全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（4）：613–620 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–09–30；修回日期：2014–03–02
基金项目：国家‘973’计划课题（2011CB100606）；国家‘863’计划课题（2011AA100205）；国家自然科学基金项目（31125024）；
教育部创新团队项目（IRT13065）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：guoww@mail.hzau.edu.cn）
以柑橘多胚性二倍体母本倍性杂交培育三倍体
解凯东 1，王晓培 1，王惠芹 1，梁武军 1，谢宗周 1，郭大勇 1，伊华林 1，
邓秀新 1，Grosser Jude W.2，郭文武 1,*
（1 华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室/农业部华中地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，武汉
430070；2 美国佛罗里达大学柑橘研究与教育中心，佛罗里达 33850，美国）
摘 要：2009—2012 年，以柑橘 8 个多胚性二倍体品种为母本与近年始花的 5 个异源四倍体体细胞
杂种和 1 个同源四倍体分别杂交，培育三倍体新种质。连续 4 年共配置 15 个杂交组合，授粉 4 442 朵花，
坐果 1 484 个，平均坐果率 33.4%；用于幼胚挽救的果实 1 075 个，共培养幼嫩种子 12 578 颗，经生芽、
生根诱导获得再生植株 2 832 个；以流式细胞仪对所有再生植株倍性检测，15 个组合共获得三倍体 401
个，四倍体 121 个；移栽成活三倍体 349 个，四倍体 98 个。对 W. 默科特 × NH 组合 89 个株系的三倍体
的 SSR 分子鉴定表明，所有三倍体后代均为双亲的有性杂种。
关键词：柑橘；三倍体；有性杂交；倍性分析；SSR 分子标记
中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）04-0613-08

High Efficient and Extensive Production of Triploid Citrus Plants by
Crossing Polyembryonic Diploids with Tetraploids
XIE Kai-dong1，WANG Xiao-pei1，WANG Hui-qin1，LIANG Wu-jun1，Xie Zong-zhou1，GUO Da-yong1，
YI Hua-lin1，DENG Xiu-xin1，GROSSER Jude W.2，and GUO Wen-wu1,*
（1Key Laboratory of Horticultural Plant Biology（Ministry of Education）/Key Laboratory of Central China Horticultural
Crop Biology and Germplasm Enhancement（Ministry of Agriculture），Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，
China；2Citrus Research and Education Center，University of Florida，Lake Alfred，FL 33850，USA）
Abstract：In the four successive years from 2009 to 2012，to obtain triploid citrus hybrids，eight elite
polyembryonic diploid female parents were crossed respectively with five allotetraploid somatic hybrids
and one autotetraploid. A total of 4 442 flowers were pollinated in 15 crosses，from which 1 484 fruits were
set，with an average fruit setting rate as 33.4%. As much as 12 578 immature seeds from 1 075 young fruits
were cultured in vitro. After shooting and rooting induction，2 832 plants were regenerated，in which 401
and 121 plants proved to be triploids and tetraploids respectively by flow cytometry analysis. Up to 349
triploids and 98 tetraploids survived in the greenhouse after transplantation into greenhouse. The Simple
sequence repeat（SSR）markers analysis showed that all of the 89 triploids derived from the cross of W.
Murcott × NH were hybrids of both parents.
Key words：citrus；triploid；interploid hybridization；ploidy analysis；SSR marker

