全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（10）：1983–1990 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–04–28；修回日期：2012–09–29
基金项目：公益性行业（农业）科研专项（200903020，200903009）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：ymfang@cau.edu.cn）
唐菖蒲脂氧合酶基因GhLOX1对球茎膨大的影响
连青龙 1,2，辛海波 2,3，李晓昕 2，钟雄辉 2，尹义蕾 1，义鸣放 2,*
（1 农业部规划设计研究院设施农业研究所，北京 100125；2 中国农业大学观赏园艺与园林系，北京 100193；3中国
科学院植物分子生理学重点实验室，北京 100093）
摘 要：以唐菖蒲（Gladiolus hybridus）品种‘Rose Supreme’的球茎为试材，应用 Real time RT-PCR
技术，分析唐菖蒲球茎在不同浓度的茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MJ）0.1、0.2、0.5 mmol · L-1 和水杨
酸异羟肟酸（salicylhydroxamic acid，SHAM）0.5、0.75、1.0 mmol · L-1处理后脂氧合酶（LOX）基因的
的表达水平，并且对 LOX 活性、内源 MJ 含量以及球茎鲜样质量与体积进行测定。分析结果表明，GhLOX1
表达水平、脂氧合酶活性、内源 MJ 含量以及球茎的鲜样质量与体积均随着 MJ 浓度的增加而逐渐提高。
与此相反，经过不同浓度的 LOX 抑制剂 SHAM 处理后，以上各项指标随着 SHAM 浓度的增加而逐渐降
低。同时，构建 35S-GhLOX1 过表达载体，利用根癌农杆菌介导法将 GhLOX1 导入马铃薯栽培品种‘中
薯 3 号’的试管薯薄片中，转基因马铃薯植株块茎的数量、体积和鲜样质量分别得到了不同程度的提高。
关键词：唐菖蒲；脂氧合酶；茉莉酸甲酯；水杨酸异羟肟酸；球茎膨大
中图分类号：S 682.2+4 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2012）10-1983-08

Effects of GhLOX1 Gene on the Corm Enlargement in Gladiolus hybridus
LIAN Qing-long1,2，XIN Hai-bo2,3，LI Xiao-xin2，ZHONG Xiong-Hui2，YIN Yi-lei1，and YI Ming-fang2,*
（1Institute of Facility Agriculture，Chinese Academy of Agricultural Engineering，Beijing 100125，China；2Department of
Ornamental Horticulture and Landscape Architecture，China Agricultural University，Beijing 100193，China；3Key
Laboratory of Plant Molecular Physiology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100093，China）
Abstract：The expression level of GhLOX1 gene was analyzed in the corm of Gladiolus hybridus
‘Rose Supreme’by Real time RT-PCR，which were treated by different concentration of MJ（0.1，0.2，
0.5 mmol · L-1）and SHAM（0.5，0.75，1.0 mmol · L-1）respectively. In addition，LOX activity，
endogenesis MJ content，fresh weight and size of corms were also assayed. Analysis results showed that
the expression level of GhLOX1 gene，LOX activity and endogenous MJ content，fresh weight and size of
corms increased steadily with a MJ gradient from 0.1 mmol · L-1 to 0.5 mmol · L-1. Conversely，these
indexes steadily decreased with the increasing concentration of SHAM. At the same time，35S-GhLOX1
over expression vector was constructed，and GhLOX1 gene was transformed into the microtuber slices of
potato cultivar‘Zhongshu 3’by Agrobacterium tumefaciens-mediated method. The results showed that the
number，size and fresh weight of transgenic potato tubers had been increased to varying degrees.
Key words：Gladiolus hybridus；lipoxygenase；methyl jasmonate；salicylhydroxamic acid；corm
enlargement

