全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（6）：1257–1266 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–01–27；修回日期：2014–03–27
基金项目：公益性行业（农业）科研专项经费项目（201203021）；海南省重大科技项目（ZDZX2013020-3）；海南省科学事业费项目（琼
财预[2013]131 号）；海南省重点科技计划应用研究及产业化项目（ZDXM20130031）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：hefanhn@163.com）
菠萝凋萎相关病毒–2 实时荧光定量 RT-PCR 检
测方法的建立
胡加谊 1,2，罗志文 2，范鸿雁 2，李向宏 2，刘志昕 3，何 凡 2,*
（1 海南大学环境与植物保护学院，海口 570228；2 海南省农业科学院热带果树研究所，农业部海口热带果树科学观
测实验站，海口 571100；3 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101）
摘 要：菠萝凋萎相关病毒（Pineapple mealybug wilt associated virus-2，PMWaV-2）是引起的菠萝凋
萎病（Mealybug wilt of pineapple，MWP）的重要病原。本研究中根据 PMWaV-2 外壳蛋白基因序列设计
特异性引物和探针，建立基于 TaqMan 探针的实时荧光定量 RT-PCR 检测方法。该方法能高灵敏检测出阳
性样品，对阴性样品及空白对照均无荧光反应；灵敏度比普通 PCR 高 100 倍；重复性试验表明批内和批
间变异系数均在 1.85%以内，表明本方法是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性较好的 PMWaV-2
定量检测方法。
关键词：菠萝；菠萝凋萎病毒–2（PMWaV-2）；TaqMan 探针；实时荧光定量 RT-PCR；检测
中图分类号：S 668.3；S 432 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）06-1257-10

Development of a Real-time Fluorescent Quantitative RT-PCR Method for
the Detection of Pineapple mealybug wilt associated virus-2
HU Jia-yi1,2，LUO Zhi-wen2，FAN Hong-yan2，LI Xiang-hong2，LIU Zhi-xin3，and HE Fan2,*
（1 College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228，China；2 Institute of Tropical Fruit
Trees，Hainan Academy of Agricultural Sciences/Haikou Investigation Station of Tropical Fruit Trees，Ministry of
Agriculture，Haikou 571100，China；3Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical
Agricultural Sciences，Haikou 571101，China）
Abstract：Pineapple mealybug wilt associated virus-2（PMWaV-2）is an important pathogen that
causes Mealybug wilt of pineapple（MWP）. This study established a real-time quantitative RT-PCR
method with TaqMan probe based on specific primers of conserved nucleotide sequence of PMWaV-2 coat
protein gene. The results showed that the method is highly sensitive to positive sample，but has no
fluorescence signal to health sample and water control. The sensitivity of real-time quantitative RT-PCR is
about 100 times higher than regular PCR. Three-time repeats revealed that the coefficients of variation
between the intra- and inter-assay were both within 1.85%，indicating a simple，specificity，high
sensitivity，and reliable reproducibility detection method to PMWaV-2.
Key words：pineapple；PMWaV-2；TaqMan probe；real-time quantitative RT-PCR；detction