614 园 艺 学 报 41 卷
三倍体柑橘果实一般无核。由于倍性增加，三倍体果实一般较大，对外界环境也有较强的适应
性。培育柑橘三倍体是获得品质优良且无核新品种的一条有效途径。通过倍性杂交可以培育柑橘三
倍体，其中又以单胚性二倍体品种为母本与四倍体杂交最普遍（Ollitrault et al.，2008）。培育柑橘三
倍体最成功的例子是以单胚无酸柚为母本与四倍体马叙葡萄柚杂交得到的两个无核推广品种
‘Oroblanco’和‘Melgold’（Soost & Cameron，1980，1985）。意大利自 1978 年开始柑橘三倍体培
育研究，主要以单胚性二倍体为母本与同源四倍体杂交，成功培育了‘Tacle’、‘Clara’、‘Camel’
和‘Reale’4 个三倍体品种（Recupero et al.，2005）。西班牙以二倍体为母本与同源四倍体杂交，
从 77 个杂交组合中获得了 4 400 余株三倍体，并从中选出一个品质优良的无核品种‘IVIA-600’
（Aleza et al.，2012a）。美国以单胚的二倍体为母本与异源四倍体体细胞杂种倍性杂交，获得了 12 000
余株三倍体，部分三倍体已渡过童期进入田间评价阶段（Grosser & Gmitter，2011）。华中农业大学
早期以沙田柚、HB 柚及宜昌橙等单胚品种为母本与异源四倍体体细胞杂种倍性杂交，获得了一批
三倍体植株（邓秀新 等，1996；伊华林和邓秀新，1998；宋健坤 等，2005，2012），为无核柑橘品
种选育奠定了种质基础，也为三倍体育种技术路线的进一步优化提供了参考。
柑橘中，除枸橼、柚、克里曼丁橘和一些宽皮橘杂种外，大部分基因型为多胚品种（Aleza et al.，
2012b）。以单胚品种为母本培育出了一些新品种，但仅以单胚品种为母本往往难以满足所有育种目
标的要求，因为许多优良性状往往存在于多胚品种。长期以单胚性品种为母本的结果是导致现今培
育出的柑橘品种遗传背景比较狭窄（邓秀新，2005）。幼胚挽救培养技术可将幼胚离体培养，有效提
高合子胚的存活率（Viloria & Grosser，2005）。因此，幼胚挽救培养技术应用于多胚品种为母本的
杂交育种，可极大地提高三倍体育种效率。
本研究中主要选取一些多胚、有籽，但品质优良的特色品种为母本，与近年始花的 5 个四倍体
体细胞杂种和 1 个同源四倍体为父本杂交，结合幼胚挽救培养技术，获得一定数量且具有丰富遗传
变异的三倍体植株，为柑橘无核品种选育和相关基础研究奠定材料基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2009—2012 年以柑橘 8 个多胚性二倍体品种为母本与 5 个异源四倍体体细胞杂种和 1 个同源四
倍体（表 1）杂交，共配置 15 个杂交组合（具体杂交组合见表 3）。部分四倍体由美国佛罗里达大学

表 1 用于倍性杂交的试验材料
Table 1 Citrus genotypes used in 2x × 4x hybridizations
母本（拉丁名）Female parents（Scientific name） 父本（拉丁名）Male parents（Scientific name）
早金甜橙 Early Gold sweet orange
（Citrus sinensis L. Osbeck）
NS[Nova 橘柚 + 无酸甜橙（C. reticulata Blanco × C. paradisi Macf.）+ C.
sinensis L. Osbeck]
尤力克柠檬 Eureka lemon
（C. limon L. Burm. f.）
NH[Nova 橘柚 + HB 柚（C. reticulata Blanco × C. paradisi Macf.）+ C. grandis
L. Osbeck]
红橘 Red tangerine（C. reticulata Blanco） SD[无酸甜橙 + 丹西橘（C. sinensis L. Osbeck + C. reticulata Blanco）]
鄂柑一号椪柑 Egan 1 ponkan
（C. reticulata Blanco）
PO[Page 橘柚 + Ortanique 橘橙（C. reticulata Blanco × C. paradisi Macf.）+（C.
reticulata Blanco × C. Sinensis L. Osbeck）]
W. 默科特橘橙 W. Murcott tangor
（C. reticulata Blanco × C. sinensis L. Osbeck）
SP[无酸甜橙 + Page 橘柚 C. sinensis L. Osbeck +（C. reticulata Blanco × C.
paradisi Macf.）]
日辉橘 Sunburst tangerine（C. reticulata Blanco） 同源四倍体‘Femminello’柠檬（C. limon L. Burm. f.）
锦橙 Jincheng sweet orange（C. sinensis L. Osbeck）
本地早橘 Bendizao tangerine（C. succosa Hort. ex Tanaka）
注：本地早橘为单、多胚混合品种。
Note：Bendizao tangerine is a cultivar with a mixture of monoembryonic and polyembryonic seeds.
4 期 解凯东等：以柑橘多胚性二倍体母本倍性杂交培育三倍体 615