1984 园 艺 学 报 39 卷

脂氧合酶（LOX）作为茉莉酸（JA）生物合成途径中的关键酶，在茉莉酸类化合物（JAs）生
物合成途径中起着重要作用，故可通过调控 LOX 活性来控制 JAs 的生物合成，从而调节植物的许
多生理过程（Feussner et al.，2001，张波 等，2007）。JAs 对植物生长过程中的许多进程有调节作
用，主要包括调节植物生长发育进程与植物防御系统两大方面。JAs 还调整了与植物发育及植物防
御相关基因的表达（汪开拓 等，2012），这些基因功能的深入分析将详尽地揭示植物中 JAs 的作用。
JAs 对离体马铃薯、薯蓣、菊芋的块茎形成和甘薯的块根以及大蒜、洋葱的鳞茎形成具有显著
的促进效应（甘立军 等，2001）。而 LOX 作为 JAs 生物合成的关键酶，可能同样参与植物地下变
态器官的形成过程（Fujino et al.，1995；Feussner et al.，2001）。LOX 在植物体中主要以 LOX1、LOX2
和LOX3等3种同工酶的类型存在，其中LOX1在块茎和根中特异性表达（Royo et al.，1996；Kolomiets
et al.，2001）。在马铃薯中，POTLX-1 是具有块茎专一性表达的 LOX 基因，其编码产物具有 9-LOX
的活性，而转反义基因的马铃薯植株，其块茎的体积和质量都发生了明显的下降，形状也发生了畸
形的变化（Feussner et al.，2001）。
在唐菖蒲中，编码 9-LOX 活性的 GhLOX1 的全长序列被克隆，经 Real time RT-PCR 表达分析
显示，该基因在籽球、新球茎以及匍匐茎等地下变态器官中有较高的表达水平（Lian et al.，2011；
连青龙 等，2011）。经过半定量 RT-PCR 表达分析显示，经过不同浓度的 MJ 处理后显著提高了唐
菖蒲组培球茎的 LOX1 基因的表达水平、LOX 活性、内源 MJ 含量以及球茎的鲜样质量和体积。而
经过 LOX 抑制剂水杨苷异羟肟酸（salicylhydroxamic acid，SHAM）处理后，其结球时间明显推迟，
结球率、球茎鲜样质量和直径等指标明显下调，并且 LOX1 基因的表达水平、LOX 活性和内源 MJ
含量也显著降低。由此推测，唐菖蒲球茎的膨大极有可能是通过调控 GhLOX1 的表达水平促进了唐
菖蒲茉莉酸及其化合物的合成来完成的（He et al.，2008；何秀丽 等，2008a，2008b）。
本研究中利用 Real time RT-PCR 技术，进一步分析了 GhLOX1 在唐菖蒲试管球茎中的表达模式，
并测定了不同浓度的 MJ 和 SHAM 处理后试管球茎的 LOX 活性、内源 MJ 含量以及球茎鲜样质量和
体积的变化，分析了 GhLOX1 表达与 LOX 活性、内源 MJ 含量以及球茎大小的关系。此外，由于唐
菖蒲的遗传转化体系尚不成熟，本研究中通过异源表达的方法，在马铃薯中过量表达唐菖蒲
GhLOX1，分析其对马铃薯块茎膨大的作用。通过测定转基因马铃薯块茎的质量和体积来验证 LOX1
基因对唐菖蒲球茎膨大的促进作用，旨在为该基因调控唐菖蒲茉莉酸及其化合物的生物合成，进而
探讨 LOX1 在唐菖蒲球茎形成过程中的生理功能提供依据，并为进一步深入研究 LOX1 的功能及其
调控机制提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
唐菖蒲（Gladiolus hybridus）栽培品种‘超级玫瑰’（‘Rose Supreme’）在 2008 年 4 月初种植
于中国农业大学科学园，种球购自辽宁省金城园艺试验场，周径为 10 ~ 12 cm。组培球茎是以 2008
年 11 月大田收获的籽球为外植体培养而成，收获的籽球在 4 ℃冰箱中贮存备用。马铃薯栽培品种‘中
薯 3 号’由中国农业科学院蔬菜花卉研究所赠送。遗传转化所用的过表达载体质粒是改造后的
PCAMBIA1301，使用的是 CaMV 35S 启动子。
1.2 唐菖蒲试管球茎的诱导以及不同植物生长调节剂的处理
籽球外植体处理：用 70%的乙醇消毒 1 min，无菌蒸馏水冲洗 3 次，然后用 3%的 Ca(ClO)2 消毒
10 期 连青龙等：唐菖蒲脂氧合酶基因 GhLOX1 对球茎膨大的影响 1985

