全 文 ：２０１３年１１月 四川大学学报（自然科学版） Ｎｏｖ．２０１３
第５０卷　第６期 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏｌ．５０　Ｎｏ．６
收稿日期：２０１２－１２－０９
基金项目：国家自然科学基金（９１０１７００４，３１１７０２５２，３１０７０２３８）
作者简介：孙炎锋（１９８１－），男，河南新密人，博士研究生，主要研究方向为植物生理与分子生物学．
通讯作者：林宏辉．Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｏｎｇｈｕｉｌｉｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
ｄｏｉ：１０３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０４９０－６７５６．２０１３．０６．０３９
１３－脂氧合酶在拟南芥叶片衰老中的作用分析
孙炎锋１，２，吕 东２，王 丽２，苗 琛２，林宏辉１
（１．四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都６１００６４；
２．河南大学生命科学学院棉花生物学国家重点实验室，开封４７５００４）
摘　要：促进叶片衰老是植物激素茉莉酸（ＪＡ）的一个重要生物学功能．在植物体内，ＪＡ最初
经１３－脂氧合酶（Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ＬＯＸ）的作用而形成．ＲＴ－ＰＣＲ发现，在发生衰老的叶片中，
ＬＯＸ３、ＬＯＸ４、ＬＯＸ６基因转录发生明显上调，而ＬＯＸ２在叶片衰老后期明显下调．构建了拟
南芥９－ＬＯＸ活性缺失突变体ｌｏｘ１／ｌｏｘ５，利用该材料以亚麻酸为底物测定了拟南芥叶片发育
不同阶段１３－ＬＯＸ的活性，发现：与幼嫩叶片相比，衰老叶片中 ＬＯＸ活性明显增强．推测
ＬＯＸ３、ＬＯＸ４、ＬＯＸ６基因在叶片自然衰老中ＪＡ的合成中具有重要作用，而ＬＯＸ２基因在衰
老后期作用减弱．
关键词：衰老；脂氧合酶；茉莉酸；拟南芥
中图分类号：Ｑ９４５　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：０４９０－６７５６（２０１３）０６－１３９１－０６
Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　１３－Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｌｅａｆ　ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ
ＳＵＮ　Ｙａｎ－Ｆｅｎｇ１，２，ＬＶ　Ｄｏｎｇ２，ＷＡＮＧ　Ｌｉ２，ＭＩＡＯ　Ｃｈｅｎ２，ＬＩＮ　Ｈｏｎｇ－Ｈｕｉ１
（１．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｃｏ－Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，
Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００６４，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｃｏｔｔｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｅｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋａｉｆｅｎｇ　４７５００４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｅａｆ　ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｓ　ｏｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｈｙｔｏｈｏｒｍｏｎｅ　Ｊａｓ－
ｍｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＪＡ）．Ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ，ＪＡ　ｉｓ　ｉｎｉｔｉａｌｙ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　１３－ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ
