全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（8）：1457–1464 http：// www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail：yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–03–14；修回日期：2012–07–19
基金项目：广东省自然科学博士启动基金项目（10451064001006063）；广东省农业科学院院长基金项目（1279009475432）
* E-mail：zhaoqin0802@126.com
番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因原核表达蛋白的
抗血清制备及其检测应用
赵 芹 1,*，李华平 2，谢大森 1，何晓明 1，张曙光 2，罗少波 1
（1 广东省农业科学院蔬菜研究所，广州 510640；2 华南农业大学植物病毒研究室，广州 510642）
摘 要：以受番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus，PRSV）侵染的番木瓜（Carica papaya）叶片
为供试材料，采用 RT-PCR 方法克隆其外壳蛋白基因 cp，并将其连接到原核表达载体 pET-28b（+）上，
酶切鉴定及克隆测序确定开放阅读框的正确性，将获得的重组质粒转化大肠杆菌表达宿主菌。通过摸索
转化的表达宿主菌种类、IPTG 浓度及诱导时间，获得高效表达 PRSV cp 的条件。SDS-PAGE 分析结果表
明，CP 融合蛋白分子量为 36.8 kD。以 Ni2+-NTA 亲和层析柱纯化的融合蛋白为抗原，免疫注射新西兰大
白兔制备得到高效价抗体，间接 ELISA 测定效价为 1︰16 384。Western blot 检测结果表明，制备的抗血清
可与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应。通过 ID-ELISA 检测田间样品证实了制备的抗血清与 PRSV 侵
染病叶发生了良好的特异性反应。本试验为 PRSV 的快速检测以及 PRSV 编码蛋白的功能研究奠定了基
础。
关键词：番木瓜；番木瓜环斑病毒；外壳蛋白基因（cp）；原核表达；抗血清制备
中图分类号：S 667.9 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）08-1457-08

Preparation and Application of the Antiserum Specific to the Coat Protein
Expressed Prokatically of Papaya ring spot virus
ZHAO Qin1,*，LI Hua-ping2，XIE Da-sen1，HE Xiao-ming1，ZHANG Shu-guang2，and LUO Shao-bo1
（1Vegetable Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China；2 Laboratory
of Plant Virology，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）
Abstract：Coat protein gene（cp）was amplified by RT-PCR from papaya leaves infected by Papaya
ring spot virus and cloned to prokaryotic expression vector pET28b（+）. After identification by enzyme
digestion and sequencing，the recombinant clone was transformed to Escherichia coli for protein
expression. The fusion protein was highly expressed by groping the expressing host bacteria，concentration
of IPTG and inducing time. SDS-PAGE indicated that the molecular weight of fusion protein highly
expressed was 36.8 kD. The purified protein by Ni2+-NTA affinity chromatography was used as antigen to
immunize the healthy rabbit for antiserum preparation. Indirect-ELISA（ID-ELISA）assay showed the
optimal titer of the antiserum was 1︰16 384. Western blot analysis confirmed that the antiserum reacted
specially with CP protein of PRSV. ID-ELISA testing of a number of field samples demonstrated the

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sensitivity and specificity of the antiserum. The present study had paved a way to establish the methods of
PRSV detection and the research protein function of PRSV.