表 2 3 对 SSR 引物序列
Table 2 Sequences of 3 pairs of SSR primers
引物名称
SSR name
引物序列
Sequence of primers
来源
Reference
Csin0341 ACAGTGTGTCCGCATGAAAA
ATTTCCTTCACAACCGTGCT
Xu et al.，2013
Ma3-85 TCTAACCCAAAAATCTGCCG
AGGGGCTTAGAGAACGTGGT
Xu et al.，2013
Ma3-39 GGTTCAACCCATTGCTCTTC
CGGGCAGAGGTCATATTCAC
Xu et al.，2013

柑橘研究与教育中心引进。每年柑橘初花期采集父本花朵制备花粉，烘干避光 4 ℃保存。盛花期前
期选取树势健壮、花量大的树人工授粉。授粉地点为华中农业大学柑橘种质资源圃。
1.2 胚挽救
胚挽救参照宋健坤等（2005）的方法并适当修改。授粉后 70 ~ 100 d，每隔 5 d 取 1 次果，暂置
于 4 ℃保存。
无菌条件下，75%的酒精浸泡幼果 15 min，立即置于酒精灯上燃烧消毒，酒精燃烧完全后用手
术刀将果实剥开，取出种子。将种子顶部去除并将其插入到萌发培养基（MT 培养基 + 1 mg · L-1
GA3），置于培养室培养。培养 1 个月后，将形成的胚状体置于生芽培养基（MT + 0.5 mg · L-1 BA + 0.5
mg · L-1 KT + 0.1 mg · L-1 NAA + 40 g 蔗糖 + 8 g 琼脂）中增殖生芽，待其长出 2 ~ 3 片叶后将茎切下，
放入生根培养基（1/2 MT + 0.1 mg · L-1 IBA + 0.5 mg · L-1 NAA + 0.5 g · L-1 活性炭 + 8 g 琼脂）中诱
导生根。培养条件：温度：（25 ± 1）℃，湿度 70%左右，每天光照 16 h。
1.3 植株倍性检测
参照张俊娥等（2003）的方法并适当修改。以二倍体植株为对照，取待测样品 0.5 cm2 大小的幼
叶于塑料皿，加入约 400 μL 的提取缓冲液（Partec HR-A），用刀片将其切碎，放置 30 s 后加入 1.6 mL
的 DNA 染色液（Partec HR-B），最后用 30 μm 的微孔滤膜将样品过滤到 2.5 mL 的试管中，用流式
细胞仪（Partec，Cyflow space，Germany）上样检测。DNA 含量分布曲线由 FloMax 软件自动生成。
1.4 植株移栽
移栽前将植株置于试管中室温下敞开炼苗 3 ~ 5 d，将其移入带有培养土的小塑料杯，上面罩一
个钻孔的塑料杯保湿。室温下放置 1 个月后移入温室。移入温室后，加强苗期管理，保证小苗的正
常生长。
1.5 SSR 分子鉴定
提取基因组 DNA（Cheng et al.，2003），用 NanoDroP 1000 紫外分光光度计（Thermo Scientific，
USA）和 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和质量。用 TE 缓冲液将 DNA 原液浓度稀释到 50 ng · μL-1，
置于–40 ℃冰箱保存备用。
SSR 引物（表 2）来自 Xu 等（2013），由
上海 Sangon 公司合成。分析方法参照 Kijas 等
（1997）和庞晓明等（2003）的报道，并适当
修改。
PCR 反应体系为 20 μL：10 × Taq Buffer 2
μL，25 mmol · L-1 MgCl2 2 μL，2 mmol · L-1
dNTP 1.2 μL，正向引物 0.3 μL，反向引物 0.3
μL，5 Uit Taq 酶（Promega 公司生产）0.2 μL，
模板 DNA 2 μL，灭菌双蒸水 12 μL。扩增反应
在 PTC-200 PCR 仪（MJ. Research Inc.）上进行。94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 60 s；55 ℃退火
30 s；72 ℃延伸 60 s；34 个循环；72 ℃延伸 7 min；最后 4 ℃保存。
扩增产物经 95 ℃加热变性 5 min 后在恒定功率 80 W 条件下，6%聚丙烯酰胺凝胶上电泳约 1 h
后银染。