（ＬＯＸ）．Ｆｏｕｒ　ｇｅｎｅｓ　ａｒｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｔｏ　ｅｎｃｏｄｅ　１３－ＬＯＸ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｇｅｎｏｍｅ，ｈｏｗｅｖｅｒ，ｌｉｔｔｌｅ　ｉｓ　ｋｎｏｗｎ　ａ－
ｂｏｕｔ　ｔｈｅｉｒ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ＪＡ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｌｅａｆ　ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｂｙ　ＲＴ－ＰＣＲ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ
ＬＯＸ３，ＬＯＸ４　ａｎｄ　ＬＯＸ６　ｇｅｎｅｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｉｎ　ｓｅｎｅｓｃｉｎｇ　ｌｅａｖｅｓ，ｗｈｉｌｅ　ｔｈｅ　ｅｘ－
ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＬＯＸ２ｇｅｎｅｓ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｌａｔｅ　ｓｔａｇｅ　ｏｆ　ｌｅａｆ　ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｄｒａｍａｔｉｃａｌｙ．Ｔｈｅ　９－ＬＯＸ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｄｅｆｉ－
ｃｉｅｎｔ　ｍｕｔａｎｔ　ｌｏｘ１／ｌｏｘ５　ｗａｓ　ａｃｑｕｉｒｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　１３－ＬＯＸ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｉｎ　ｌｅａｖｅｓ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｓｔａ－
ｇｅｓ　ｗｅｒｅ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ　ａｃｉｄ　ａｓ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ．Ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｓｅｎｅｓｃｉｎｇ　ｌｅａｖｅｓ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉ－
ｃａｎｔｌｙ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｙｏｕｎｇ　ｌｅａｖｅｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ＬＯＸ３，ＬＯＸ４，ＬＯＸ６
ｍｉｇｈｔ　ｐｌａｙ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅｓ　ｉｎ　ＪＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｌｅａｆ　ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ　ｏｆ　ＬＯＸ２ｍｉｇｈｔ　ｂｅ
ｉｍｐａｉｒｅｄ　ａｔ　ｔｈｅ　ｌａｔｅ　ｓｔａｇｅ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｐｒｏｃｅｓｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ，ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ＪＡ，Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５０卷
１　引　言
植物激素茉莉酸（Ｊａｓｍｏｎａｔｅ　ａｃｉｄ，ＪＡ）及茉莉
酸类物质具有广泛的生物学功能，促进衰老是其最
早被发现的功能之一［１，２］．研究发现：培养基中添
加３０μＭ 的ＪＡ可以显著促进野生型拟南芥叶片
衰老的发生，并诱导衰老相关基因如ＳＡＧ１２等的
表达，而对ＪＡ不敏感突变体ｃｏｉ１则没有这种效
果［３］．Ｋｏｎｇ等在水稻中鉴定到一个新的锌指蛋
白，该蛋白是ＪＡ信号通路中的一个负调节因子，
它的缺失显著推迟了植株衰老的起始［４］．总之，
诸多证据表明：ＪＡ在植物叶片衰老中具有重要调
节作用．
脂氧合酶（Ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ，ＬＯＸ，ＥＣ　１．１３．
