全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（4）：687–700 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–12–26；修回日期：2014–03–06
基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金项目（DL10CA03）；国家自然科学基金项目（J1210053）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：xuzhiru2003@126.com；lyhshen@126.com）
芜菁二氢黄酮醇 4–还原酶基因的克隆与功能
鉴定
许志茹，刘 通，崔国新，李春雷，马 静，李玉花*
（东北林业大学生命科学学院，林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040）
摘 要：二氢黄酮醇 4–还原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）是花青素生物合成晚期阶段的
关键酶，属于 NAD/NADP 依赖型还原酶家族，催化从二氢黄酮醇转变成无色花色素苷的反应。利用 UV-A
处理‘津田’芜菁（‘Tsuda’turnip）和‘赤丸’芜菁（‘Yurugi Akamaru’turnip）块根 24 h 后提取总 RNA，
通过 RT-PCR 方法分别克隆了‘津田’芜菁 BrDFR1 和‘赤丸’芜菁 BrDFR2 基因。BrDFR1 和 BrDFR2
的开放读码框分别为 1 158 bp 和 999 bp，分别编码 385 和 332 个氨基酸。氨基酸序列分析显示，BrDFR1
和 BrDFR2 与大白菜 DFR 具有高度同源性，从第 8 到第 302 位氨基酸的肽段具有 FR_SDR_e 结构域。
BrDFR1 和 BrDFR2 基因组全长序列均含有 5 个位置与序列完全相同的内含子。Southern 杂交结果显示，
‘津田’芜菁 BrDFR1 和‘赤丸’芜菁 BrDFR2 基因均为单一拷贝。UV-A 可以诱导 BrDFR1 基因表达，
对 BrDFR2 基因表达的诱导效果不明显。BrDFR1 和 BrDFR2 基因在大肠杆菌细胞中可以表达并纯化出分
子量约为 42.8 kD 的 BrDFR1 蛋白和 37.5 kD 的 BrDFR2 蛋白。过量表达 BrDFR1 和 BrDFR2 基因的烟草
花色加深。芜菁 DFR 基因的 RNAi 载体遗传转化烟草后，转基因植株的花色变浅。这些工作将为阐明依
光型和非依光型花青素生物合成机理奠定研究基础。
关键词：芜菁；二氢黄酮醇 4–还原酶基因；基因克隆；遗传转化；功能鉴定
中图分类号：S 631.3 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）04-0687-14

Cloning and Function Identification of Dihydroflavonol 4-reductase Genes
in Turnip
XU Zhi-ru，LIU Tong，CUI Guo-xin，LI Chun-lei，MA Jing，and LI Yu-hua*
（College of Life Sciences，State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，Northeast Forestry University，Harbin
150040，China）
Abstract：Dihydroflavonol 4-reductase（DFR）is the critical catalyze enzyme in the later stage of
anthocyanins biosynthesis ， which belongs to a large redox enzyme superfamily that shares a
Rossmann-fold NAD(P)H/NAD(P)(+) binding（NADB）domain. DFR catalyzes the reaction from
dihydroflavonol to unstable leucoanthocyanidin. The roots of‘Tsuda’turnip and‘Yurugi Akamaru’turnip
were irradiated with UV-A light for 24 h. Total RNA was isolated，and then BrDFR1 and BrDFR2 genes
were cloned by RT-PCR method. The open reading frame（ORF）of BrDFR1 and BrDFR2 genes contained
1 158 bp and 999 bp encoding proteins of 385 and 332 amino acids respectively. Amino acid sequence

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analysis showed that BrDFR1 and BrDFR2 have high homology with DFR of Brassica rapa subsp.
