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单方绿豆粉干预哮喘小鼠肺组织中白三烯C_4和5-脂氧合酶及其激活蛋白的变化效应



全 文 :!广东医学院呼吸疾病研究所,广东省湛江市 #$%%!;广东医学院,#药
理教研室,&病理教研室,广东省湛江市 #$%#&
通讯作者’姚卫民!,男,!()& 年生,广东省吴川市人,汉族,#%%& 年广东
医学院毕业,硕士,主治医师,主要从事支气管哮喘防治的研究。
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广东医学院青年基金资助项目3#%%#4!%567
中图分类号:89& 文献标识码:: 文章编号:!9)!4(#93#%%6#)4%!%94%&
收稿日期’#%%4%&4! 修回日期’#%%4%4!5 3!! ; <=>? ; @A6
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;&<姚卫民,梁标,刘钰瑜,姜汉国 7单方绿豆粉干预哮喘小鼠肺组织中白三烯 FG 和
HR脂氧合酶激活蛋白的变化效应T2U7中国临床康复,1JJH,LM1NOP*JQRS
T???7V-D:E97:#(U
摘要
目的:探讨压热解毒单方绿豆粉对哮喘肺小鼠组织中白三烯及 4脂氧
合酶、4脂氧合酶激活蛋白含量的影响。
方法:实验于 #%%#4!% ; #%%&4%$ 在广东医学院呼吸疾病研究所完成。&#
只清洁级雄性昆明种纯白小鼠,随机分为 $ 组:生理盐水对照组、卵蛋
白哮喘模型组、地塞米松治疗组、绿豆粉治疗组,每组 5 只。参照文献_!‘
建立小鼠卵蛋白哮喘模型。除对照组小鼠予生理盐水处理外,其余各组
小鼠于第 !B)B!$ 天给予鸡卵白蛋白抗原液 %/ 1A(含氢氧化铝凝胶
# 1N 和鸡卵白蛋白 ! !N)腹腔注射,第 #! 天始用 !f鸡卵白蛋白雾化
吸入来激发小鼠哮喘发作,# 次 ; L,每次 ! .,连续 & L。每次雾化前
&% 1F2,生理盐水对照组和卵蛋白哮喘模型组给予生理盐水 !% 1A ; \N,
地塞米松治疗组给予地塞米松 # 1N ; \N,绿豆粉治疗组给予绿豆粉液
!% 1A ; \N,灌胃。肺组织匀浆中白三烯 b$、白三烯 Q$含量检测应用
gAC>:方法;各组肺组织中 4脂氧合酶、4脂氧合酶激活蛋白的表达应
用免疫组化方法检测。
结果:实验所用 &# 只小鼠均进入结果分析。小鼠肺组织中白三烯 b$
比较:生理盐水对照组明显低于卵蛋白哮喘模型组 _(%/!!c%/%,
%/#(&c%/%5)1N ; A,3! d %/%!6‘。#小鼠肺组织中白三烯 Q$ 比较:绿豆
粉治疗组明显低于哮喘模型组_(#/%(!c%/#)&,#/$5#c%/#)5)1N ; A,(!
