全 文 ：南 方 农 业 学 报
番木瓜幼叶原生质体分离研究
唐文忠1，2，陆国昆3，廖 芬1，4，黄茂康1，4，黄伟雄1，黄僚才5
（1广西农业科学院园艺研究所，南宁 530007； 2广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，南宁 530007； 3南宁市西乡塘区心
圩街道办事处，南宁 530003；4广西农业科学院农产品加工研究所，南宁 530007；5南宁市老口子农林业科技有限公司，南宁 530003）
摘要：【目的】探讨番木瓜幼叶原生质体的最佳分离条件。【方法】以20～30日龄番木瓜无菌苗幼叶为材料，对原生
质体分离过程中酶液组合、酶解时间、纯化离心速度（500～1500 rpm）及离心时间（6～10 min）进行探讨。【结果】随着酶
解液中纤维素酶和果胶酶含量的提高，番木瓜原生质体产量逐渐升高，而其活力逐渐降低，其中以为2.0%纤维素酶+
0.5%果胶酶组合的效果较好，解离时间以8 h为宜。随着酶解液中甘露醇浓度的升高，原生质体的产量呈现先增加后
降低的趋势，在0.55 mol/L时达到最大（2.48×106个/gFW）。在悬浮纯化原生质体时，以1000 rpm离心6～8 min的效果较
好。【结论】适宜原生质体分离的酶解液为2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶+25 mmol/L MES+0.55 mol/L甘露醇，最适酶解时
间为8 h；在原生质体纯化时，使用1000 rpm离心6~8 min，有利于获得产量及活力较高的原生质体。
关键词：番木瓜；幼叶；原生质体；分离
中图分类号：5667.9 文献标识码：A 文章编号：2095-1191（2011）05-0468-03
收稿日期：2011-03-22
基金项目：广西自然科学基金项目（桂科自0728069）；南宁市科技成果转化与产业化示范项目（200902071B）
作者简介：唐文忠（1969-），男，广西兴安人，助理研究员，主要从事番木瓜的组织培养与育种研究工作
0 引言
【研究意义】番木瓜（Carica papaya L.）是著名的
热带、亚热带水果之一，鲜食加工兼用。由于番木瓜
种植投资回收快、收益高，近年来我国海南、广东、广
西、福建、云南等省（区）的番木瓜适宜种植地区积极
发展番木瓜生产，其栽培面积迅速扩大。但我国番木
瓜生产普遍存在寒害、风害、病毒性病害等问题，阻
碍了番木瓜的发展。采用生物技术育种，为克服这一
障碍提供了一条可行的新途径。原生质体是研究细
胞生理现象的理想材料，也是遗传转化的理想受体
（李杰等, 2003）。【前人研究进展】近年来，许多学者
对植物原生质体及原生质体融合技术在微生物遗传
育种上的应用进行了大量研究。刘强等（2008）以黄
芪叶片和愈伤组织为材料, 对黄氏原生质体制备分
离技术进行研究，发现以黄芪叶片制备原生质体明
显优于黄芪愈伤组织, 能够获得大量高活力的原生
质体；2%纤维素酶+0.5%半纤维素酶+0.5%果胶酶的
混合酶水解12 h，可获得较好的分离效果。袁彬和潘
学军（2010）以毛葡萄愈伤组织、悬浮培养细胞、无菌
苗幼叶为材料，对毛葡萄原生质体的分离纯化方法
南方农业学报 2011，42（5）：468-470
Journal of Southern Agriculture
Isolation of protoplast from young leaves of papaya
TANGWen- zhong1，2，LUGuo- kun3，LIAO Fen1，4，HUANGMao- kang1，4，
HUANGWei- xiong1，HUANGLiao- cai5
（1 Horticulture Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007，China；2 Guangxi Crop
Genetic Improvement and Biotechnology Lab，Nanning 530007，China；3 Xinxu Street Office of Nanning Xixiangtang District，
Nanning 530003，China；4 Institute of Agro-food Science and Technology，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，
Nanning 530007，China；5 Nanning Laokouzi Agroforestry Technology Co. Ltd.，Nanning 530003，China）
Abstract：【Objective】The present experiment was conducted to study the optimal conditions for isolation of protoplast
from young leaves of papaya. 【Method】The young leaves of papaya were sampled from virus-free plantlet to isolate the pro-
toplast， and the influences of different conditions including enzymolysis solution combinations （1-3% cellulase and 0.5-0.8%
pectinase）， incubation times （0-12 h）， purification centrifugal speed （500-1500 rpm） and centrifugal time （6-10 min）
on isolation of protoplasts were compared and analyzed. 【Result】The quantity of purified protoplast increased gradually with
the increasing concentration of cellulase and pectinase enzymes in enzymolysis solution， while its activity showed declining
trend. The best results were obtained by incubating leaf material for 8 h in solution containing combination of 2.0% cellulase
+0.5% pectolyase. Increasing the mannitol concentration in enzymolysis solution，the quantity of protoplasts initially in-
creased but then showed a declining trend， and gave highest output （2.48×106 protoplast/gFW） at 0.55 mol/L mannitol con-
centration in enzymolysis solution. The best purification was obtained at 1000 rpm centrifuge speed for 6-8 min. 【Conclu-
sion】The results revealed that incubating the leaf tissues in enzymolysis solution containing 2.0% cellulase onozuka R-10+
0.5% pectolyase Y-23 + 25.0 mmol/L MES + 0.55 mol/L manitol for 8 h， and purifying them at 1000 rpm centrifuge speed
for 6-8 min gave best protoplast with high quality and high activity.