１１．１２）是一类广泛存在于动、植物中的脂肪酸双加
氧酶，催化含有顺，顺－１，４－戊二烯结构的多元不饱
和脂肪酸加氧反应［５－７］．在植物中，根据加氧反应
发生在脂肪酸Ｃ原子的位置，可分为１３－ＬＯＸ和９－
ＬＯＸ ［８］．ＪＡ最初由亚麻酸在１３－ＬＯＸ的催化下形
成氢过氧化脂肪酸，之后在一系列酶的作用下而形
成［９］．
模式植物拟南芥基因组中推测共六个基因编
码ＬＯＸ蛋白，依次命名为ＬＯＸ１－６，最近生化分析
试验证实：ＬＯＸ１、ＬＯＸ５ 属于９－ＬＯＸ，ＬＯＸ２、３、
４、６属于１３－ＬＯＸ［１０，１１］．在底物识别方面，１３－ＬＯＸ
选择性地氧化亚麻酸，而９－ＬＯＸ对亚麻酸、亚油酸
则无选择性［１０］．越来越多的研究发现，ＬＯＸ在植
物生长发育等诸多过程中都具有重要作用．如：
ＬＯＸ３、ＬＯＸ４参与了拟南芥中ＪＡ调节的雄性育
性，而ＬＯＸ２、ＬＯＸ６则与此无关［１２］．Ｃｈａｕｖｉｎ等结
合遗传学、化学等方法分析发现：１３－ＬＯＸ的４个
成员对机械伤害诱导的拟南芥叶片ＪＡ快速合成
均有贡献，并且ＬＯＸ６在植物远端应答伤害信号
中具有独特作用［１３］．最近的研究还发现：拟南芥
ＬＯＸ６根部合成的脂氧素在植株应答生物胁迫和
非生物胁迫中具有重要作用［１４］．同时，９－ＬＯＸ的
生物学功能也被不断发现．如：有研究发现９－ＬＯＸ
参与了拟南芥侧根发育及防御反应［１５］，来自拟南
芥根部ＬＯＸ５合成的脂氧素则可以促进蚜虫在叶
片的出现［１６］，而在保卫细胞有较强表达的ＬＯＸ１
在不依赖 ＡＢＡ的调节气孔运动和免疫反应的脂
氧素途径中具有重要作用［１７］．
在衰老的叶片中ＪＡ含量增高了４倍［３］，为了
研究植物叶片衰老过程中参与ＪＡ合成的ＬＯＸ，我
们通过检测发生衰老叶片中与ＪＡ 合成相关１３－
ＬＯＸ基因的表达、叶片发育不同阶段ＬＯＸ酶活
性，初步分析了可能参与拟南芥叶片衰老过程中
ＪＡ合成的ＬＯＸ，为进一步分析ＪＡ调控的植物衰
老过程打下了基础．
２　材料与方法
２．１　实验材料
拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）Ｃｏｌ－０生态型
和突变体ｌｏｘ１－３（ＳＡＬＫ＿０１２１８８）、ｌｏｘ５－３（ＳＡＬＫ＿
０５０９３３）购自拟南芥种质资源中心（ＡＢＲＣ）．人工
气候室条件：温度２０～２２℃，光暗周期１６ｈ／８ｈ．
２．２　实验方法
２．２．１　拟南芥ＬＯＸ家族基因进化树分析及蛋白
质序列比对　把ＬＯＸ蛋白质序列以ＦＡＳＴＡ格式
输入ＣＬＵＳＴＡＬ　Ｘ　２．１［１８］，进行多序列比对，结果
保存为“ｐｈｙ”格式的文件以用做下面的分析或者
用Ｂｉｏｅｄｉｔ软件进行处理．使用系统发育分析软件
ｐｈｙｌｉｐ　３．６中的ＳＥＱＢＯＯＴ程序生成自举（ｂｏｏｔ－
ｓｔｒａｐ）值１００的数据集，然后使用 Ｍａｘｉｍｕｍ　Ｌｉｋｅ－
ｌｉｈｏｏｄ（ＭＬ）方法构建出进化树，最后通过 Ｔｒｅｅ－
Ｖｉｅｗ软件查看结果．
２．２．２　ＬＯＸ酶活性测定　参照Ａｘｅｌｒｏｄ等［１９］和
Ｂａｕｅｌｏ等［２０］的方法，稍作修改．取不同时期拟南
芥叶片各０．３ｇ，液氮研磨，将粉末加入提取缓冲液
（０．２Ｍ 磷酸缓冲液和０．９９ｍＭ　ＥＤＴＡ以１∶２混
合而成）中．１４０００ｇ，４℃离心２０ｍｉｎ，收集上清储
存于－８０ ℃．５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ　７．４，１０．２
ｍＭ亚麻酸母液及粗酶提取液组成３ｍＬ反应体
系．室温（２５℃）反应，用分光光度计读取２３４ｎｍ
处吸光值．
２．２．３　ＲＮＡ提取和半定量ＲＴ－ＰＣＲ检测　取不
同时期材料，提取总ＲＮＡ［２１］．ｃＤＮＡ合成采用Ｉｎ－
ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ公司反转录体系合成ｃＤＮＡ第一条链．
稀释后进行 ＲＴ－ＰＣＲ反应引物序列见表１．Ａｃ－
ｔｉｎ２：９４℃预变性５ｍｉｎ，一个循环；９４℃变性３０
ｓ，５６℃ 退火４０ｓ，７２℃ 延伸４０ｓ，２５个循环．
ＬＯＸ２基因：９４℃预变性５ｍｉｎ，一个循环；９４℃
变性３０ｓ，５６℃ 退火４０ｓ，７２℃ 延伸４０ｓ，２７个
循环．ＬＯＸ３和ＬＯＸ４：９４℃预变性５ｍｉｎ，一个循
环；９４℃变性４０ｓ，５６℃ 退火３０ｓ，７２℃ 延伸４０
ｓ，３１个循环．ＬＯＸ６：９４℃预变性５ｍｉｎ，一个循
环；９４℃变性４０ｓ，５６℃ 退火４０ｓ，７２℃ 延伸４０
ｓ，２９个循环．
２９３１
第６期 　　 孙炎锋，等：１３－脂氧合酶在拟南芥叶片衰老中的作用分析 　
２．２．４　ｌｏｘ１／ｌｏｘ５ 双突变体的构建和鉴定　以
ｌｏｘ１－３、ｌｏｘ５－３纯合缺失突变体［２２］为亲本作杂交，
所得种子自交一代，提取Ｆ２代植株ＤＮＡ，以基因
特异 引 物 （从 网 站ｈｔｔｐ：／／ｓｉｇｎａｌ．ｓａｌｋ．ｅｄｕ／ｔｄ－
ｎａｐｒｉｍｅｒｓ．２．ｈｔｍｌ获得）和 Ｔ－ＤＮＡ 特异引物