pekinensis. The FR_SDR_e domain was in the amino acid sequence from 8 to 302 of BrDFR1 and
BrDFR2. The whole genome sequences of BrDFR1 and BrDFR2 had five introns with the same location
and sequence. Southern blotting result showed that the copy of BrDFR1 and BrDFR2 in‘Tsuda’turnip and
‘Yurugi Akamaru’turnip genome is only one. Northern blotting result indicated that the expression of
BrDFR1 could be induced by irradiation of UV-A，and the expression of the gene was correlated with
light-exposure time. The induction of UV-A irradiation on the expression of BrDFR2 gene was
indistinctively. The 42.8 kD and 37.5 kD proteins of BrDFR1 and BrDFR2 were successfully purified after
BrDFR1 and BrDFR2 genes expressed in E.coli cell，respectively. The color of the flowers from BrDFR1
and BrDFR2 over-expressed tobacco plants was darker than that of wild type. The transgenic plants with
light-colored flowers were obtained after the RNAi vector containing the DFR gene fragment of turnip was
introduced. The present study will establish the experiment foundation for preliminarily clarifying the
mechanism of light-dependent and light-independent anthocyanin biosynthesis.
Key words：turnip；dihydroflavonol 4-reductase gene；gene clone；genetic transformation；function
identification

花青素是植物重要的次生代谢产物，在花色和果色的形成、防御紫外线损伤和植物病原体侵害
等方面发挥重要作用（Tanak et al.，2008；张龙 等，2008）。目前，很多植物花青素合成的代谢途
径及相关基因的表达特性已经明确（Forkmann，1991；Niu et al.，2010），但其合成的调控机理还在
探索中。
花青素的生物合成受一系列酶催化，二氢黄酮醇 4–还原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）
是二氢黄酮醇转变成无色花色素苷一系列反应中的第 1 个催化酶，可以催化二氢栎皮黄酮（DHQ）、
二氢堪非醇（DHK）和二氢杨梅黄酮（DHM）分别生成无色花青素、无色花葵素和无色翠雀素。在
此基础上进而形成红色花青素糖苷、砖红色花葵素糖苷和蓝紫色翠雀素糖苷，使花和果实呈现不同
的颜色（Shimada et al.，2005）。目前已经从多种植物中克隆了 DFR 并研究了其表达特性（Shimada
et al.，2004，2007；Shih et al.，2008；胡可 等，2009）。例如，百脉根（Lotus japonicus）中 DFR
家族有 5 个成员，在积累原花色素 PA 的组织中 DFR2 特异表达；机械损伤可以诱导 DFR1、DFR2
和 DFR3 表达；转录因子 MYB、bHLH 和 WDR 复合物只能激活 DFR2 启动子表达（Yoshida et al.，
2010）。水母雪莲花的 SmDFR 只能还原 DHQ 和 DHK；SmDFR 基因在花中表达量最高，在叶片和