616 园 艺 学 报 41 卷
2 结果与分析
2.1 授粉、胚挽救及植株再生
由表 3 可知，不同组合间坐果数表现出明显的差异，W. 默科特橘橙 × SD 的坐果数最多，为
224 个，坐果率 77.0%；红橘 × SD 的坐果数最少，仅 12 个，坐果率 8.8%，各组合平均坐果率 33.4%。
经胚挽救（图 1），2009 年共挽救两个组合 55 个果实，获得种子 640 粒，经培养获得再生植株
256 个株系；2010 年挽救 4 个组合 213 个果实，培养种子 2 138 粒，萌发种子 572 粒，平均萌发率
26.8%，获得再生植株 550 个株系；2011 年挽救 4 个组合 353 个果实，培养种子 3 350 粒，萌发种
子 713 粒，平均萌发率 21.3%，获得再生植 470 个株系；2012 年挽救 5 个组合 454 个果实，培养种
子 6 450 粒，经培养萌发种子 2 821 粒，平均萌发率 43.7%，获得再生植株 1 556 个株系。

表 3 2009—2012 年杂交组合与植株再生结果
Table 3 The results of embryo rescue，plant regeneration and ploidy determination in 2009—2012
再生植株数
Plantlet number

移栽成活株数
Plants in
greenhouse 年份
Year
杂交组合
Crosses
授粉
花数
Flower
number
坐果数
Fruit
number
挽救果实数
Fruit number
for rescue
种子数
Seed
number
萌发种子数
Germinated
seed
number 总和
Total
3x 4x 3x 4x
红橘 × SD
Red tangerine × SD
136 12 12 159 – 37 2 0 2 0 2009
早金甜橙 × NS
Early Gold sweet
orange × NS
223 43 43 481 – 219 4 2 4 2
尤力克柠檬 ×
‘Femminello’（4x）
Eureka lemon ×
Femminello lemon（4x）
265 82 49 898 121 115 42 26 26 23
鄂柑一号椪柑 × NS
Egan 1 ponkan × NS
319 58 58 408 161 157 1 3 1 1
早金甜橙 × SD
Early Gold sweet
orange × SD
173 106 58 559 245 238 3 5 1 3
2010
本地早橘 × SD
Bendizao tangerine × SD
224 48 48 273 45 40 12 0 10 0
W. 默科特橘橙 × NS
W. Murcott tangor × NS
289 189 119 1 157 282 162 56 19 48 16
W. 默科特橘橙 × SD
W. Murcott tangor × SD
291 224 124 1 423 220 193 89 19 77 14
本地早橘 × PO
Bendizao tangerine × PO
270 44 44 235 24 18 9 1 9 1
2011
鄂柑一号椪柑 × SD
Egan 1 Ponkan × SD
258 77 66 535 187 97 1 1 1 1
W. 默科特橘橙 × SP
W. Murcott tangor × SP
431 209 112 1 674 856 534 49 9 43 8
W. 默科特橘橙 × NH
W. Murcott tangor × NH
403 111 97 1 382 761 455 93 21 89 20
日辉橘 × NS
Sunburst tangerine × NS
394 83 72 1 757 792 381 3 13 3 7
锦橙 × NS
Jincheng orange × NS
323 108 87 609 100 40 0 0 0 0
2012
红橘 × NS
Red tangerine × NS
443 90 86 1 028 312 146 37 2 35 2
总计 Total 4 442 1 484 1 075 12 578 – 2 832 401 121 349 98
4 期 解凯东等：以柑橘多胚性二倍体母本倍性杂交培育三倍体 617