Key words：papaya；Papaya ring spot virus；coat protein gene（cp）；prokaryotic expression；antiserum
preparation

番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus，PRSV）是引起番木瓜（Carica papaya）病毒病的最
主要病毒（Davis & Ying，2004），是马铃薯 Y 病毒属（Potyvirus）成员之一。PRSV 为单分体正链
RNA 病毒，由多种蚜虫以非持久方式传播。根据寄主范围，PRSV 可划分为 P 型和 W 型两种（Yeh
& Gonsalves，1984），其中 P 型株系（PRSV-P）是制约生产的重要病原，除了给番木瓜生产带来
严重危害，也会危害葫芦科作物（Tennant et al.，1994；赵芹 等，2011）。美国于 20 世纪 40 年代
末首次报道番木瓜环斑病毒病（Bateson et al.，2002），现在番木瓜环斑病毒病已成为番木瓜生产上
的世界性严重病害。在中国华南地区，该病自 1964 年流行成灾，在 20 世纪 50 年代几乎使中国番木
瓜绝收（任佩瑜和范怀忠，1964；饶雪琴和李华平，2005）。
目前国内外建立的病毒检测技术很多，其中免疫学技术，特别是酶联免疫吸附分析方法（ELISA）
是病毒鉴定分类以及检测的重要工具，也是应用最广泛的方法之一（王健华 等，2005；吴育鹏 等，
2010）。PRSV 血清学检测多以粗提病毒粒子为抗原，在对 90 年代的株系分化进行研究时，存在抗
体制备效价低、制备繁琐等缺点（Gonsalves & Ishi，1980；陈枝楠 等，1993；肖火根和范怀忠，1994），
且对近些年病毒是否变异不得而知。因此建立简便易行、灵敏快速的免疫学检测技术，势在必行。
据报道 PRSV 外壳蛋白具有多种功能，与病毒的致病性、介体传毒、病毒在细胞间的移动和长
距离运输等生物学性状密切相关，但其具体功能及机理研究还不透彻，本试验中利用分子生物学方
法在大肠杆菌中高效表达该病毒的外壳蛋白，以纯化的蛋白免疫大白兔制备专化性抗血清，为该病
毒检测体系的建立及编码蛋白功能研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
受 PRSV 侵染的番木瓜叶片于 2010 年 10 月采自广州市岗顶区，–70 ℃保存备用。原核表达载
体 pET-28b（+）、菌株 Escherichia coli DH5α、BL21（DE3）、BL21（DE3）Plyss、Rosetta（DE3）
Ⅲ为华南农业大学植物病毒研究室保存。DNA 分子量标准、pMD Simple18-T 载体、DNA 聚合酶、
各种限制性内切酶为 TaKaRa 公司产品。引物合成及序列测序由广州英韦创津生物技术公司完成。
增强型 HRP 底物显色试剂盒、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG 购自广州英韦创津生物技术公司。
硝酸纤维素膜及 His. Bind Ni2+ NTA 蛋白纯化试剂盒购自广州康为世纪生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 原核表达载体的构建
感染 PRSV 病毒的番木瓜病叶，利用 Trizol 按说明书提取总 RNA，–70 ℃保存备用。根据已
报道的 PRSV 海南分离物全基因组序列（EF183499）设计引物扩增 cp 序列。PRSV CP-F：5′-GGATCC
AATGTCCAAGAATGAAGCTGTG-3′（下划线为 BamHⅠ酶切位点）；CP-R：5′-CTCGAGTTAGCGC
ATACCCAGGAGA-3′（下划线为 XhoⅠ酶切位点）；物由广州英韦创津生物技术公司合成。以提取
的番木瓜病叶总 RNA 为模板，利用 RT-PCR 一步法试剂盒扩增病毒 cp。反应条件为 50 ℃反转录
30 min，94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，50 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，循环 30 次，72 ℃
8 期 赵 芹等：番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因原核表达蛋白的抗血清制备及其检测应用 1459