15 min，最后，无菌水冲洗 5 次。试管球茎诱导参考何秀丽等（2008b）的方法，初代培养基为：
MS + 6.0 mg · L-1 6-BA + 40 g · L-1 蔗糖。在初代培养基中每瓶接 2 个籽球，在恒温组培室中培养 28 d
后在 MS 继代培养基上进行壮苗培养。培养 28 d 后挑选长势比较一致的继代苗进行结球诱导。基本
培养基均为 MS + 60 g · L-1 蔗糖。在培养基中分别加入 0.1、0.2 和 0.5 mmol · L-1 的 MJ 与 0.5、0.75
和 1.0 mmol · L-1 的 SHAM（水杨苷异羟肟酸）。MJ（茉莉酸甲酯）采用过滤灭菌法添加到培养基
中，SHAM 直接加入到培养基中然后再灭菌。以基本培养基 MS 为对照。GhLOX1 的表达分析共 7
个处理，每处理 3 次重复，每重复 9 瓶。培养基 pH 5.8，培养温度（25 ± 2）℃，光照强度 3 000 lx，
光照时间 12 h · d-1。
1.3 Real time RT-PCR 表达分析
唐菖蒲新球茎 RNA 的分离采用 MyLab 通用型 RNA 快速提取试剂盒，利用紫外分光光度计测
定其总 RNA 浓度，取 400 ng 的总 RNA，运用 SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（TaKaRa）试剂盒进
行 cDNA的反转录反应。将反转录的 cDNA模板稀释10倍，进行Real time RT-PCR反应，分析GhLOX1
的表达模式，反应在 ABI 7500 实时定量 PCR 仪上进行，方法参照《美国应用生物系统公司 7300/7500
实时定量 PCR 仪相对定量实验入门指南》和荧光定量试剂盒 SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit
（TaKaRa）说明书。
Real time RT-PCR 扩增的反应体系为：cDNA 模板 2 µL，2 × SYBR Premix Ex TaqTM 10 µL，特
异引物（10 µmol · L-1）0.4 µL，50 × ROX Reference DyeⅡ 0.4 µL，用水补足 20 µL。采用两步法标
准程序：95 30 s℃ ，95 5 s℃ ，60 34 s℃ ，共 45 个循环。内参 ACTIN 引物（ACTIN1，ACTIN2）
和 GhLOX1 特异引物（GSP1，GSP2）的设计采用在线软件 Primer 3（http：//frodo.wi.mit.edu/ primer3/），
引物序列见表 1。每个试验设置 4 次重复，利用 ABI7 500PCR 仪 Sequence Detection software 软件
（2-ΔΔCT 法）进行数据分析（Livak & Schmittgen，2001）。

表 1 引物序列
Table 1 Primers sequence
引物名称
Primer name
序列
Sequence
片段/ bp
Fragment
ACTIN1 TCGAGGTTGCTGTTGGGTACT 219
ACTIN2 AACAAAACATGCGACCAAGC
GSP1 GGAAAGGGCATCCCCAATAG 181
GSP2 GGCATGGAACGCTCTACCAC
GSP3 AATCCCGGGGGTAAAATGGGAGAGGGAGATGT 2 500
GSP4 CGCGTCGACGACCAGGGCTTTAGTTTAGATGG