d %/%!)‘。$小鼠肺组织中 4脂氧合酶的活性比较:免疫组化法检测结
果显示绿豆粉组明显低于哮喘模型组_(!#/&c$/(B#/%c9/9),(! d %/%!)‘。%
小鼠肺组织中 4脂氧合酶、4脂氧合酶激活蛋白的表达:绿豆粉治疗
组、地塞米松治疗组与生理盐水对照组比较无显著性变化(! e %/%)。
结论:白三烯 b$、白三烯 Q$在肺组织中的高水平,4脂氧合酶、4脂氧
合酶激活蛋白表达的增加在鸡卵白蛋白致敏小鼠的哮喘发病中起重要
作用。单方绿豆可显著降低哮喘小鼠肺组织中白三烯 Q$含量,抑制哮
喘小鼠肺组织中 4脂氧合酶、4脂氧合酶激活蛋白的表达,从而表现出
抗哮喘的活性。
主题词:哮喘;白三烯 Q$;4脂氧合酶;小鼠
K 引言
绿豆,又名青小豆,为豆科草本植物绿豆的成熟种
子。自《开宝本草》记载:“绿豆,主丹毒烦热,消肿下气,压
热解毒”以后,历代本草对绿豆的药用功效多有阐发。白
三烯由储存于细胞膜磷脂中的花生四烯酸经 4脂氧合
酶途径并在 4脂氧合酶激活蛋白参与下生成的一类代
谢产物,是哮喘发病过程中重要的炎症介质。本文旨在
探讨单方绿豆对哮喘小鼠肺组织白三烯水平及 4脂
氧合酶、4脂氧合酶激活蛋白表达的影响,为进一步
探讨绿豆的有效成分,防治哮喘提供理论依据。
L 材料和方法
设计:随机对照实验。
单位:广东医学院呼吸疾病研究所。
材料:实验于 #%%#4!% ; #%%&4%$ 在广东医学院呼
吸疾病研究所完成。&# 只清洁级雄性昆明种纯白小
鼠,体质量(#%c&)N,购自广东医学院实验动物中心
(实验动物质量检测合格证:#%%#:%!$),普通环境饲
养。随机分为以下 $组,每组 5只:生理盐水对照组、卵
单方绿豆粉干预哮喘小鼠肺组织中白三烯 !和 #$脂氧合酶及其
激活蛋白的变化效应 7!
姚卫民 !,梁 标 !,刘钰瑜 #,姜汉国 &
·中医康复研究·
中国临床康复 第 (卷 第 #)期 #%%O%)O#!出版
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单方绿豆粉干预哮喘小鼠肺组织中白三烯 !和 #$脂氧合酶及其
激活蛋白的变化效应
姚卫民,等!##$ %&’%()*+& ,$ +%(%-’. / 0!!!#$%&’(&)* ’(+,,-./-,01234&)*
蛋白哮喘模型组、地塞米松治疗组、绿豆粉治疗组。
主要试剂和仪器:1级绿豆,产地黑龙江龙江县;
兔抗鼠 23 )(脂氧合酶、)(脂氧合酶激活蛋白多克隆
抗体由加拿大 45! 6789: ;<,=>?@5 A;@5>8 ,@DE
8@5 FC5 G9@57H@=8I< 0@>@75<9J KCID8@ ,L7I5@E4C5M7LJ
N=OP@生物技术有限公司;浓缩型 41S 试剂盒,福州迈新生
物技术有限公司;白三烯 S-、白三烯 ,-、TU#1 试剂
盒,1V@5>97VEK975V7团新郑股份有限公司 (批号 .+.%W.+);鸡卵白蛋白,
#I2V7 公司;氢氧化铝粉(分析纯,广州化学试剂厂)。
X#,E1 多功能超声雾化器,辽宁省鞍山市电子医疗仪
器厂;+#YWE% 型内切式组织匀浆器,浙西机械厂;
ZU[;K\# 照相显微镜,日本 ZU[;K\# 公司;TU]Y..