根中低量表达（Li et al.，2012a）。
不同植物 DFR 的功能研究也取得了一定进展。过量表达蒺藜苜蓿 MtDFR1、大白菜 DFRBra、毛
果杨 PtrDFR1 基因的烟草花中大量积累了花青素，花色加深（Xie et al.，2004；Lee et al.，2008；
Huang et al.，2012）。蓝眼菊（Osteospermum hybrida）的 DFR 不能催化 DHK，体内类黄酮 3′,5′羟
化酶（F3′5′H）的存在可以形成飞燕草花色素苷，使花呈青蓝色；蓝眼菊表达非洲菊 DFR 基因（能
够催化 DHK）、同时自身的 F3′5′H 基因沉默后，花中积累了大量花葵素糖苷，呈微红色（Seitz et al.，
2007）。蓝色花夏堇的内源 F3′H 和 F3′5′H 基因被敲除后，增加了花葵素含量，开灰粉色花。这些植
株中如果再表达玫瑰的 DFR 基因，则可提高花葵素含量，产生深粉色花。利用天竺葵 DFR 代替玫
瑰 DFR 基因，也可以增加花葵素含量，使花瓣粉色加深。将这两种 DFR 基因导入开紫罗兰色花夏
堇中，也可增加花葵素含量，从而获得粉色花（Nakamura et al.，2010）。
花青素合成及 DFR 基因的表达还需要转录因子调控（Ramsay & Glover，2005；韩科厅 等，2012；
Schaart et al.，2013；Tereshchenko et al.，2013）。拟南芥中 MYB 的低量表达降低了 DFR 基因的表
4 期 许志茹等：芜菁二氢黄酮醇 4–还原酶基因的克隆与功能鉴定 689

达（Gonzalez et al.，2008）。矮牵牛转录因子基因 DPL 和 PHZ 的过量表达增强了矮牵牛花和叶中
DFR 等基因的表达（Albert et al.，2011）。油菜的转录因子 BnTT16s 可以调控花青素合成途径中 DFR
等基因的表达（Chen et al.，2013）。另外，花和果实中花青素的生物合成与光照密切相关（Chatterjee
et al.，2006；孟祥春 等，2007）。紫外线也可以调节植物中花青素的合成（Guo et al.，2008；Kim et
al.，2008；Xie et al.，2011）。综上所述，花青素的生物合成主要取决于催化酶和调控因子基因的表
达，同时还涉及特定的光信号传导途径。
芜菁（Brassica campestris L. ssp. rapifera Metzg.）别名蔓菁，十字花科芸薹属芜菁亚种。‘津田’
芜菁（‘Tsuda’turnip）块根着色属于依光型，受光一侧合成花青素糖苷，呈紫红色，背阴一侧无花
青素合成，呈白色。‘赤丸’芜菁（‘Yurugi Akamaru’turnip）块根着色属于非依光型，无论有光与
否块根均呈红色。本研究中克隆了这两种芜菁的 DFR 基因全长 cDNA 序列，并确定了 DFR 基因的
拷贝数、基因组序列的内含子数及 DFR 基因的表达特性；在大肠杆菌细胞中表达并纯化了两种芜菁
的 DFR 蛋白；遗传转化烟草后鉴定了‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁 DFR 基因的功能。这些工作将
为探讨非依光型和依光型花青素合成机理，通过转基因手段人为控制花卉和果实着色奠定研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料
2012 年于东北林业大学生命科学学院温室种植‘津田’和‘赤丸’芜菁，使其块根始终在土中
避光生长。块根膨大 60 d 后，利用波长为 352 nm 的 UV-A（光照强度为 13.5 μmol · m-2 · s-1）处理
块根 0、6、12、18、24 和 48 h。
1.2 引物序列与试剂
在 Database 数据库中查找已经登录的 DFR 基因，选取拟南芥的基因序列设计 RT-PCR 引物。引
物序列 F：5′-TAATGGTAGCTCACAAAGAGAC-3′，R：5′-TCGGGTTCAATTTCTAAGCA-3′。Southern
和 Northern 杂交探针合成的引物序列 F：5′-ATGGGATTTAACTTCAAGTATAGTCTCG-3′，R：5′-CCC
TGGTTCGGTCTTCTTAC-3′。构建原核表达载体的引物序列为：F1：5′-CCATATGATAATGGTAGC
TCACAAAGAGAC-3′，R1：5′-GCCGCTCGGGTTCAATTTCTAAG-3′；F2：5′-GGAATTCCATATGATA