1.4 LOX 活性的测定
参照 Nishiba 等（1995）的方法测定 LOX 活性。称取 0.5 g 唐菖蒲试管球茎样品，加入 0.1 mol · L-1
PBS（pH 7.0）2 mL 提取缓冲液（内含 1 mmol · L-1 乙二胺四乙酸钠，0.5%吐温–20，2.5%甘油和
0.03 g 聚乙烯吡咯烷酮）。以亚油酸为底物，以 0.2 mol · L-1 硼酸（pH 9.0）为缓冲液，测定 234 nm
处 5 min 内的光吸收变化。以增加 0.001 作为 1 个酶活力单位，Δ234 · min-1 · g-1FW 表示。
1.5 MJ 含量及球茎体积与鲜样质量的测定
采用间接 ELISA 法（何钟佩，1993）测定经过不同浓度 MJ 和 SHAM 处理后的试管球茎内源
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MJ 含量。MJ 含量的测定。样品中激素提取在本实验室进行，将待测样品放入预冷的研钵中，每 1 g
待测样品加入 4 ℃预冷的 80%甲醇提取液（含 22 mg BHT/100 mL 80%甲醇）3 ~ 4 mL、少量石英砂
和 0.1 g PVP，冰浴条件下研磨，充分转移出匀浆，4 ℃浸提过夜，离心（4 ℃，10 000 r · min-1，10
min）后，取上清液，在中国农业大学农学与生物技术学院化控室测定 MJ 含量。
用游标卡尺和电子天平测量球茎的直径和鲜样质量。
1.6 马铃薯的遗传转化
对含有目的基因 GhLOX1 的 pMD18-T 重组质粒和植物过表达载体 PCAMBIA1301 质粒分别采
用限制性内切酶 SmaⅠ和 SalⅠ进行双酶切，将回收纯化后的目的片段在 T4 连接酶作用下 16 ℃连
接过夜，连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞。提取含有目的基因 GhLOX1 的 PCAMBIA1301
重组质粒，经双酶切并测序验证后转化农杆菌。参考蒋敏华等（2007）和华婧（2008）的方法，将
含有腋芽（叶片）的 1.0 cm 左右的组培马铃薯茎段接种到 MS 培养基上，每个三角瓶接种 3 个外植
体。将生长 28 d 左右的试管苗转接在 MS + 3%蔗糖的液体培养基上进行培养，预培养 21 d 后倒出
三角瓶中的液体培养基，加入 50 mL 的液体培养基（MS + 5 mg · L-1 6-BA + 8%蔗糖），置于暗处
（20 ± 2）℃的条件下进行诱导培养。42 d 后进行试管薯切片农杆菌的浸染。
取暗培养诱导 42 d 左右的马铃薯栽培品种‘中薯 3 号’的试管薯，除去薯皮与芽眼，切成 1 ~ 3
mm 的薄片，接在培养基（MS + 2.0 mg · L-1 ZT + 1.0 mg · L-1 IAA + 0.1 mg · L-1 GA）上进行预培养，
预培养 2 d 后放入 OD600 约为 0.6 的含农杆菌的 MS 液体培养基中，轻摇 5 min。然后用灭菌的清水
洗 3 次，每次 3 min。最后将处理过的马铃薯薄片在滤纸上吸干多余的液体，将其接在共培养培养
基（MS + 2.0 mg · L-1 ZT + 1.0 mg · L-1 IAA + 0.1 mg · L-1 GA + 30 mg · L-1 AS）上。22 ℃黑暗培养 3 d，
将其转入含 35 mg · L-1 Hyg 和 250 mg · L-1 Cef 的培养基（MS + 2.0 mg · L-1 ZT + 1.0 mg · L-1 IAA + 0.1
mg · L-1 GA + 35 mg · L-1 Hyg + 250 mg · L-1 Cef）上培养 14 d，然后转入含 35 mg · L-1 Hyg 的选择培
养基（MS + 2.0 mg · L-1 ZT + 1.0 mg · L-1 IAA + 0.1 mg · L-1 GA + 35 mg · L-1 Hyg）上，每 2 周换 1 次
培养基。待试管薯薄片上的芽长到 1 ~ 2 cm 时，将芽转到生根培养基上（MS + 35 mg · L-1 Hyg）进
行生根培养，28 d 左右打开三角瓶进行炼苗 7 d 左右移栽到盆中，70 d 左右进行转基因马铃薯的下
游试验分析。
1.7 转基因植株的 PCR 检测
利用 CTAB 快速微量提取 DNA 法提取马铃薯叶片的 DNA，分别用 GSP3 和 GSP4 为上下游引
物（表 1）进行 PCR 检测，以 PMD18T-LOX 质粒为阳性对照，未转基因马铃薯 DNA 为阴性对照进
行 PCR 扩增，反应条件为：95 5 min℃ ； 95 45 s℃ ，60 45℃ s，72 3 min℃ ，30 循环；72 10 min℃ 。
利用琼脂糖电泳检测其产物，回收产物并测序。
2 结果与分析
2.1 MJ 和 SHAM 对唐菖蒲球茎中 GhLOX1 表达和 LOX 活性的影响
图 1 显示，在 MJ 0.1 ~ 0.5 mmol · L-1 浓度的唐菖蒲球茎中 GhLOX1 的表达量在 0.1 与 0.2
mmol · L-1 时比对照高，但差异并不明显，而在 0.5 mmol · L-1 时达对照表达量的 3.3 倍。而在 SHAM
0.5 ~ 1.0 mmol · L-1 MJ 范围内 GhLOX1 表达水平随着浓度的升高而降低。LOX 活性和 GhLOX1 的表
达水平呈显著正相关，其活性在 0.1 ~ 0.5 mmol · L-1 MJ 处理的浓度范围内随着浓度的升高而升高，
而在 0.5 ~ 1.0 mmol · L-1 SHAM 处理的浓度范围内随着浓度的升高而降低。
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图 1 MJ 和 SHAM 对唐菖蒲球茎中 GhLOX1 相对表达量以及 LOX 活性的影响
﹡：MJ/SHAM 处理样品与对照呈现显著性差异（P > 0.05）。
Fig. 1 Effect of MJ and SHAM on GhLOX1 gene transcript and the LOX activity in Gladiolus corm
The asterisks indicate significant differences（P < 0.05）between MJ/SHAM treatments and the control.