1258 园 艺 学 报 41 卷
菠萝凋萎病（Mealybug wilt of pineapple wilt，MWP）是世界各菠萝主产区的重要病害之一，对
经济栽培造成严重影响（Carter，1934，1942，1945）。菠萝凋萎病的发生被认为是菠萝凋萎病毒
（Pineapple mealybug wilt associated virus）和粉蚧共同危害的结果，全世界已报道了 5 种菠萝凋萎
病毒，即 PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3、PMWaV-4 和 PMWaV-5（Gambley et al.，2008）和两
种传毒粉蚧，即菠萝洁白粉蚧（Dysmicoccus brevipes）和新菠萝灰粉蚧（D. neobrevipes）。目前，在
中国已见报道的菠萝凋萎病毒有 PMWaV-1、PMWaV-2 和 PMWaV-3（吴丽亭 等，2009，2010；李
运合 等，2010）。夏威夷大学的学者经研究首次提出 PMWaV-2 为菠萝凋萎病的重要病原之一（Sether
et al.，1998，Sether & Hu，2002）。国内有学者报道，PMWaV-2 和菠萝粉蚧共同作用是引起菠萝凋
萎病的最重要原因，其发病率可高达 60%，可造成 25% ~ 30%的经济损失（龚标勋，2002）。病毒
病的防治目前还没有疗效明显的药剂，对发病植株做到提前检测和及早诊断，及时作出病害防治措
施，对减少田间损失就显得尤为重要。目前用于菠萝凋萎病毒的检测方法主要有免疫电镜检测
（Gunasinghe & German，1989）、酶联免疫吸附（Hu et al.，1996）、组织免疫印记（Hu et al.，1997）
和反转录—聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerse chain reaction，RT-PCR）（Walkman et al.，
1995；Sether et al.，2001，2005）等技术，但这些方法都存在较大的限制因素，诸如免疫电镜成本
太高，血清学方法病毒粒子提纯困难，组织免疫印迹容易出现假阳性，RT-PCR 的后期处理易交叉
污染等。实时荧光定量PCR技术（Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，FQ PCR）
是 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司研发的一种在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信
号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该方法具有可
定量、高特异性、高敏感性、高通量等优点，非常适合于植株体内病毒的定量检测（徐小刚和刘雅
婷，2009），目前国际上尚无应用重组质粒作为标准品构建标准曲线达到对 PMWaV-2 定量检测的报
道，国内也无关于 PMWaV-2 实时荧光定量 RT-PCR 检测的报道。鉴于菠萝凋萎病对中国菠萝产业
造成较大的损失，急需建立一种高灵敏度的检测方法。2013—2014 年作者根据 PMWaV-2 外壳蛋白
（coat protein，CP）基因的保守序列设计引物和 TaqMan 探针，通过制备重组质粒标准品构建标准
曲线，建立起一套基于 TaqMan 探针 PMWaV-2 的实时荧光定量 RT-PCR 检测体系。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验于 2013—2014 年在海南省海口市中国热带农业科学院热带生物技术研究所进行。菠萝
植株样品及 PMWaV-2 阳性样品均为海南省农业科学院热带果树研究所提供。RNA 提取试剂盒为
Bioteke 公司的多糖多酚植物总 RNA 提取试剂盒；反转录酶为 TransGen 公司的 Transscriptfiret-strand
cDNA synthesis supermix；Trans5α Cell 购自 TransGen 公司；pMD18-T 载体、Taq DNA 聚合酶、DNA
Marker DL2000、Real Master Mix（Prob）均购自 TaKaRa 公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒与质粒提取
试剂盒均购自 AXYGEN 公司；TaKaRa TP600 PCR 仪；Stratagene 公司的 MX3005 荧光 PCR 仪；美
国 Thermo 公司 NanoDrop ND-2000C 微量紫外分光光度计。
1.2 引物和探针的设计合成
根据 NCBI 报道的 PMWaV-2 外壳蛋白基因（HE983618、EU769116、JN995534、JX645775、
JN995535、JN995533、DQ225114）的保守序列设计特异性 TaqMan 探针和引物（表 1），探针 5′标
记荧光基团 FAM，3′标记淬灭基团 TAMRA，预计扩增片段大小 168 bp。

6 期 胡加谊等：菠萝凋萎相关病毒–2 实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立 1259

表 1 PMWaV-2 实时荧光定量 RT-PCR 引物和探针
Table 1 The primers and probe designed for real-time fluorescent quantitative RT-PCR of PMWaV-2
引物名称
Primer
引物探针序列（5′→3′）
Sequence
退火温度/℃
Annealing temperature
PMWaV-2-F CGTGAGTGAGGTGGTTGAG 59
PMWaV-2-R GCAAAGAACTGCTTGGGT 55
Probe FAM-TGGCTCATCACGGAGTACCCAAGC-TAMRA 66