图 1 胚挽救、植株再生及移栽
A：W. 默科特橘橙 × SD 授粉后 80 d 的种子（下）及未人工授粉的种子（上）；B：接种于萌发培养基上的种子；
C：种子在培养基上形成的胚状体；D：经生根培养形成的三倍体完整植株；
E：移入小塑料杯中的三倍体；F：成功移入温室的三倍体群体。
Fig. 1 Embryo rescue，plant recovery and transplantation
A：Seeds obtained from hybridization of W. Murcott tangor × SD 80 d after pollination（down）and open pollinated seeds（upper）；
B：Seeds cultured in medium for germination；C：Germinated embryos on the medium；
D：A triploid seedling in rooting medium；E：A triploid seedling in plastic cup；
F：The triploid plant population in greenhouse.

2.2 倍性分析及植株移栽
用流式细胞仪对所有组合的所有再生植株进行了倍性鉴定（图 2）。

图 2 二倍体与三倍体再生植株混样（A）以及二倍体与四倍体再生植株混样（B）的倍性分析
Fig. 2 Ploidy analysis of regenerated triploid（A）and tetraploid（B）plants
with diploid plant as control by flow cytometry

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2009 年两个杂交组合获得的 256 个再生株系中，经检测得到三倍体 6 个株系，占 2.3%；四倍体
2 个株系，占 0.8%；移栽成活的三倍体有 6 个株系，四倍体 2 个株系，平均移栽成活率 100%。
2010 年 4 个组合获得的 550 个再生株系中，得到三倍体 58 个株系，占 10.6%；四倍体 34 个株
系，占 6.2%；移栽成活的三倍体有 38 个株系，四倍体 27 个株系，平均移栽成活率 70.7%。
2011 年 4 个组合获得的 470 个株系中，得到三倍体 155 个株系，占 33.0%；四倍体 40 个株系，
占 8.5%；移栽成活的三倍体 135 个株系，四倍体 32 个株系，平均移栽成活率 85.6%。
2012 年 5 个组合获得的 1 556 个再生株系中，除锦橙 × NS 未获得多倍体外，其余 4 个组合共
得到三倍体 182 个株系，占 11.7%；四倍体 45 个株系，占 2.9%；移栽成活的三倍体有 170 个株系，
四倍体 37 个株系，平均移栽成活率 91.2%。
目前，上述所有成活的三倍体（图 1，F）、四倍体植株均已全部移入温室，部分株系已嫁接于
田间。
2.3 三倍体后代 SSR 分析
用 3 对 SSR 引物对 W. 默科特橘橙 × NH 组合的 89 个株系三倍体后代进行了分子鉴定，图 3
为引物 Ma3-39 的部分三倍体后代的扩增图谱，89 个三倍体株系均含有父本特异条带，表明其均为
双亲的有性后代。
图 3 引物 Ma3-39 对 W. 默科特橘橙 × NH 组合三倍体的扩增图谱
1：W. 默科特橘橙；2：NH；3 ~ 30：三倍体后代。
Fig. 3 The SSR profile of triploids obtained from W. Murcott tangor × NH by Ma3-39 marker
1：W. Murcott tangor；2：NH；3–30：Triploid progenies obtained from W. Murcott tangor × NH.