2.2 MJ 和 SHAM 对唐菖蒲球茎内源 MJ 含量以及球茎膨大的影响
图 2 显示，在 0.2 和 0.5 mmol · L-1 MJ 处理时唐菖蒲球茎的内源 MJ 含量、球茎直径和鲜样质
量显著增加（P > 0.05），在 0.5 mmol · L-1 的 MJ 处理时分别比对照提高了 39.6%、19.1%和 33.3%。
而在 0.75 和 1.0 mmol · L-1 SHAM 处理时球茎的内源 MJ 含量，直径和鲜样质量与对照相比显著
降低（P > 0.05），在 1.0 mmol · L-1 的 SHAM 处理时分别比对照降低了 50.5%、40.9%和 51.9%。
图 2 MJ 和 SHAM 对唐菖蒲球茎内生 MJ 含量以及球茎膨大的影响
﹡：MJ/SHAM 处理样品与对照呈现显著差异（P > 0.05）。
Fig. 2 Effects of MJ and SHAM on the endogenous MJ content in Gladiolus hybridus corms（bar graph）and the size of corms
The asterisks indicate significant differences（P < 0.05）between MJ/SHAM treatments and the control.

2.3 GhLOX1 在马铃薯中的过量表达分析
经农杆菌浸染的马铃薯薄片移入诱导芽的培养基进行培养，经过 28 d 长出 1 ~ 2 cm 的幼芽（图
3，A）。将幼芽转入生根培养基，诱导根的生长（图 3，B）。待诱导出根的马铃薯幼苗株高 6 ~ 8 cm
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图 4 过表达 GhLOX1 马铃薯 RT-PCR 检测
M：Marker；+. 阳性对照；–. 阴性对照；1 ~ 10. 转基因株系。
Fig. 4 Detection of overexpression GhLOX1 potato by RT-PCR
M：Marker；+. Positive control；–. Negative control；1–10.
Transgenic line.
后打开培养瓶盖进行炼苗，14 d 后移入盆中进行栽培（图 3，C），最后提取马铃薯叶片 DNA 进行
转基因 PCR 检测。



图 3 马铃薯的遗传转化
A. 芽的诱导；B. 根的诱导；C. 转基因株系。
Fig. 3 Transformation of potato
A. Induction of buds；B. Induction of roots；C. Transgenic line.