酶标仪,美国 SICE07Q公司。
设计、实施、评估者:实验设计为第一、二作者,实
施为第一、三、四作者,其中第三、四作者并不了解动
物的分组及给药情况,负责观察免疫组化结果;实验
评估为第一、三、四作者,均受过科学实验相关培训。
干预措施:药品配制:绿豆研磨成粉末状,予生理
盐水配成 %. 2 / U的绿豆粉悬液;取鸡卵白蛋白 %!) V2
和氢氧化铝粉 +.. V2,以无菌生理盐水稀释至 ). VU,
反复震荡混匀成鸡卵白蛋白抗原液。
小鼠哮喘动物模型的建立及给药:小鼠哮喘动物
模型的建立参照文献^%_。除对照组小鼠予生理盐水处
理外,其余各组小鼠于第 %、’、%- 天给予鸡卵白蛋白
抗原液 .!) VU (含氢氧化铝凝胶 + V2 和鸡卵白蛋白
%) !2)腹腔注射,第 +% 天始用 %‘鸡卵白蛋白雾化吸
入来激发小鼠哮喘发作,+次 / Q,每次 % 9,连续 W Q。每
次雾化前 W. VID,生理盐水对照组和卵蛋白哮喘模型
组给予生理盐水 %. VU / ?2 灌胃,地塞米松治疗组给
予地塞米松 + V2 / ?2灌胃,绿豆粉治疗组给予绿豆粉
液 %. VU / ?2灌胃。
标本的处理:所有小鼠均于最后一次激发后 %+ 9,
眼眶动脉放血麻醉下处死。放血后称取肺组织 %.. V2,
加入磷酸盐缓冲液 %!) VU,内切式组织匀浆机匀
浆,% ).. 5 / VID 离心 %. VID,上清液采用 TU#1 方
法检测肺组织匀浆中白三烯 S-、白三烯 ,-的含量,严
格按照说明书要求操作执行,根据标准曲线求得所测
样品浓度。左肺下叶放入 - a, -. VU / U的多聚甲醛磷
酸盐缓冲液溶液中固定 %& 9,常规石蜡切片后行苏木
精(伊红染色及免疫组化。
)(脂氧合酶、)(脂氧合酶激活蛋白的免疫组化检
测:采用 #EK法进行染色,每一批免疫组化均设有用磷
酸盐缓冲液代替(抗的阴性对照。采用盲法进行免疫
组化评估,观察切片至少 ) 个具有代表性高倍视野,
不少于 % ...个细胞,对免疫组化结果进行评估。结果
的判断采用记分法,根据每张切片的阳性细胞比例及
着色深浅记分^+_。阳性细胞比例 % / W以下为 %分,% / Wb
+ / W为 +分,+ / W以上为 W分;细胞无着色为 .分,浅黄
色为 %分,黄色为 +分,黄褐色为 W分。根据二者乘积
判断阳性等级:. 分为阴性“(”,%bW 分为弱阳性“c”,
-b&为阳性“!”,大于 &分为强阳性“”。
主要观察指标:各组小鼠肺组织匀浆中白三烯
S-、白三烯 ,-水平。#肺组织中 )(脂氧合酶、)(脂氧
合酶激活蛋白的免疫组化检测结果。
统计学分析:数据统计学处理由第一作者采用
#K## %%!.软件完成。肺组织匀浆中白三烯 S-、白三烯
,-的含量用 561 表示,最小有意义差法AU#4R单因素方
差分析。免疫组化结果为等级资料,用 “(b”表示,
行非参数的序变换,再用 561 表示,进行方差分析。
! 结果
+!% 描述性统计
+!%!% 实验动物数量分析 纳入小鼠 W+ 只均进入结
果分析,无脱失。
+!%!+ 肺组织中 )(脂氧合酶、)(脂氧合酶激活蛋白的
免疫组化检测 卵蛋白哮喘模型组、地塞米松治疗
组、绿豆粉治疗组小鼠肺组织苏木精(伊红染色示支
气管及血管周围大量炎症细胞浸润,气道粘膜水肿
粘液分泌增加,上皮细胞可见脱落,符合哮喘模型的
基本病理特征。)(脂氧合酶、)(脂氧合酶激活蛋白阳
性表达定位于肺内炎症细胞、肺泡上皮细胞、内皮细
胞、纤毛柱状上皮细胞细胞质,均是浅黄色至黄褐
色。见图 %J+JW。
+!+ 统计推断
+!+!% 各组肺组织匀浆中白三烯 S-和白三烯 ,-的变
化 见表 %。
与生理盐水对照组比较,77 d .!.),P7 d .!.%;与卵蛋白哮喘模型组比较,<7 d .!.%
各组小鼠肺组织匀浆中白三烯 S-及白三烯 ,-水
平的总体均数有差异(8e-!-+),7 d .!.) 及 8e)!.Y-,
7 d .!.%)。两两比较显示:与生理盐水对照组相比,卵
蛋白哮喘模型组、地塞米松治疗组、绿豆粉治疗组小鼠
白三烯 S-含量显著升高,但这 W 组之间两两比较,差
异无统计学意义;哮喘组小鼠白三烯 ,-含量较生理盐
水对照组亦明显升高(7 d .!.%);绿豆粉治疗组、地塞
米松治疗组白三烯 !含量较生理盐水对照组无显著
变化;绿豆粉、地塞米松均可降低哮喘小鼠肺组织中白
三烯 ,-含量,两者作用相当。
+!+!+ )(脂氧合酶、)(脂氧合酶激活蛋白在小鼠肺组
织中的表达免疫组化结果 见表 +。
表 % 各组肺组织匀浆中白三烯 S-和白三烯 ,-的变化 (5f1,V2 / U)
组别 3 白三烯 S- 白三烯 ,-
生理盐水对照组
卵蛋白哮喘模型组
地塞米松治疗组
绿豆粉治疗组
Y
Y
Y
Y
.!%)%f.!.))