1.3 菠萝总 RNA 提取和 RT-PCR
称取 0.1 g 的菠萝叶片基部白色组织，用 Bioteke 公司的多糖多酚植物总 RNA 快速提取试剂盒
（离心柱型）提取菠萝叶片总 RNA，取 5 µL RNA 于 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测；用 ND-2000C 紫外
分光光度计测定其浓度，并将叶片总 RNA 置–80 ℃冰箱中备用。
以提取的菠萝叶片总 RNA 为模板，按康为世纪有限公司 TransScript Ⅱ Reverse Transcriptase
说明书反转录合成第一链 cDNA。20 µL 反转录体系为 Primer Mix 2 µL、2.5 mmol · L-1 dNTP Mix 4
µL、RNase-free H2O 3.5 µL、5× RT Buffer 4 µL、Ribonuclease Inhibitor 0.5 µL、Super RT 1 µL 和 RNA
模板 5 µL。混合溶液于 42 ℃水浴 1 h，85 ℃孵育 5 min 结束反应。
以反转录合成的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，20 µL 扩增体系包括 Taq（5 U · µL-1）0.2 µL，
10× PCR buffer（含 Mg2+）2 µL，dNTP Mixture（2.5 mmol · L-1）1 µL，PMWaV-2-F（10 µmol · µL-1）
0.5 µL，PMWaV-2-R（10 µmol · µL-1）0.5 µL，cDNA 1 µL 和 ddH2O 14.8 µL。PCR 反应条件为：94 ℃
预变性 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，循环 35 次；72 ℃ 10 min，4 ℃停止。PCR 产物
用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，拍照并比对序列。
1.4 质粒标准品的制备
以总 RNA 反转录合成的第一链 cDNA 为模板，以特异性引物 PMWaV-2-F/PMWaV-2-R 扩增获
得其特异性目的片段，将获得的目的片段克隆到 pMD18-T 载体上，转化大肠杆菌感受态，挑取阳
性克隆于 LB 液体培养基中，37 ℃ 200 r · min-1 振荡培养 6 h 以上。提取质粒，经菌液 PCR、测序确
定目标序列。核酸蛋白测定仪测定阳性质粒的浓度，并按照公式 C = A/B × 6.02 × 1014（其中 C 为
copies · µL-1，A 为以 OD260 分析得到的浓度 ng · µL-1，B 为质粒 DNA 分子量）计算质粒浓度拷贝数，
–20 ℃保存作为标准品备用。
1.5 探针适用性验证
以菠萝凋萎病显症叶片总 RNA 反转录合成的第一链 cDNA 为模板，质粒 DNA 为阳性模板，健
康菠萝叶片总 RNA 反转录合成的 cDNA 为阴性对照，水为空白对照进行实时荧光定量 PCR 反应，
即 25 µL 反应体系包括 Premix Ex Taq（probe qPCR）（2×）12.5 µL，PMWaV-2-F（10 µmol · L-1）0.5
µL，PMWaV-2-R（10 µmol · L-1）0.5 µL，ROX reference Dye（50×）0.5 µL，Probe（10 µmol · L-1）
1 µL，模板 1 µL，ddH2O 9 µL。反应程序为：95 ℃预变性 3 min；95 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，
72 ℃延伸 20 s，40 个循环。
1.6 标准曲线的建立
以 10 倍梯度稀释的质粒标准品为模板，取终浓度为 6.16 × 108 ~ 6.16 × 103 copies · µL-1 的 6 个质
粒样品，按 1.5 中的实时荧光定量反应体系在 Mx3005 荧光定量 PCR 仪上检测，得出各自的荧光扩
增曲线，仪器软件自动生成标准曲线。
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图 1 RT-PCR 检测 PMWaV-2
M：Marker DL2000；1：CP 基因片段扩增；
2：CP 基因片段重复扩增；CK-：阴性对照。
Fig. 1 Detection of PMWaV-2 by RT-PCR
M：Marker DL2000；1：Fragment of CP gene amplification；
2：Fragment of CP gene repeat amplification；
CK-：Negative control.