延伸 10 min，最后冷却至 4 ℃。反应体系为 PrimeScript one-Step Enzyme Mix 0.4 μL，2 × one-Step
Buffer 10 μL，病毒上下游引物（10 μmol · L-1）各 1 μL，加入 RNase Free ddH2O 补充体系至 20 μL。
回收后 PCR 产物与 pMD18 Simple T 载体连接，转化大肠杆菌 DH5α，筛选白色菌落，经酶切进一
步鉴定得到重组克隆 pST-CP，菌液送至广州英韦创津生物技术公司测序。
将质粒 pST-CP 和 pET-28b（+）分别用 BamHⅠ和 XhoⅠ进行双酶切，回收目的片段后，利用
T4 DNA 连接酶进行连接，获得目的基因的原核表达载体 pET-CP 重组质粒，经酶切鉴定后转化到
表达宿主菌株中进行表达。
1.2.2 目的基因的诱导表达
将目的基因的原核表达载体 pET-CP 转化至不同表达宿主菌 E. coli BL21（DE3）、BL21（DE3）
Plyss、Rosetta（DE3）Ⅲ中摸索最适合表达的菌株。挑取含 pET-CP 的各菌株单菌落，接种到 LB
液体培养基中，37 ℃下培养至 OD600 ≈ 0.6，分别加入 IPTG 至终浓度 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和 1.2
mmol · L-1 诱导 4 h；另外将包含 pET-CP 的各菌株加入 IPTG 至终浓度为 1 mmol · L-1，于 37 ℃下诱
导表达 2、4、6 和 8 h；取诱导菌液 1.5 mL，12 000 r · min-1 离心 1 min，沉淀加入 200 μL 1 × SDS
上样缓冲液，煮沸 5 min，取 15 μL 上样，进行 SDS-PAGE 电泳分析。
1.2.3 表达蛋白的可溶性分析及纯化
诱导菌液冰浴超声波破碎，4 000 r · min-1 离心 10 min，弃上清液，沉淀溶解在超声波破碎缓冲
液（0.05 mol · L-1 Tris-HCl，5 mmol · L-1 EDTA，0.1 mol · L-1 NaCl，pH 8.0），分别取上清液和沉淀
的溶解液进行 SDS-PAGE 分析。超声波破碎的表达产物按 His. Bind Ni2+ NTA Purification Kit 操作说
明进行蛋白纯化。蛋白洗脱液加入超滤管中，7 500 r · min-1 离心 10 min，收集超滤管底部蛋白，析
出的变性蛋白颗粒用少量灭菌去离子水冲洗超滤管壁一并收集。纯化收集物进行 SDS-PAGE 分析。
1.2.4 表达蛋白的抗血清制备及效价测定
通过紫外吸收法[蛋白浓度（mg · mL-1）= 1.45 × A280–0.74 × A260]测定浓缩蛋白浓度；取 100 μg
蛋白与等体积福氏完全佐剂充分混合，乳化作为抗原，参考邓丛良等（2005）的方法皮下和肌肉混
合多点注射雄性大耳白兔，免疫 5 次，间隔时间为 10 d，采耳静脉血进行间接 ELISA 效价测定。参
考吴兴泉等（2003）的方法测定效价，抗原浓度为免疫注射时的 1/20，抗血清稀释度为 1︰32 ~
1︰262 144。最后心脏采血，常规方法获取抗血清。
1.2.5 Western blot检测
根据 Sambrook 等（2002）的方法，SDS-PAGE 电泳后的凝胶，电转移转印于硝酸纤维素膜上，
将所制备的抗血清按 1︰300 稀释作为一抗，2 000 倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔作为二抗，
按 HRP 底物显色 Western blot 试剂盒说明进行显色。
1.2.6 田间样品检测
从广州各市区采集到 21 个具有典型症状的 PRSV 侵染病样，用本试验中制备的抗血清对这些样
品进行 ID-ELISA 检测，然后设计扩增 PRSV cp 保守序列的引物进行 RT-PCR 检测，以验证 ELISA
检测结果。引物 CP-P1：5-AGGGATAGAGACGTCAATGCCGGA-3，引物 CP-P2：5-GCGCATACCC
AGGAGAGAGTGCAT-3，扩增片段为 708 bp。
2 结果与分析
2.1 PRSV cp 的扩增与克隆
如图 1 所示，采自广州市岗顶区的番木瓜病样的 PRSV cp 的 RT-PCR 扩增产物约 870 bp，与预