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.!+W+f.!%%*7
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%!*&-f.!W-&
+!-Y+f.!+’YP
%!*%*f.!W*)<
+!.%*f.!+’W<
%&’
!!# $%脂氧合酶、$%脂氧合酶激活蛋白在小鼠肺组
织中的表达免疫组化结果的序变换结果 见表 #。
与生理盐水对照组比较,&! ’ (();与卵蛋白哮喘模型组比较,*! ’ (()
各组小鼠肺组织 $%脂氧合酶、$%脂氧合酶激活蛋
白的表达水平经序变换后总体均数有差异(+,)(!,!
’ (()及 +)#-.,! ’ (())。两两比较显示:与生理
盐水对照组相比,哮喘组的 $%脂氧合酶、$%脂氧合酶
激活蛋白表达明显增加 (! ’ (());绿豆粉治疗组、
地塞米松治疗组小鼠较生理盐水对照组小鼠肺组织
中 $%脂氧合酶、$%脂氧合酶激活蛋白的表达无显著
变化(! / (($);绿豆粉、地塞米松均可抑制哮喘小
鼠肺组织中 $%脂氧合酶、$%脂氧合酶激活蛋白的表
达,两者作用相当。
! 讨论
有研究证明白三烯受体拮抗剂可改善哮喘患者
的生存质量,抑制哮喘的气道炎症0#1。白三烯是哮喘发
病过程中重要的炎症介质,研究表明,其主要在以下
几个方面促进哮喘的发生:!促进炎症细胞在气道的
聚集。白三烯 23是引起气道变应性炎症的主要介质,
是目前已知最强的中性粒细胞催化因子和活化因子
之一031。白三烯可促进树突状细胞抗原递呈功能的活
化0$1。引起气道平滑肌收缩、粘液分泌增加及血管通
透性增加。白三烯 43引起气道平滑肌收缩的能力比组
织胺约强 ) (((倍。#促进气道重塑,引起气道高反应
性。气道重塑是诱发气道高反应性和哮喘慢性化的主
要原因。白三烯可提高气道对组胺、乙酰胆碱、冷空
气、运动、阿司匹林等刺激的反应性。理论上如能降低
$%脂氧合酶、$%脂氧合酶激活蛋白的表达,抑制白三
烯的生成,即可减轻气道炎症,从而防治哮喘。
绿豆在中国已有两千多年的栽培史,有“食中佳
品,济世长谷”之称。《本草纲目》云:“绿豆,消肿治痘之
功虽同于赤豆,而压热解毒之力过之。且益气、厚肠胃、
通经脉,无久服枯人之忌。外科治痈疽,有内托护心散,
极言其效。”并可“解金石、砒霜、草木一切诸毒”。现在药
理研究表明,绿豆具有抗菌抑菌、降血脂、抗肿瘤、解毒
等多种药效。5&670,1等从绿豆的种子中提取了一种新的
溶菌酶,具有抗真菌和细菌的活性。绿豆含丰富的抗氧
化物质及 $%胡萝卜素。古方紫金丹的组方仅为绿豆和
信砒而治疗哮喘疗效显著,除了砷剂可减轻哮喘的气道
炎症0-1及绿豆富含巯基化合物0-1,可减少砒石对体内巯基
的结合,减轻砒石的毒性081的配伍机理外,是否单方绿豆
亦可在某些方面减轻哮喘的气道炎症?本课题组的研究
证实绿豆和砒石的组方可抑制哮喘小鼠肺组织中 $%脂
氧合酶、$%脂氧合酶激活蛋白基因的表达,降低肺泡灌
洗液中白三烯 23、白三烯 43的含量0.9)(1。那么单方绿豆是
否对白三烯的代谢径路也有一定的作用?