1.7 特异性试验
以含 PMWaV-2 CP 基因目的片段的重组质粒为阳性模板，分别对含有 PMWaV-1 和 PMWaV-3
等病毒的 cDNA 模板进行实时荧光定量 RT-PCR 扩增，同时设置阴性对照。
1.8 灵敏度试验
将质粒标准品按 10 倍梯度稀释，取终浓度为 6.16 ~ 6.16 × 109 copies · µL-1 等 10 个浓度的质粒
标准品作为模板，按 1.5 中的实时荧光定量反应体系在 Mx3005 荧光定量 PCR 仪上检测，得出荧光
定量 PCR 所能检出的最低模板拷贝数。同时按照 1.3 中 PCR 反应体系进行普通 PCR 的灵敏度测试
实验，与所建立的荧光定量 PCR 的灵敏度进行比较。
1.9 重复性试验
将质粒标准品按 10 倍梯度稀释，取 6.16 × 102 ~ 6.16 × 106 copies · µL-1 等 5 个稀释浓度的样品为
模板进行实时荧光定量PCR反应。将以上不同浓度的质粒DNA模板每天进行1次实时荧光定量PCR
反应，连续 3 d 即 3 次重复，考察不同试验的批次差异性。根据获得的 Ct 值计算平均 Ct 值、标准
差和变异系数。
1.10 田间样品检测
应用已建立的方法对采自田间的 11 份菠萝样品进行实时荧光定量 RT-PCR 检测。
2 结果与分析
2.1 菠萝叶片总 RNA 提取与 RT-PCR 检测结
果
健康和染病菠萝叶片中提取的总 RNA 经
1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，18S 和 28S RNA 条
带清晰可见，无弥散，经紫外分光光度计测定，
其 OD260/OD280 比值为 2.05，符合下一步试验
要求。
以反转录生成的第一链 cDNA 为模板扩增
PMWaV-2 CP 基因目的片段，所设计的引物在
常规 PCR 体系和程序下能够清晰、敏捷地扩增
出与预测片段大小一致的片段（图 1），经测序
分析及 Blast 比对，确定所获得的序列为
PMWaV-2 CP 基因目的片段。
2.2 探针适用性检测
以含有 PMWaV-2 目的片段的重组质粒为阳性模板，经实时荧光定量 RT-PCR 检测，可观察到
明显荧光信号强度的增长，而健康（阴性）对照和空白对照荧光吸收值均没有变化（图 2），表明所
设计的引物和探针适用于 PMWaV-2 的实时荧光定量 RT-PCR 检测。

6 期 胡加谊等：菠萝凋萎相关病毒–2 实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立 1261

图 2 实时荧光定量 RT-PCR 探针适用性试验
Fig. 2 Probe applicability of real-time fluorescent quantitative RT-PCR for PMWaV-2
2.3 标准曲线的建立
以 10 倍梯度稀释的阳性质粒为标准模板进行 PMWaV-2 实时荧光定量 RT-PCR 反应。其扩增曲
线随着阳性质粒模板浓度的稀释倍数增大，Ct 值呈现递增趋势如图 3 所示，在 6.16 × 108 ~ 6.16 × 103
copies · µL-1 浓度范围内，标准品浓度与 Ct 值之间具有良好的线性关系，曲线斜率为–3.267，决定
系数 R2 = 0.997，直线方程为 Y =–3.267log（X）+ 43.33，扩增效率为 102.3%，由此建立的标准曲
线可以用于 PMWaV-2 的检测。










图 3 PMWaV-2 实时荧光定量 RT-PCR 标准品动力曲线图
Fig. 3 Strand curve of real-time fluorescent quantitative RT-PCR for PMWaV-2