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计目的片段大小一致。扩增产物克隆至 pMD Simple 18-T 载体上，酶切鉴定证明目的片段已经插入
到重组质粒中。
序列分析表明，PRSV 广东分离物 cp 开放阅读框（Opening Reading Frame，ORF）为 870 bp，
G + C 含量为 41.6%，编码 290 个氨基酸，推测蛋白分子量为 33.1 kD。Blast 分析表明，与 GenBank
中 PRSV VNP-21 分离物 cp 同源性最高，为 98%，与其他分离物同源性在 92% ~ 97%之间。
2.2 原核表达载体的构建
将 pET-CP 重组质粒利用 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切，得到与预期大小一致 870 bp 的酶切片段，
说明 cp 插入至 pET 载体中（图 2）。序列测定进一步证明，插入基因序列完全正确，可用于后续的
表达中。


2.3 原核表达
PRSV cp 构建至原核表达载体 pET-28b（+），使得 CP 蛋白 N 端融合 6 个组氨酸标签。将 pET-CP
重组质粒转化至大肠杆菌各表达菌株，经 IPTG 终浓度 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol · L-1 分别
诱导 4 h 和终浓度 1.0 mmol · L-1 IPTG 诱导 2、4、6、8 h 后，进行 SDS-PAGE 分析。电泳结果（图
3、图 4）表明，与空载体菌株诱导及重组载体菌株未诱导阴性对照相比，包含 pET-CP 的 BL21（DE3）
及 Rosetta（DE3）Ⅲ菌株在不同时间段及 IPTG 浓度下均表达出约 40 kD 蛋白的特异条带（黑色箭
头），与预期大小基本一致，且目的蛋白产量与表达时间及 IPTG 浓度无关，而在 BL21（DE3）Plyss
菌株中，不同条件下诱导，均未表达或表达量很低（图片未显示）。
2.4 融合蛋白的可溶性分析及纯化和定量
诱导表达的菌液经超声波裂解、SDS-PAGE 电泳分析后表明，PRSV CP 蛋白表达产物少量存在
于上清液中，主要以包涵体的形式存在于沉淀中（图 5）。Ni2＋-NTA 纯化的融合蛋白超滤浓缩后，
经 SDS-PAGE 分析发现重组蛋白得到较好的纯化（图 6）。测定所纯化的表达产物浓度为 0.206
mg · mL-1。
图 1 番木瓜环斑病毒 cp RT-PCR 扩增产物电泳分析
M：DNA 分子标准 2000；
1、2：番木瓜环斑病毒 cp 扩增产物。
Fig. 1 Electrophoresis analysis of RT-PCR
products of PRSV cp
M：DNA marker DL2000；
1，2：RT-PCR products of PRSV cp.
图 2 重组质粒 pET-CP 双酶切鉴定电泳分析
M：DNA 分子标准 DL2000；1、2：重组质粒 pET-CP
经 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切鉴定。
Fig. 2 Electrophoresis analysis of recombinant plasmid
pET-CP digested by BamHⅠand XhoⅠ
M：DNA marker DL2000；1，2：Recombinant plasmid
pET-CP digested by BamHⅠand XhoⅠ.
8 期 赵 芹等：番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因原核表达蛋白的抗血清制备及其检测应用 1461

图 6 PRSV CP 融合蛋白纯化产物的电泳分析
1 ~ 3：纯化的 PRSV CP 融合蛋白；4、5：pET-CP
经 IPTG 诱导表达；6：pET-CP 未经诱导表达；
M：低分子量蛋白 marker。
Fig.6 Electrophoresis analysis of purified fusion
protein of PRSV CP protein
1–3：PRSV CP purified fusion protein；4，5：pET-CP induced by
IPTG；6：pET-CP uninduced by IPTG；M：Protein marker
of low range molecular weight.