ＬＢａ１进行ＰＣＲ反应，鉴定获得纯合缺失双突变
体．
表１　引物序列
Ｔａｂ．１　Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
基因名称 登录号 上游引物 下游引物
ＬＯＸ１　 ＡＴ１Ｇ５５０２０ ＣＴＧＡＧＣＴＴＧＣＣＴＣＡＴＣＣＴＡＡＴＧＧＡＧ　 ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＣＡＡＧＡＴＴＴＧＣ
ＬＯＸ２　 ＡＴ３Ｇ４５１４０ ＡＣＧＣＣＡＧＧＣＴＡＴＧＡＴＧＣＴＡＣＧ　 ＴＧＴＴＣＣＧＣＡＣＴＴＣＡＣＴＣＣＡＣＣ
ＬＯＸ３　 ＡＴ１Ｇ１７４２０ ＣＴＡＴＧＴＡＴＧＴＧＣＣＡＣＧＡＧＡＣＧ　 ＡＡＣＧＣＴＴＧＴＴＧＴＡＣＧＧＡＧＡＡＴ
ＬＯＸ４　 ＡＴ１Ｇ７２５２０ ＴＴＣＣＴＴＡＣＣＣＴＡＧＡＣＧＣＴＧＴＣ　 ＡＧＡＣＣＴＧＧＴＣＣＧＴＡＧＡＴＴＴＣＡ
ＬＯＸ５　 ＡＴ３Ｇ２２４００ ＣＴＴＡＴＴＡＣＡＡＣＧＡＣＴＴＧＧＧＴＧＣ　 ＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＡＴＡＣＴＴＣＡ
ＬＯＸ６　 ＡＴ１Ｇ６７５６０ ＡＧＡＡＧＴＣＡＡＣＣＡＴＧＣＣＴＡＣＣＴ　 ＡＴＡＡＣＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＴＣＡＴＡＴ
Ａｃｔｉｎ２　 ＡＴ３Ｇ１８７８０ ＴＴＣＣＴＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＣＣＧＴＣＴＴ　 ＣＡＧＣＧＡＴＡＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＴＡＧＴＧＧ
３　结果与分析
３．１　拟南芥脂氧合酶家族基因进化树分析
从图１可以看出：ＬＯＸ１、ＬＯＸ５明显与其它四
个成员相分开，这与基于催化位点特异性而划分的
９－ＬＯＸ和１３－ＬＯＸ相一致．在其他四个成员中，
ＬＯＸ２与其它三 个 成 员 遗 传 距 离 较 远，并 且
ＬＯＸ３、ＬＯＸ４同源性最高．蛋白质序列比对（图２）
结果也表明：ＬＯＸ１、ＬＯＸ５与家族其他成员之间氨
基酸一致度（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）明显较低，而二者之间的一
致度则较高．
图１　拟南芥脂氧合酶基因家族进化树分析
Ｆｉｇ．１　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ　ｇｅｎｅ
ｆａｍｉｌｙ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ
３．２　不同发育时期叶片中１３－ＬＯＸ 基因表达检测
利用ＲＴ－ＰＣＲ检测了１３－ＬＯＸ各基因的表达，
结果如图３所示．可以看出：ＬＯＸ３、ＬＯＸ４、ＬＯＸ６
基因在衰老叶片中转录明显增强，尤其是ＬＯＸ６．
ＬＯＸ２基因在刚发生衰老叶片中的表达水平与之
前两个时期相当，但到衰老的后期，其在叶片中的
表达被显著下调．
图３　ＲＴ－ＰＣＲ检测１３－ＬＯＸ基因在不同发育时
期叶片中的转录表达水平
幼嫩叶片（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ　ｌｅａｆ，ＥＬ）；完全展开又没发生衰老
的叶片（ｎｏｎ－ｓｅｎｅｓｃｉｎｇ　ｌｅａｆ，ＮＳ），约１／４发生黄化，处于
衰老早期的叶片（ｅａｒｌｙ　ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ，ＥＳ）；超过１／２叶片
黄化，处于衰老后期的叶片（ｌａｔｅ　ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ，ＬＳ）
Ｆｉｇ．３　ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　１３－ＬＯＸ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ
ｌｅａｖｅｓ　ａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｓｔａｇｅｓ
３９３１
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５０卷
图２　拟南芥ＬＯＸ家族蛋白质序列比对
Ｆｉｇ．２　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
３．３　ｌｏｘ１／ｌｏｘ５双突变体的构建和鉴定
为了进一步检测与ＪＡ合成相关的１３－ＬＯＸ活
性，构建了９－ＬＯＸ活性缺失突变体ｌｏｘ１／ｌｏｘ５．从
图３可以看出：用ＬＯＸ１、ＬＯＸ５　Ｔ－ＤＮＡ插入缺失