2.4 实时荧光定量 RT-PCR 检测的特异性
用本试验所建立实时荧光定量 RT-PCR 检测体系，分别以 PMWaV-2 CP 片段的重组质粒和含
PMWaV-1、PMWaV-3 等病毒的 cDNA 样品为模板进行实时荧光定量 RT-PCR 扩增。结果如图 4，除
了含 PMWaV-2 目的片段的阳性质粒出现良好的特异性扩增曲线，PMWaV-1、PMWaV-3 和阴性对照
检测结果均无荧光吸收值的变化，表明本试验所建立的实时荧光定量 RT-PCR 检测方法能够特异性
地检测 PMWaV-2。
2.5 实时荧光定量 RT-PCR 检测的灵敏度
普通 RT-PCR 的最低检出限测为 6.16 × 103 copies · µL-1（图 5），实时荧光定量 RT-PCR 最低检
出为 61.6 copies · µL-1（图 6），表明实时荧光定量 RT-PCR 检测灵敏度为普通 RT-PCR 的 100 倍。
1262 园 艺 学 报 41 卷
图 4 PMWaV-2 实时荧光定量 RT-PCR 特异性试验结果
Fig.4 The specificity of RT-qPCR for PMWaV-2

图 5 PMWaV-2 普通 RT-PCR 检测灵敏度
Fig. 5 General RT-PCR for PMWaV-2
M：Marker 2000；1：6.16 × 1010 copies · µL-1；2：6.16 × 109 copies · µL-1；3：6.16 × 108 copies · µL-1；4：6.16 × 107 copies · µL-1；
5：6.16 × 106 copies · µL-1；6：6.16 × 105 copies · µL-1；7：6.16 × 104 copies · µL-1；8：6.16 × 103 copies · µL-1；
9：6.16 × 102 copies · µL-1；10：6.16 × 101 copies · µL-1；CK-：Negative control.

2.6 重复性
通过对 6.16 × 102 ~ 6.16 × 106 copies · µL-1稀释梯度的质粒DNA实时荧光定量RT-PCR的扩增曲
线（图 7）和进行统计学分析（表 2），发现同一批次试验各梯度的变异系数均小于 1.25%，表明该
方法具有较好组内的重复性。而批次间重复性试验结果表明，各梯度批间差异系数均小于 1.85%，
表明该方法的批间重复性较好，可以用于菠萝叶片 PMWaV-2 的定量检测。

表2 重复性试验统计结果
Table 2 Intral-assay and inter-assay reproducibility of real-time fluorescent quantitative RT-PCR for PMWaV-2
组内重复 Reproducibility of intral-assay 组间重复 Reproducibility of inter-assay 质粒拷贝数/（copies · µL-1）
Plasmid concentration Ct SD CV/% Ct SD CV/%
6.16 × 106 20.46 0.093 0.45 20.59 0.094 0.46
6.16 × 105 24.17 0.297 1.23 24.38 0.446 1.83
6.16 × 104 27.11 0.183 0.68 27.34 0.361 1.32
6.16 × 103 31.09 0.148 0.48 31.26 0.321 1.03
6.16 × 102 33.63 0.279 0.83 33.45 0.494 1.48

6 期 胡加谊等：菠萝凋萎相关病毒–2 实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立 1263

图 6 PMWaV-2 单重实时荧光定量 RT-PCR 的灵敏度
Fig. 6 The sensibility of single RT-qPCR for PMWaV-2

图 7 实时荧光定量 RT-PCR 扩增曲线重复性
Fig. 7 The reproducibility test of real-time fluorescent quantitative RT-PCR for PMWaV-2

2.7 田间样品检测结果
对采自海南省田间的 11 份菠萝凋萎病症显隐症植株样品进行检测，应用所建立的实时荧光定量
RT-PCR 体系均可以进行稳定的扩增，所以可以利用扩增曲线和 Ct 值来对样品是否带毒和病毒含量
进行检测和定量。由样品检测图 8 可以看出，除了 4 号和 5 号样品，其它样品均出现特异性扩增曲
线。说明除了 4 号和 5 号样品，其他样品均为 PMWaV-2 阳性样品。
图 8 应用实时荧光定量 RT-PCR 对田间样品（1 ~ 11）进行带毒检测的效果比较
Fig. 8 The comparison results of field samples（1–11）by real-time fluorescent quantitative RT-PCR for the PMWaV-2 detection
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普通 RT-PCR 检测结果中，除了 9 号样品与实时荧光定量 RT-PCR 不同，其他样品均与普通
RT-PCR 检测结果一致（图 9）。对 9 号样品进行测序，结果表明 9 号样品与 PMWaV-2 的同源性为
100%。说明实时荧光定量 RT-PCR 灵敏度高于普通 RT-PCR，能够检测到 9 号样品较低的病毒含量。













