也发现该症状大面积发生。通过实地采样室内检测分析发现中国发生的这类病害的
病原与日本报道的CCYV的序列同源性在 99.7% ~ 100%，确定该病害病原为CCYV（Gu et al.，2011）。
P22 蛋白是一个分子量为 22 kD 的由 CCYV RNA1 的 3′末端编码的的病毒蛋白。研究发现，甘
薯褪绿矮缩病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）的 RNA1 的 3′端编码的 P22 蛋白是作
为基因沉默抑制子发挥作用的（Kreuze et al.，2005），P22 能够抑制由双链 RNA 诱导的 RNA 沉默，
此外，P22 对沉默信号的胞间移动以及系统沉默也有较强的抑制作用（Kreuze et al.，2005，Cuellar et
al.，2009）。番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus，TCV）RNA1 编码的 P22 也是作为沉默抑制子发
挥作用，它能够抑制由正链 RNA 和双链 RNA 介导的接种叶的 RNA 沉默，却对沉默信号的系统移
动不发挥作用（Canizares et al.，2008）。CCYV 是一种新发现的病毒，各项研究都刚刚起步。本试
验中利用 RT-PCR 方法克隆 CCYV 河南分离物的 p22 基因序列，构建原核表达载体，并在大肠杆菌
中高效表达，进而制备特异性抗体，并建立血清学检测技术，为 CCYV 的检测以及 P22 蛋白的功能
研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料、菌株、质粒和试剂
2011 年秋季在河南农业大学科技园区试验田取田间发病的甜瓜叶片。大肠杆菌菌株 DH5、BL21
和原核表达载体 pGex-4T-3 由本实验室保存。
IPTG、氨苄青霉素（Amp）、丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸钠（SDS）、
甘氨酸等均购自上海生工生物工程有限公司。限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、反转录试剂盒购自
TaKaRa 公司。碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔 IgG 为 Sigma 产品。其他常用试剂为国产分析纯。
1.2 引物设计
根据 NCBI 已经发表的甜瓜 CCYV RNA1 基因序列（NC_018173），利用软件 Primer Premier 5.0
设计扩增全长基因的引物。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。引物序列为：正向引物 5′-G
ACGGATCCATGAATAATCGTAAATT-3′，反向引物 5′-CCTGTCGACTTATATTACGAACTTATTAAG-
3′。为了便于克隆，分别在 5′和 3′端引入酶切位点 BamHⅠ和 SalⅠ。
1.3 p22 基因原核表达载体的构建
根据 Trizol（Invitrogen）说明书提取感病叶片的总 RNA，利用 TaKaRa 公司的反转录试剂盒进
行反转录，PCR 扩增 p22 基因。PCR 反应体系为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，
35 个循环；72 ℃ 10 min。将获得的 PCR 产物通过 PCR 回收试剂盒回收纯化，经 BamHⅠ和 SalⅠ
双酶切，再与经同样酶处理的载体 pGex-4T-3 连接，转化大肠杆菌 DH5α，碱裂解法提取质粒，通
过 PCR 鉴定阳性克隆。
764 园 艺 学 报 40 卷
图 1 RT-PCR 扩增 p22 基因
M：DNA 分子标准 DL2000；1：PCR 产物。
Fig. 1 RT-PCR amplification of CCYV p22 gene
M：DNA marker DL2000；
1：PCR product.
1.4 P22 蛋白的诱导表达和 SDS-PAGE 分析
将含有重组原核表达载体的 BL21 于 37 ℃活化过夜，按 1︰100 稀释到 100 mL B 培养基中（含
氨苄青霉素 60 μg · mL-1），振荡培养至 OD600 ≈ 0.6，加入 IPTG 至终浓度为 1 mmol · L-1，继续诱导
过夜。培养基经 10 000 × g 离心 1 min。收集菌体，每 50 mL 菌液加入 5 mL ddH2O 和 1 mL 样品缓
冲液（40 mmol · L-1 Tris-HCl，pH 6.8、10%甘油、5%SDS、5%巯基乙醇、0.1%溴酚蓝），煮沸 10 min。
离心后取上清液，用 12%的胶进行 SDS-PAGE 分析。
1.5 抗血清制备及其效价测定
参照 Hager 和 Burgess（1980）的方法回收表达产物，经 12%的 SDS-PAGE 电泳后，将凝胶用
预冷的 0.25 mmol · L-1KCl，l mmol · L-1 DTT 溶液浸泡 5 min。用重蒸水冲洗，再置于预冷的重蒸水
中（含 1 mmol · L-1 DTT）l h。切下含目的条带的凝胶，按 l︰l 比例（mg · μL-1）加入 PBS 缓冲液（0.14
mol · L-1 NaCl、2.7 mmol · L-1 KCl、1.5 mmol · L-1 KH2PO4、8.1 mmol · L-1 Na2HPO4），于冰浴中研磨。
用 PBS 缓冲液适当稀释后，加入等体积的福氏不完全佐剂（1.5 g 羊毛脂 + 8 mL 石蜡油）进行乳化。
采用肌肉注射的方法免疫家兔，共免疫 5 次，免疫家兔的工作由郑州博赛生物技术公司协助完成。
以纯化的蛋白（2.5 μg · mL-1）作为抗原包被 ELISA 板，将抗血清进行一系列倍比稀释后作为
一抗，碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔 IgG 为二抗，参照吴兴泉等（2003）的方法用 ACP-ELISA 测定
抗血清的效价。
1.6 Western blot 检测
按照 Sambrook 和 Russell（2002）的方法，将 SDS-PAGE 电泳后的凝胶电转移至 PVDF 膜，P22
抗血清 1︰500 倍稀释作为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 1︰5 000 倍稀释作为二抗，按 HRP
底物显色试剂盒说明进行显色。
2 结果与分析
2.1 CCYV p22 基因原核表达载体的构建
以感病的甜瓜叶片的总 RNA 为模板，经反
转录和 PCR 扩增，得到一特异性片段，长度为
567 bp（图 1）。
将扩增出的特异性片段克隆到 pGEX-4T-3
载体，菌液 PCR 验证，将阳性克隆送去测序，
获得重组质粒 pGexP22，p22 基因有 567 个核苷
酸组成，共编码 188 个氨基酸残基。
2.2 表达产物的 SDS-PAGE 分析和蛋白纯化
将重组载体 pGexp22 转入大肠杆菌菌株
BL21 中，经 IPTG 诱导后，样品通过 SDS-PAGE
分离，可产生约 48 kD 的特异蛋白质条带（图
2），与预期的大小相符，未经诱导的菌株和空
载体则没有相应的条带，说明 CCYV p22 基因
得到了诱导表达，切胶回收蛋白，研磨纯化。
4 期 施 艳等：瓜类褪绿黄化病毒 p22 基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备 765