纯合突变体ｌｏｘ１－３、ｌｏｘ５－３作杂交，鉴定获得了纯
合双突变体，ＲＴ－ＰＣＲ检测发现：双突变体中两基
因的转录被完全干扰．
４９３１
第６期 　　 孙炎锋，等：１３－脂氧合酶在拟南芥叶片衰老中的作用分析 　
图４　ｌｏｘ１／ｌｏｘ５双突变体的鉴定
Ａ：ｌｏｘ１－３、ｌｏｘ５－３Ｔ－ＤＮＡ插入位置示意图；Ｂ：ＲＴ－ＰＣＲ检测野
生型（ＷＴ）和ｌｏｘ１－３／ｌｏｘ５－３双突变体中ＬＯＸ１、ＬＯＸ５表达
Ｆｉｇ．４　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｏｕｂｌｅ　ｍｕｔａｎｔ　ｌｏｘ１／ｌｏｘ５　ｂｙ
ＲＴ－ＰＣＲ
（Ａ）Ｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔ－ＤＮＡ　ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｓｉｔｅｓ　ｉｎ　ｌｏｘ１－３　ａｎｄ　ｌｏｘ５－３．
（Ｂ）ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＬＯＸ１　ａｎｄ　ＬＯＸ５　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ
ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ（ＷＴ）ａｎｄ　ｌｏｘ１－３／ｌｏｘ５－３　ｍｕｔａｎｔ．
３．４　不同发育时期拟南芥叶片１３－ＬＯＸ活性检测
利用获得的９－ＬＯＸ活性缺失突变体ｌｏｘ１－３／
ｌｏｘ５－３，以亚麻酸为底物，检测了如图３所示四个
时期叶片中１３－ＬＯＸ酶活性，结果如图５所示．可
以看出：发生衰老的叶片中１３－ＬＯＸ活性明显要比
未发生衰老叶片中的高．
图５　拟南芥不同发育阶段叶片１３－ＬＯＸ活性检测
Ｆｉｇ．５　１３－ＬＯＸ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｌｅａｖｅｓ　ａｔ　ｄｉｆ－
ｆｅｒｅｎｔ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｓｔａｇｅｓ
４　讨　论
到目前为止，多方面的证据表明ＪＡ参与调节
了植物叶片的衰老过程，然而对其中的机制仍然知
之甚少．在发生衰老叶片中ＪＡ的含量增加４倍，
其合成途径也被激活．作为ＪＡ合成步骤的第一个
酶，ＬＯＸ家族哪些成员参与了该过程中ＪＡ的合
成，各自贡献有多少？尽管已有报道涉及，然而结
果存在较大差异［３，２３，２４］．主要原因可能有：所采用
的材料不同（如自然衰老的叶片［３，２４］、暗处理、其他
胁迫处理诱导衰老的叶片［２３］）；采用的技术方法
（ＲＴ－ＰＣＲ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔ、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）；及对脂氧合
酶本身认识的限制（如之前人们对９－ＬＯＸ、１３－ＬＯＸ
的划分及ＪＡ合成途径认识较模糊，生物信息学对基
因组中ＬＯＸ编码基因的预测）．因此，有必要对该
过程中参与ＪＡ合成的１３－ＬＯＸ基因进行分析．
已有的研究表明：虽同为１３－ＬＯＸ，参与ＪＡ的
合成，但各成员之间既有协作（部分功能冗余），又
有分工，可能共同或者独立地参与了ＪＡ调控的生
物学过程［１２，１３］．在衰老叶片中，ＬＯＸ３、ＬＯＸ４、
ＬＯＸ６基因转录被显著、持续激活，对ＬＯＸ２而言，
在叶片衰老早期，其转录水平与之前相当，而到衰
老后期，其转录被明显下调（图３）．Ｂｕｃｈａｎａｎ－
Ｗｏｌａｓｔｏｎ等报道在衰老早期，ＬＯＸ２转录有一个
瞬时的增高［２３］，这可能与取材方法、时期等有关．
与野生型相比，山梨醇诱导的ＬＯＸ２基因 ＲＮＡｉ
植株离体叶片黄化过程被延迟，在自然衰老过程中
则无明显差异［２４］，推测ＬＯＸ２在叶片自然衰老尤
其是后期阶段可能作用不大或者明显减弱，而其他
三个基因作用相对较大，尤其是对ＪＡ介导的叶片
衰老而言．此外，我们得到的１３－ＬＯＸ单个基因功
能缺失突变体在叶片自然衰老过程中与野生型并
无明显差异，构建双重、多重基因突变体并对其衰
老叶片中ＪＡ含量、衰老进程等进行综合分析或将
有助于我们理解１３－ＬＯＸ各成员在ＪＡ介导的叶片
衰老中的作用和各自的贡献．
Ｂａｕｅｌｏｓ等指出：与开花前后叶片中ＬＯＸ活性
变化不同，拟南芥发生衰老叶片中ＬＯＸ活性的大幅
“增高”大部分可能本质上不是酶引起而是由于其他
物质的存在［２０］．我们对粗提酶液８６℃处理１ｈ后
几乎检测不到２３４ｎｍ处吸光值的变化或者与对照
相比无显著变化，这可能是取材、蛋白提取等方法不
同所致．总之，我们的实验为进一步分析ＬＯＸ参与
的ＪＡ调控植物叶片衰老过程打下了基础．
５９３１