图 9 普通 RT-PCR 对田间样品进行带毒检测的效果比较
M：Marker 2000；1 ~ 11：样品编号；CK-：阴性对照。
Fig. 9 General RT-PCR for the PMWaV-2 detection of field samples
M：Marker 2000；1–11：Code of the samples；CK-：Negative control.

3 讨论
实时荧光定量 RT-PCR 方法检测 RNA 病毒，通常用体外转录的 RNA 片段作为标准品（Nolan et
al.，2006），可消除因 RNA 提取和反转录效率不同带来的试验误差。但存在标准品易降解、较难保
存、每次试验均要重新稀释定量等问题（Hoffmann et al.，2005），一定程度上增加了操作难度和试
验误差。本试验采用重组质粒 DNA 作为标准品，具有保存稳定、易于标准化等优点；同时，在样
品检测的试验中，通过取等量的菠萝叶片提取总 RNA，并且在测定 RNA 浓度和质量后将样品 RNA
稀释到同一浓度，再在相同的反转体系下同时反转录生成第一链 cDNA，最大程度地避免了 RNA 提
取效率和反转录效率不同引起的误差，提高试验效率。同时也有研究表明不同目的片段 RNA 的反
转录效率相差很大，但对于同一个靶片段而言，其反转录效率稳定（Hayward et al.，1998），可见在
本研究中采用重组质粒 DNA 作为标准品并不会影响试验效果。
样品检测试验中，9 号样品在实时荧光定量 RT-PCR 检测下呈现 PMWaV-2 阳性，并且经测序验
证无误，但是在普通 RT-PCR 检测中却呈现 PMWaV-2 阴性现象，这是因为 9 号样品 Ct 值为 31.53，
根据实时荧光定量 RT-PCR 标准曲线算得 9 号样品 PMWaV-2 外壳蛋白基因拷贝数为 4 074 copies。
所以 9 号样品所含病毒拷贝数在普通 RT-PCR 最低检测线以下，但在实时荧光定量 RT-PCR 检测范
围之内。这表明本试验所建立的 PMWaV-2 实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的灵敏度远高于普通
RT-PCR，不仅适合于凋萎病隐症植株叶片组织中 PMWaV-2 的检测和量化，监测田间凋萎病的发生
和蔓延，为病情及时有效的控制提供一定的技术支持，还能为菠萝脱毒苗繁育过程中菠萝凋萎病病
毒病原的定量检测提供有效的方法。
实时荧光定量检测方法已广泛的应用于植物病毒学研究中，国外 Zhu 等（2010）用实时荧光定
量 RT-PCR 方法监测和定量夏威夷的甘蔗黄叶病毒，Rizza 等（2009）发现实时荧光定量方法检测植
物组织中柑橘病毒体 Ⅲ 具有很强的特异性和高灵敏度。在中国实时荧光定量 PCR 技术目前已应用
于柑橘碎叶病毒（刘科宏 等，2009）和李痘病毒（高雅红 等，2011），特异性和灵敏度都强于普通
6 期 胡加谊等：菠萝凋萎相关病毒–2 实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立 1265

RT-PCR。
本研究是应用重组质粒作为标准品构建标准曲线，从而建立起 PMWaV-2 实时荧光定量 RT-PCR
检测方法的首次报道，这也是国内首次关于 PMWaV-2 实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的报道，同
样具有优于普通 RT-PCR 的高灵敏度，且能快速、准确地检测 PMWaV-2 在寄主中的含量，适用于
在寄主组织中含量较低的植物病毒的定量检测，还可应用于病毒在寄主内的运动复制规律及其与寄
主互作机制的研究。

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