Key words： papaya； protoplast； isolation； young leaf
1.68
3.09
4.32
2.86
1.37
0.89
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70

mol/LConcentrations of manitol



(1
0

/g
FW
) Q
u
an
tit
y
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100



%

A
ct
iv
ity
及影响因素进行研究，结果表明，毛葡萄原生质体分
离材料以悬浮细胞和愈伤组织最好，毛葡萄愈伤组
织在0.5 mol/L甘露醇中预处理90 min，CPW+13%甘
露醇+2%纤维素酶+0.25%果胶酶+0.5%离析酶的酶
液中酶解10 h，其原生质体产量最高。Yin（2011）利用
原生质体融合技术获得梨孢菌的杂合子,评价该体系
用于遗传研究的可行性, 研究结果初步表明利用原
生质体融合技术组建梨孢菌的融合子群体用于遗传
分析在技术上是可行的。【本研究切入点】目前，有关
番木瓜原生质体分离提取的研究鲜有报道。【拟解决
的关键问题】以番木瓜无菌苗幼叶为材料，对其原生
质体制备条件进行研究，旨在为番木瓜原生质体水
平上的遗传转化、突变体筛选以及体细胞融合育种
提供技术支持。
1 材料与方法
1. 1 酶解材料制备
番木瓜原生质体分离参照Alleweid and Reustle
（1988）、吕长平等（2005）方法并作部分修改。在超净
台上取叶龄20~30 d的番木瓜无菌苗幼叶1 g，用解剖
刀切成0.5~1.0 mm宽置于预处理液中（B5培养基中
添加13.0%甘露醇，pH 5.8），在黑暗室温下质壁分离
0.5~1.0 h后，换入10 mL酶解液，然后置于（26±1）℃
摇床上、黑暗条件下轻轻摇动（45 rpm）酶解。
酶解液主要成分为1.0%~3.0%纤维素酶（Cellu-
lose Onozuka R- 10）、0.5% ~0.8%果胶酶（Pectonase
Y- 23）、25 mmol/L 2-（N- 吗啡啉）乙磺酸（MES）、
3 mmol/L CaCl2·H2O、0.62 mmol/L KH2PO4·H2O，pH
5.8，以直径0.45 μm的微孔滤膜过滤灭菌，放入4℃冰
箱备用。在B5培养基中添加0.45~0.70 mol/L甘露醇，
配成pH 5.8的原生质体清洗液；在B5培养基中添加
30.0%蔗糖，配成pH 5.8的悬浮液。
1. 2 原生质体收集与纯化
在原生质体酶解过程中，每隔2 h在倒置显微镜
下观察1次，以原生质体的平均密度不再变化为最适
酶解时间。充分酶解后，用200目孔径的尼龙网过滤，
将滤液收集于10 mL的尖底离心管中，分别以500~1500
rpm离心6~10 min，弃上清液；再用原生质体清洗液
洗涤2次，将留下的原生质体悬浮于1 mL清洗液中，
并在另一只10 mL的尖底刻度离心管中加入5 mL悬
浮液，在此液面上缓慢加入1 mL原生质体清洗液，再
以500~1500 rpm离心6~10 min。这时，在两个液面中
间出现一条绿色原生质体带，用吸管小心地吸出漂
浮于溶液界面间的原生质体。最后，用原生质体培养
液清洗1次，即可获得纯化的番木瓜幼叶原生质体。
1. 3 原生质体产量与活力测定
原生质体产量用0.1 mm血球计数板统计，取少量
上述原生质体悬浮液滴加在0.1 mm血球计数板上，当
原生质体充满计数室后，在显微镜下计数，计算4个角
上和中央中格内的原生质体数，产量单位为：个
/gFW。原生质体活力用0.1%FDA染色测定。
2 结果与分析
2. 1 不同浓度渗透压稳定剂（甘露醇）对游离原生质体
产量的影响
在原生质体分离过程中，在添加不同浓度渗透
压稳定剂（甘露醇）的条件下，游离原生质体产量明
显不同（图1）。当甘露醇为0.45~0.55 mol/L时，随着其
浓度的升高，原生质体的产量明显上升，在0.55 mol/L
时达到最大（2.48×106个/gFW），活力为89.18%。随着
甘露醇浓度不断升高，原生质体产量及活力逐渐下
降，酶解液中含有较多碎片，可能是因为渗透压太
高，导致原生质体浓缩干枯死亡。故采用0.55 mol/L
甘露醇作为渗透压稳定剂。
2. 2 不同酶浓度组合对番木瓜游离原生质体产量
的影响
当酶液pH 5.8、甘露醇浓度为0.55 mol/L时，采用
不同浓度的纤维素酶、果胶酶组合酶解20~30日龄的
幼叶8 h，从表1可知，随着酶解液中纤维素酶和果胶
酶含量的提高，番木瓜原生质体产量逐渐升高，而其
活力逐渐降低，同时细胞碎片也明显增多。在不同处