PCR 扩增并经琼脂糖电泳检测，以
PMD18T-LOX 质粒为模板的阳性对照扩增到
了 2 500 bp 左右的 GhLOX1 目的片段，以未转
基因的野生型马铃薯 DNA 为模板的阴性对照
没有扩增出条带，而在 3#、7#和 9#转基因植株
中检测到了 GhLOX1 目的片段（图 4），初步鉴
定这 3 个株系中成功转入 GhLOX1。
将 3 个转基因马铃薯植株转移至光照培养
箱培养，以未转基因植株为对照，培养 70 d 后
发现，3#、7#和 9#转基因株系与野生型植株相
比均出现了矮化的现象（图 5），3 个转基因株
系的块茎总数量和质量分别为 26 个和 35.9 g，比野生型块茎总数量（20 个）和质量（27.1 g）分别















图 5 过表达 GhLOX1 促进了马铃薯块茎的形成
Fig. 5 Overexpression of GhLOX1 contribute to the formation of potato tuber
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提高了 6 个和 8.8 g。3 个转基因株系的平均块茎数量和质量分别为 8.7 个和 1.4 g，比野生型块茎平
均数量（6.6 个）和质量（1.3 g）分别提高了 2.1 个和 0.1 g。并且，转基因单株块茎数最多的达到
了 10 个，单株块茎质量最多的也达到了 14.6 g，块茎数量和质量都得到了一定程度的提高，但块茎
的平均质量的增加幅度并不明显。

3 讨论
作为 LOX 促进剂的 MJ 和抑制剂的 SHAM，都显著影响了唐菖蒲脂氧合酶基因 GhLOX1 的表
达、LOX 活性以及内源 MJ 含量，MJ 促进了 GhLOX1 的表达、LOX 活性和内源 MJ 含量的升高，
而 SHAM 起到了相反的作用。MJ 和 SHAM 有可能是通过影响 GhLOX1 的表达干预了 LOX 的活性，
从而影响了 JAs 或 JA 类似化合物的生物合成，并且最终影响了唐菖蒲球茎的膨大。在马铃薯中，
SHAM 的处理显著降低了 LOX 活性和 JA 的含量，并且抑制了马铃薯块茎的形成，降低了块茎的数
量和体积（马崇坚 等，2003）。
Wasternack（2006）研究发现，编码 JA 生物合成的全部相关酶的基因都受 JA 的诱导，并且经
JA 处理后提高了相关酶的活性（Kubigsteltig et al.，1999）。此外，JAs 还参与了马铃薯、薯蓣、菊
芋的块茎，甘薯的块根以及洋葱、大蒜的鳞茎形成（甘立军 等，2001）。而本研究证明，JAs 可能
参与了唐菖蒲球茎的形成和膨大，但该观点还需要进一步运用基因工程手段来验证。
通过农杆菌介导的侵染马铃薯块茎薄片的方法获得了 3 个转 GhLOX1 株系，对转基因株系的分
析结果表明，转基因株系的株形发生了矮化，块茎的数量、体积和质量总体上发生了不同程度的提
高，但块茎平均质量的提高幅度与平均数量相对较小。在马铃薯中曾有报道，LOX 参与了马铃薯块
茎的生长。POTLX-1 具有 9-LOX 活性，POTLX-1 在马铃薯块茎和根中表达，POTLX-1 mRNR 出现
在块茎的末梢最活跃的生长部分，并且表达反义 POTLX-1 的转基因马铃薯的 LOX 活性降低，形成
的块茎小而呈现畸形变化，产量降低（Kolomiets et al.，2001）。本研究中，在马铃薯中过表达 GhLOX1，
分别提高了马铃薯块茎的体积和质量，与先前报道的结果趋于一致。因此，在块茎的形成过程中，
LOX 可能启动调节细胞生长的氧化油脂的合成，控制块茎的生长和发育。综上所述，GhLOX1 促进
了马铃薯块茎的形成，进而推测，GhLOX1 可能对唐菖蒲球茎的形成具有促进作用，但需要通过唐
菖蒲基因工程的手段来证实。

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