图 5 PRSV CP 原核表达蛋白的可溶性分析
1：诱导的 pET-CP 宿主菌裂解液沉淀；M：低分子量蛋白 marker；
2：诱导的 pET-CP 宿主菌裂解液上清液；
3：IPTG 诱导的 pET-CP 宿主菌。
Fig. 5 Assay of solubility of PRSV CP expression protein
1：Insoluble pellet of E. Coli Rosetta（DE3）cell lysate containing
pET-CP；M：Protein marker of low range molecular weight；
2：Supernate of E. coli Rosetta（DE3）cell lysate containing pET-CP；
3：E. coli Rosetta（DE3）cell lysate containing pET-CP.
图 3 pET-CP 在 Rosetta（DE3）Ⅲ与 BL21（DE3）菌株中不同 IPTG 浓度下诱导的表达产物 SDS-PAGE 电泳分析
CK1：pET-28b（+）未经 IPTG 诱导；CK2：pET-28b（+）经 1 mmol · L-1 IPTG 诱导；M：低分子量蛋白 marker。
Fig. 3 SDS-PAGE analysis of pET-CP induced by different concentrations of IPTG in Rosetta（DE3）Ⅲ and BL21（DE3）strains
CK1：pET-28b（+）uninduced with IPTG；CK2：pET-28b（+）induced with 1 mmol · L-1 IPTG；
M：Protein marker of low range molecular weight.

图 4 pET-CP 在 Rosetta（DE3）Ⅲ与 BL21（DE3）菌株中不同诱导时间表达产物的 SDS-PAGE 电泳分析
M：低分子量蛋白 marker；CK1：pET-CP 未经 IPTG 诱导；CK2：pET-28b（+）经 1 mmol · L-1 IPTG 诱导 2 h。
Fig. 4 SDS-PAGE analysis of pET-CP induced by different time in Rosetta（DE3）Ⅲ and BL21（DE3）strains
M：Protein marker of low range molecular weight；CK1：pET-CP uninduced with IPTG；CK2：pET-28b（+）induced with 1 mmol · L-1 IPTG by 2 h.

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图 7 PRSV 外壳蛋白抗血清的 Western blot 分析
1、2. PRSV 外壳蛋白诱导表达；
3、4. PRSV 外壳蛋白未经诱导表达。
Fig. 7 Western blot analysis of PRSV CP antiserum
1，2：pET-CP induced by IPTG；3，4：pET-CP uninduced by IPTG.
2.5 抗血清制备、效价测定及 Western blot 分析
诱导表达的目的蛋白纯化后作为抗原，第
1 次与完全佐剂等比例混匀，以后 4 次与不完
全佐剂等比例混匀，采用肌肉与皮下注射相结
合免疫大白兔，获得抗 PRSV CP 蛋白抗血清。
将所制备的多克隆抗血清作为一抗进行
Western blot 分析，结果表明，以纯化蛋白包涵
体制备的抗血清可特异性地与表达的重组蛋白
产生反应（图 7）。间接 ELISA 测定结果表明，
以免疫注射蛋白 1/20 浓度作为抗原，将抗血清
稀释 16 384 倍时，仍有明显的阳性反应，将抗
血清作系列梯度稀释后，以感染 PRSV 番木瓜
病叶的汁液为抗原进行间接 ELISA 测定，抗血清进行 1︰256 ~ 1︰2 048 稀释时表现明显的阳性反应，
此为工作浓度。
2.6 田间样品检测
用所制备的抗血清对从广州各个市区采集到的 21 个番木瓜病样叶片进行 ID-ELISA 检测，每个
样品两次重复，结果发现有 20 个样品出现显色反应，1 个样品与健康番木瓜叶片和包被缓冲液对照
没有出现显色反应（图 8）。用 RT-PCR 技术对这些样品再次检测，有 20 个样品出现一条很亮且与
预期大小相符的条带（图 9），这与 ELISA 检测结果一致。
图 8 田间样品的 ID-ELISA 检测结果
1 ~ 21：PRSV 田间样品；CK+：纯化的 PRSV CP 融合蛋白；CK–：健康番木瓜叶片；Blank：包被缓冲液对照。
Fig. 8 ID-ELISA detection of PRSV in field samples
1–21：PRSV field samples；CK+：PRSV CP fusion protein purified；
CK–：Healthy leaves of papaya；Blank：Coating buffer control.