理中，以含2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶组合的酶解
液为宜，获得的番木瓜原生质体数量较多、活力较高，
分别为4.32×106个/gFW、85.76%。
2. 3 不同酶解时间对原生质体分离的影响
用含2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶组合的酶解液
唐文忠等：番木瓜幼叶原生质体分离研究
产
量
（
10
6 个
/g
FW
）
Qu
an
tit
y
活
力
（
%）
Ac
tiv
ity
甘露醇浓度（mol/L） oncentrations of manitol
图 1 不同浓度甘露醇对原生质体分离效果的影响
Fig.1 Effect of different concentrations of mannitol on quantity
and activity of protoplast isolated from young leaves of pa-
paya
表 1 不同酶浓度组合对分离原生质体数量的影响
Table 1 Effect of different combinations of different enzyme con-
centrations on quantity of protoplast isolated from young leaves of
papaya
酶 Enzyme
纤维素酶（%）
Cellulase
1
2
3
1
2
3
果胶酶（%）
Pectinase
0.5
0.5
0.5
0.8
0.8
0.8
原生质体数量
（×106个/gFW）
Quantity of
protoplast
2.88
4.32
4.92
3.02
4.25
4.89
原生质体
活力（%）
Activity of
protoplast
89.18
85.76
71.32
80.22
72.05
61.41
细胞碎片
Cell debris
极少
少
多
少
多
很多
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南 方 农 业 学 报
酶解时间（h）Hydrolysis time
对20~30日龄幼叶进行原生质体分离，每隔2 h观察1
次原生质体数量及活力。由图2可知，当酶解时间为
2 h时，仅有极少量的原生质体释放；随着酶解时间
的延长，原生质体的产量逐渐增高，当酶解10 h时，
其产量达到最高，但活力有所下降，且酶解液中碎片
开始增多；当酶解12 h时，原生质体的产量及活力均
逐渐下降，酶解液中碎片明显增多，说明原生质体产
量下降是因最早分离的原生质体大量破碎所致。综
合原生质体产量、活力及酶解液中碎片数量等方面
考虑，番木瓜幼叶原生质体的酶解时间以8 h为宜。
2. 4 不同离心速度和离心时间对原生质体游离的影响
从表2可以看出，番木瓜幼叶经2.0%纤维素酶
+0.5%果胶酶处理8 h后进行纯化，当以500 rpm离心
6~10 min，原生质体产量随离心时间的延长呈上升趋
势，而活力逐渐下降。当以1000 rpm离心6~8 min时，
原生质体产量达到最高，活力也较高，达86.33%
~85.21%；此后随着离心时间延长，活力大幅下降。当离
心速度达到1500 rpm时，原生质体产量和活力随离心
时间的延长呈先上升后降低的趋势，在相同离心时间内，
原生质体产量与活力均比离心速度1000 rpm下降。
在离心速度较低时(500 rpm)，取上清液镜检，仍
可看到较多数量的原生质体漂浮，说明在低离心速
度条件下纯化时，较多的原生质体丢失。综合研究表
明，番木瓜幼叶原生质体纯化以1000 rpm离心6~8 min
效果较好。
3 讨论
一般来说，植物各个器官，如：根、茎、叶、花、果
实、种子及愈伤组织和悬浮细胞等都可作为分离原
生质体的材料（孙勇如和安锡培，1991）。叶片是最易
获得的植物材料，而愈伤组织及悬浮细胞等需要经
过复杂的程序培育。目前，用于植物原生质体分离的
酶主要有纤维素酶、果胶酶、离析酶、半纤维素酶、崩
溃酶、蜗牛酶等（岳建雄等，1995），酶液浓度也随酶
解材料的不同而略有差异。本研究选用20~30日龄的
番木瓜无菌苗幼叶提取原生质体，结果表明，较适合
裂解的酶组合为：2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶，pH
5.8，解离8 h后原生质体产量为4.32×106个/gFW，活力
85.76%。
渗透压稳定剂的作用主要是维持原生质体内外
环境的渗透压相对稳定，从而保持质膜的稳定。在已
建立的各种植物原生质体分离系统中，适宜的酶液