表 1 抗血请效价测定
Table 1 Determination of the titer of antiserum
血清稀释倍数（× 103）
Dilution of antiserum
OD405 值
OD405 value
检测结果
Detection result
1 1.661 +
2 1.548 +
4 1.216 +
8 0.670 +
16 0.445 +
32 0.281 +
64 0.137 +
128 0.064 +
256 0.035 –
512 0.038 –
阴性对照
Negative control
0.084 –
注：“+”阳性，“–”阴性。
Note：“+”positive，“–”negative.
图 2 SDS-PAGE分析P22融合蛋白的诱导表达
1：pGexp22 IPTG 诱导；2：pGexp22 未诱导；3：空载体 IPTG 诱导；4：空载体未诱导；M：蛋白分子量标准。
Fig. 2 SDS-PAGE analysis of expression products of pGexp22
1：pGexp22 induced by IPTG；2：pGexp22 without induction；3：pGex-4T-3 induced with IPTG；
4：pGex-4T-3 without induction；M：Protein marker.

2.3 抗血清制备及效价测定
利用回收的特异性表达的 48 kD 蛋白免疫家
兔，5 次免疫后 10 d 取血获得 CCYV P22 的抗血清。
以纯化的蛋白为抗原，进行 ACP-ELISA 检测，抗
血清稀释 1.28 × 105 倍后仍能明显检测出（表 1）。
2.4 Western blot 检测感病样品
通过分别提取健康和感病甜瓜叶片的总蛋白，
以制备的抗血清为一抗检测抗血清的特异性。结果
表明 P22 的抗血清在稀释 1 000 倍的条件下可以明
显地检测出感病样品，在膜上可以看到大小正确的
特异条带（图 3）。


图 3 Western blot 分析抗血清检测的特异性
M：蛋白分子量标准；1：健康叶；2：病叶。
Fig. 3 Detection specificity of the polyclonal antiserum of CCYV P22 by western blot
M：Protein pre-stained marker；1：Healthy leaf；2：Diseased melon leaf.
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3 讨论
CCYV 是 2010 年才正式报道命名的新病毒（Okuda et al.，2010），虽然基因组全序列已经阐明，
但是关于基因组的各个基因功能的研究才刚刚起步。在毛形病毒属两种病毒 SPCSV 和 TCV 中研究
发现 P22 蛋白是作为沉默抑制子发挥作用，但是在两者中的作用机制并不一致，获得 P22 蛋白的抗
血清为研究 P22 沉默抑制子的作用机制及其与寄主的互作提供了有力支持。已有报道表明通过细菌
原核表达可成功获得毛形病毒属南瓜黄色矮化失调病毒（Cucurbit yellow stunting disorder virus，
CYSDV）和 CCYV CP 的抗血清（Livieratos et al.，1999；Hourani & Abou-Jawdah，2003；Cotillon et
al.，2005； Kubota et al.，2011）。本研究中通过在大肠杆菌中高效表达 CCYV P22，以表达产物作
为抗原，大量制备抗血清，为感病植物和带毒介体的检测奠定了基础。
本研究中通过原核表达制备 CCYV P22 的抗血清能够特异性地检测出感病甜瓜中的 CCYV，表
明制备的抗血清适用于下一步的检测和功能研究，Western blot 结果发现该抗血清检测病毒的灵敏度
略低于本实验室制备的 CCYV CP 的抗血清，这与预期的相符，这可能是由于 CP 作为病毒粒子的主
要组分，在植物体内的积累量要高于 P22 蛋白的表达量，因此目前生产上检测病毒样品大多是通过
制备外壳蛋白的抗血清来检测病毒。

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