本实验的结果显示哮喘小鼠肺组织匀浆中白三烯
23、白三烯 43 的含量增高,提示白三烯 23、白三烯 43
在哮喘的发病中起一定的作用。单方绿豆可抑制哮喘
小鼠肺组织中白三烯 43 的生成,抑制 $%脂氧合酶、
$%脂氧合酶激活蛋白的蛋白在肺组织中的表达,其疗
效和地塞米松相当。$%脂氧合酶、$%脂氧合酶激活蛋
白表达的减少可以在白三烯代谢径路的上游减少白三
烯 43的生成。但绿豆并不能抑制哮喘小鼠肺组织中白
三烯 23的生成,和绿豆可抑制其 $%脂氧合酶、$%脂氧
合酶激活蛋白在肺组织中的表达的免疫组化结果有点
矛盾,其原因可能为白三烯 23的生成过程中,还存在
白三烯 :3水解酶水解等综合因素的作用,故仅仅抑制
哮喘小鼠 $%脂氧合酶、$%脂氧合酶激活蛋白的蛋白表
达,并不能抑制白三烯 23的生成。
本实验为进一步探讨单方绿豆的有效成分防治哮
喘提供了理论依据。但其临床疗效到底有多大,需要进
一步探讨。并且绿豆含多种蛋白质、脂肪、糖、微量元素
等多种组分,到底是哪一种或哪几种成分对哮喘小鼠的
白三烯代谢径路在起作用仍然未明。如何结合绿豆的化
学成分分析,对绿豆这一方面的药理作用进行更加深入
探讨,研制开发出新的防治哮喘的药物,仍需进行大量
的工作。
;图 )<# 见封三=
参考文献
表 ! $%脂氧合酶、$%脂氧合酶激活蛋白在小鼠肺组织中的表达免疫组化结果
组别 # $%脂氧合酶 $%脂氧合酶激活蛋白> ! > !
生理盐水对照组
卵蛋白哮喘模型组
地塞米松治疗组
绿豆粉治疗组
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表 # $%脂氧合酶、$%脂氧合酶激活蛋白在小鼠肺组织中的表达免疫组化结果
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组别 # $%脂氧合酶 $%脂氧合酶激活蛋白
生理盐水对照组
卵蛋白哮喘模型组
地塞米松治疗组
绿豆粉治疗组
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刘春丽9 梁标支气管哮喘小鼠胞浆型和 @ 型磷脂酶 :! 表达的研究0A1 中
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桂律9 许祖德9 罗金芳9 等 膀胱尿路上皮癌 CCDE! 表达及其与 F:G、H$#、
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邓星奇,周亚刚,钱湘绮 白三烯受体拮抗剂对哮喘患者生存质量和气道炎
症的作用0A1中国临床康复,!((!,,()-)B!$!8
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周林福9 殷凯生 小剂量三氧化二砷对哮喘豚鼠气道嗜酸细胞凋亡和核因
子 %2表达作用的相关性0A1 中华结核和呼吸杂志9 !((!9 !$;-=B3#.
王连方9 刘惠君 富巯基食物对摄砷小白鼠保护效应0A1 微量元素与健康研
究9!(((9)-;#=B#%$
姚卫民9 梁标9 刘钰瑜 砒石对哮喘小鼠白三烯 23及 $%脂氧合酶基因表达
的影响0A1 中国临床药理学与治疗学9!((39 .;!=B).#%,
姚卫民9 梁标9 刘钰瑜 砒石对哮喘小鼠 $%脂氧合酶激活蛋白基因表达及
白三烯 43的影响0A1 中国呼吸与危重监护杂志9 !((39#;)=B!!%$
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