渗透压使用范围为0.23~0.90 mol/L（Evans and Bravo，
1986）。在本研究中，分离番木瓜幼叶原生质体所采
用的甘露醇浓度以0.55 mol/L较为适宜，这与吕长平
等（2005）使用浓度0.50~0.60 mol/L结果相似。
4 结论
本研究利用过滤—低速离心法收集番木瓜幼叶
的游离原生质体，并通过蔗糖漂浮法纯化原生质体，
结果表明，适宜原生质体分离的酶解液为2.0%纤维素
酶+0.5%果胶酶+25 mmol/L MES+0.55 mol/L甘露醇，
最适酶解时间为8 h；在原生质体纯化时，使用1000 rpm
离心6~8 min，有利于获得产量及活力较高的原生质体。
参考文献：
李杰，黄敏仁，王命庥，蔡汝. 2003. 植物原生质体培养和
体细胞融合技术研究进展［J］. 仲恺农业技术学院学报，
16（4）：64-71.
刘强，张宗申，丛丽娜，章凌雪. 2008. 黄芪原生质体分离技
术［J］. 广西植物，28（3）：411-413.
吕长平，石雪晖，徐艳，叶云. 2005. 刺葡萄原生质体分离研究
［J］. 湖南农业大学学报（自然科学版），31（4）：393-395.
孙勇如，安锡培. 1991. 植物原生质体培养［M］. 北京：科学
出版社.
岳建雄，李淑君，张慧军． 1995． 地棉小孢子原生质体的游离
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质体培养专辑）． 北京：中国农业出版社：118-123．
袁彬，潘学军. 2010. 毛葡萄原生质体分离与纯化研究［J］.
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Alleweid G，Reustle G. 1988. Isolation and culture of grape
vine protoplasts（Vitis Vinifera L.）［M］//Bottino P J. Progress
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Boston：Kluwer Academic Publishers：67-68.
Evans B A，Bravo J E. 1986. Protoplast isolation and culture［M］
//Evand D A，Sharp W R，Ammirato P V，Yamada Y. Hand－
book of Plant Cell Culture. New York，USA：Macmillan.
Yin L F. 2011. Constructing gusants by protoplast fusion be－
tween Oryza and Eleusine pathotypes of Magnaporthe oryzae
［J］. Southwest China Journal of Agricultural Sciences，
（1）：233-239.
（责任编辑 韦莉萍）
表 2 不同离心速度和离心时间对原生质体产量及活力的影响
Table 2 Effects of different centrifugal speed and centrifugation
times on quantity and activity of isolated protoplast from papaya
离心力（rpm）
Centrifugal speed
500
500
500
1000
1000
1000
1500
1500
1500
离心时间（min）
Centrifugation time
6
8
10
6
8
10
6
8
10
产量（×106个/gFW)
Quantity
1.956
2.238
2.692
4.296
4.893
3.551
3.925
4.014
3.201
活力（%）
Activity
85.51
84.74
75.66
86.33
85.21
74.04
75.62
76.31
62.58
活
力
（
%）
Ac
tiv
ity
产
量
（
10
6 个
/g
FW
）
Qu
an
tit
y
图 2 不同酶解时间对原生质体分离的影响
Fig.2 Effect of different hydrolysis times on quantity and activity
of protoplast isolated from young leaves of papaya
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