3 讨论
三倍体育种除获得无核果实外，还希望其能同时具备其它优良性状。意大利采用三倍体育种，
希望选育出无核、易剥皮的宽皮橘新品种，用于取代多籽品种‘Avana’和‘Tardivo di Ciaculli’（Fatta
Del Bosco et al.，2007）；西班牙则主要针对无核、成熟期等目标进行柑橘遗传改良，并成功获得了
1 个中晚熟品种‘Safor’（Cuenca et al.，2010）和 1 个晚熟品种‘Garbí’（Aleza et al.，2010）。倍性
增加也会导致三倍体表现出一些不良性状，如果面粗糙、果皮变厚、枝刺增多、变长等。Grosser
和 Gmitter（2011）发现以单胚的‘克里曼丁橘’为母本获得的三倍体后代常表现出结果晚、枝刺长
等不良性状；而以‘Sugar Belle’为母本的三倍体则表现出结果早、枝刺短的优良性状。因此，杂
交亲本的选择对后代性状的表现至关重要。本研究中所选的二倍体亲本为品质优良的地方品种，四
倍体亲本也综合了融合双亲的优良性状，从其杂交三倍体后代中选育出果实性状优良的无核品种是
完全可能的。
由于存在珠心胚干扰现象，柑橘常规杂交育种中，珠心胚的发生早于合子胚，与合子胚竞争营
养与空间，常导致合子胚的败育（Koltunow，1993），是多胚品种用于杂交育种的最大阻碍。但柑橘
4 期 解凯东等：以柑橘多胚性二倍体母本倍性杂交培育三倍体 619

许多优良性状存在于多胚品种，供选择的育种亲本类型较多，因此多胚品种在柑橘三倍体无核品种
选育中应用潜力巨大。宋健坤等（2005）以单、多胚混合型品种‘本地早橘’、多胚品种‘中秋橘’
和‘国庆 4 号’温州蜜柑为母本与异源四倍体体细胞杂种倍性杂交，经胚挽救，每个组合都获得了
三倍体植株。本试验中，除锦橙 × NS 组合外，其余 14 个杂交组合均获得了三倍体株系。用 3 对
SSR 引物对 W. 默科特橘橙 × NH 杂交组合的 89 个株系三倍体后代进行了分子鉴定，所有三倍体后
代均为双亲的有性后代。这些三倍体为未来柑橘无核品种选育奠定了坚实的材料基础。由表 3 可知，
不同基因型间三倍体获得率差异明显，以尤力克柠檬、W. 默科特橘橙、本地早橘等为母本的杂交
组合比较容易获得三倍体；而以鄂柑一号椪柑、锦橙、早金甜橙、日辉橘为母本的组合，其三倍体
获得率较低，可能与不同品种的多胚性程度有关。
本研究中不仅获得了三倍体，还意外获得了 12 个杂交组合 121 个株系四倍体。由于母本为多
胚品种，有文献报道珠心胚在自然条件下可加倍形成同源四倍体（Aleza et al.，2011）。因此，这些
四倍体可能来自珠心胚自然加倍形成的同源四倍体。Aleza 等（2011）认为多胚品种中，珠心胚自
然加倍与柑橘基因型和环境有关，低温有利于珠心胚自然加倍。Aleza 等（2012a）报道 2x × 4x 杂
交育种中，饱满种子再生的植株中约 40%为四倍体。Esen 和 Soos（1973）认为这些四倍体由母本产
生未减数的雌配子与二倍体花粉授粉受精而来。因此，这些四倍体后代也可能是母本产生的 2n 雌配
子与正常二倍体花粉受精的结果。
本研究中所获得的四倍体是来自珠心胚自然加倍，还是来自母本形成 2n 雌配子与正常二倍体
花粉受精，有待进一步试验验证。

References
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