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５０卷
致　谢　感谢安阳工学院刘震博士在生物信息学
分析上的指导和帮助．
参考文献：
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ｎｅｓｃｅｎｃｅ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅ　ｆｒｏｍ　ｗｏｒｍｗｏｏｄ（Ａｒ－
ｔｅｍｉｓｉａ　ａｂｓｉｎｔｈｉｕｍＬ．）［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏ，１９８０，６６
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［２］　Ｊａｓｍｏｎａｔｅｓ　Ｐ　Ｂ．Ｈｏｒｍｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ　ｏｒ　ｓｔｒｅｓｓ　ｆａｃ－
ｔｏｒｓ　ｉｎ　ｌｅａｆ　ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ？［Ｊ］．Ｊ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｒｅｇｕｌａ－
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ｄｅｎｃｅ　ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ　ａ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｊａｓｍｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐ－
ｓｉｓ　ｌｅａｆ　ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏ，２００２，１２８（３）：
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ｉｚｅｄ　ＣＣＣＨ－ｔｙｐｅ　ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＯｓＤＯＳ，ｉｓ　ｉｎ－
ｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｄｅｌａｙｉｎｇ　ｌｅａｆ　ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ｒｉｃｅ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓ，２００６，１４１（４）：１３７６．
［５］　Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ　Ｃ，Ｐｒａｔｔ　Ｄ　Ａ，Ｐｏｒｔｅｒ　Ｎ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｏｆ　ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ　ａｎｄ　ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ
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ｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ｗｏｕｎｄｅｄ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ｌｅａｖｅｓ：ａ
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ｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ａｂｉｏｔｉｃ　ａｎｄ　ｂｉｏｔｉｃ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ
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ｄｅｆｅｎｓｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ａ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｃａｓ－
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［责任编辑：白林含］
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