图 9 田间 PRSV 侵染病样 RT-PCR 检测结果
M：DNA 分子标准 DL2000；2 ~ 21. PRSV 田间病样 RT-PCR 电泳分析；CK+：PRSV 阳性样品对照；CK–：健康叶片阴性对照。
Fig. 9 RT-PCR detection result analysis of field samples infected by PRSV
M：DNA marker DL2000；2–21. RT-PCR amplification of field samples infected by PRSV；
CK+：PRSV infected leaves as positive control；CK–：Healthy leaves as negative control.
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3 讨论
PRSV 对番木瓜的危害严重，建立一种快速可靠的检测技术对于控制该病毒的传播和蔓延尤为
重要。血清学方法具有灵敏、快速、适合大量样品检测等特点，在植物病毒检测中得到广泛应用（林
林 等，2004；欧阳元龙 等，2010；向荣 等，2011；武改霞 等，2012），同时制备的抗血清还可
广泛应用于蛋白的鉴定、定位和定量分析，研究基因的生物学功能。另外，通过复性获得具有生物
活性的目的蛋白，也可为今后开展病毒相关蛋白的功能研究提供有力支持。前人对 PRSV 开展血清
学研究主要通过从寄主植物中提取病毒粒体免疫家兔或小白鼠制备抗体，病毒提纯过程复杂繁琐，
对仪器设备的要求高而得率低，这大大限制了病毒抗血清的制备与应用。本研究中通过 RT-PCR 扩
增 PRSV cp，构建至原核表达载体上高效表达，并制备了特异性抗血清，进而应用于田间样品的检
测，并为进一步研究外壳蛋白的功能奠定基础。
原核表达过程中重组菌能否诱导表达，以及经诱导后表达产物得率高低和存在形式是制备抗体
的关键所在，为此对不同菌株、诱导时间梯度和诱导物 IPTG 浓度梯度因素进行了分析。在不同表
达菌株中，松弛型菌株 BL21（DE3）及大肠杆菌稀有密码子型 Rosetta（DE3）Ⅲ均能诱导表达出目
的蛋白，而严紧型菌株 BL21（DE3）Plyss 则不能表达，或表达量很低；在时间梯度中，诱导 2 h
即见表达，随时间的增长并无明显变化，在 IPTG 浓度梯度中，0.2 mmol · L-1 即见表达，与其他较
高浓度甚至达到 1.2 mmol · L-1 时差异不大。考虑到成本及 IPTG 对细胞有毒性等原因，最终确定诱
导温度为 37 ℃、表达菌株为 BL21（DE3）或 Rosetta（DE3）Ⅲ、IPTG 浓度为 0.2 mmol · L-1、诱导
2 h 为 pET-CP 高效表达的条件。在这一条件下，诱导产物得率较高，时间较短，且大多以包涵体形
式存在，为后续免疫程序奠定了良好基础。作者采用 ID-ELISA 技术和 PCR 技术分别对 21 个样品
进行检测，两次检测的结果一致，由此证明，本试验中制备的 PRSV 抗血清基本上可用于田间样品
检测。目前血清学检测与 RT-PCR 为检测病毒最广泛应用的两种技术，两者均可灵敏高效的高通量
检测田间样品，尽管 RT-PCR 检测灵敏度及特异性比 ELISA 高，但需要昂贵的试剂及特殊仪器设备，
而 ELISA 检测对样品要求不高，操作简单方便，应用更普遍广泛。本研究制备的抗血清为建立检测
病毒体系及病毒编码蛋白功能研究奠定了基础。

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