ATGGTAGCTCACA-3′，R2：5′-TAAAAGTTGCGGCCGCTCGGGT-3′。
根据 Gateway 试剂盒的要求设计引物。过量表达载体的引物序列为：F1：5′-AAAAAGCAGGC
TTAATGGTAGCTCACAAAGAGAC-3′，R1：5′-AGAAAGCTGGGTTCGGGTTCAATTTCTAAGCA-3′；
F2：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3′，R2：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAA
GCTGGGT-3′。在 GenBank 中查找烟草 DFR mRNA 序列（No. EF421430.1），Blast 比对芜菁 DFR
基因与此基因的同源性，选择同源性较高的区域作为干涉区段（353 bp）并设计引物；序列为：F1：
5′-AAAAAGCAGGCTATCAGGATTCATCGGTTCA-3′，R1：5′-AGAAAGCTGGGTTTCCAGCAGAC
GAAGTAAA-3′；F2 和 R2 引物序列与过量表达的 F2 和 R2 序列相同，即为 attB 接头引物。
相关试剂：PowerScriptTM Reverse Transcriptase 购自 Clontech 公司；分子杂交部分试剂购自 Roche
和 GE 公司；原核表达蛋白纯化柱 HisTrapTMHP 购自 GE 公司；Gateway 试剂盒购于 Invitrogen 公司；
LA Taq DNA 聚合酶及 DNA Marker 购自宝生物（大连）工程有限公司；dNTP 和内切酶购自 TOYOBO
公司；大肠杆菌感受态细胞、pBS-T 载体、质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购自北京天根生化有
限公司。
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1.3 DFR 全长 cDNA 的克隆及序列分析
提取 UV-A 处理 24 h 的‘津田’和‘赤丸’芜菁块根皮总 RNA 进行 RT-PCR 反应。PCR 纯化
产物连接转化后经抗性及蓝白斑筛选获得单克隆。培养白色菌斑并提取质粒，PCR 验证。测序。
在 NCBI 数据库中比对测定的两种芜菁 DFR 全长 cDNA 序列并查找开放阅读框（ORF）。利用 BioEdit
软件比较两种芜菁 DFR 的异同。进行 DFR 蛋白的多序列比较，绘制分子进化树。利用 ExPASy
Proteomics tools 预测 DFR 蛋白的信号肽、分子量、等电点、稳定性、氨基酸组成和二级结构。
1.4 BrDFR1 和 BrDFR2 基因组序列内含子的确定
利用两种芜菁块根皮总 DNA 和 RT-PCR 引物扩增 BrDFR1 和 BrDFR2 的基因组全长序列。PCR
产物回收、连接、转化并提取质粒。质粒 PCR 验证正确后测序。比对基因组序列和 cDNA 序列，确
定内含子及其数量。
1.5 分子杂交鉴定 DFR 基因的拷贝数及表达特性
提取‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁块根皮总 DNA。用地高辛标记探针。通过 Southern 杂交检测
两种芜菁中 DFR 基因的拷贝数。重复 1 次。提取 UV-A 处理 0、6、12、18、24 和 48 h 的芜菁块根
皮总 RNA。通过 Northern 杂交检测两种芜菁中 DFR 基因的表达特性（许志茹和李玉花，2006）。重
复 2 次。
1.6 BrDFR1 和 BrDFR2 基因的原核诱导表达
通过两次 PCR 反应将含有 NdeⅠ和 NotⅠ酶切位点的引物序列加到两种芜菁 DFR 基因的两侧。
利用 NdeⅠ和 NotⅠ酶切 PCR 纯化产物和载体 pET-14b。目的片段回收后连接并转化 DH5α 感受态
细胞。提取质粒，PCR、酶切及测序验证。利用正确的质粒转化大肠杆菌 BL21，PCR 验证。利用
1 mmol · L-1 的 IPTG 诱导目的蛋白表达，SDS-PAGE 电泳检测诱导结果。大量诱导后利用
HisTrapTMHP（GE Healthcare）HIS 标签亲和层析柱纯化 BrDFR1 和 BrDFR2 蛋白，电泳检测。
1.7 BrDFR1 和 BrDFR2 基因遗传转化烟草及功能验证
1.7.1 BrDFR1 和 BrDFR2 基因过量表达载体和 RNAi 载体的构建
通过 PCR 反应在 BrDFR1、BrDFR2 的 cDNA 序列和干涉片段的两侧引入 attB 位点。PCR 产物
纯化后进行 BP 反应。反应产物转化、提取质粒并进行 PCR 检测、测序鉴定。选取正确的 entry 克
隆进行 LR 反应。反应产物转化、提取质粒并进行 PCR 检测和酶切鉴定。正确的质粒即为过量表达
载体和 RNAi 载体。通过电转法将构建的载体转入农杆菌 EHA105 中。挑取菌斑培养后提取质粒并
进行 PCR 检测，即可获得含有过量表达载体和 RNAi 载体的农杆菌菌株。
1.7.2 农杆菌介导法遗传转化烟草
将烟草无菌苗叶片剪成小块（带有较粗叶脉）。叶盘在 OD600 = 0.2 ~ 0.3 的农杆菌菌液中侵染 2
min 后置于无菌滤纸上吸干多余菌液，接种于 MS 培养基上，28 ℃黑暗条件共培养 2 d。用含 400
mg · L-1头孢霉素的无菌水冲洗共培养后的外植体 3 ~ 5次，吸干水分后转到脱菌培养基（MS + BA 2.0
mg · L-1 + NAA 0.2 mg · L-1 + Cef 400 mg · L-1）上，25 ℃培养 2 ~ 3 周。当外植体长出良好的愈伤组
织后转入分化筛选培养基（MS + BA 2.0 mg · L-1 + NAA 0.2 mg · L-1 + Cef 400 mg · L-1 + Hyg 20
mg · L-1）中。待不定芽长到 1 cm 以上时，切割不定芽接种到生根培养基（1/2MS + IBA 0.5 mg · L-1 +
Cef 400 mg · L-1 + Hyg 20 mg · L-1）中诱导生根。

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图 1 ‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁 DFR 基因的 RT-PCR 结果
Fig. 1 RT-PCR result of DFR genes in‘Tsuda’and
‘Yurugi Akamaru’turnip
1.7.3 转基因植株的分子及表型鉴定
提取转基因烟草幼苗和野生型叶片总 DNA，利用 RT-PCR 引物进行 PCR 检测。通过 Southern
杂交鉴定 BrDFR1 和 BrDFR2 在烟草基因组中的整合情况。提取转基因植株和野生型花瓣总 RNA
进行 Northern 杂交，检测转基因植株中芜菁 DFR 的表达。观察转基因烟草植株花色的变化。
2 结果与分析
2.1 ‘津田’和‘赤丸’芜菁 DFR 全长 cDNA
的克隆
提取芜菁总 RNA 后进行 RT-PCR 反应，
结果如图 1 所示。‘津田’和‘赤丸’芜菁的扩
增产物在 1 200 bp 附近，分子量大小与预期结
果吻合。RT-PCR 产物经纯化、连接、转化并
提取质粒。质粒 PCR 鉴定后测序。
2.2 ‘津田’和‘赤丸’芜菁 DFR 核苷酸序列
及推断的氨基酸序列分析
‘津田’芜菁 BrDFR1 和‘赤丸’芜菁
BrDFR2 的登录号为 EU402418 和 EU402419，与大白菜[Brassica rapa ssp. pekinensis （Lour.）
Olsson]DFR mRNA 序列的同源性达 100%和 99%。BrDFR1 的 1 158 bp 编码序列含有完整的 ORF（图
2）；BrDFR1 和 BrDFR2 仅在第 979 位核苷酸上存在差异，BrDFR1 为 G，而 BrDFR2 在此位置上缺
失了 1 个核苷酸，从而导致移码突变。因此，BrDFR2 基因 999 bp 的编码序列包含完整的 ORF。

图 2 BrDFR1 基因全长 cDNA 序列和推导的氨基酸序列
阴影序列为 Northern 杂交探针序列，下划线序列为 RT-PCR 引物序列。
Fig. 2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of BrDFR1 cDNA
The shadow sequences are probe of Northern blotting，and the underlined sequences are the primer of RT-PCR.
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BrDFR1 和 BrDFR2 蛋白存在明显差异。BrDFR1 编码 385 个氨基酸；BrDFR2 编码 332 个氨基
酸，前 326 个氨基酸与大白菜 DFR 的相似性为 100%。BrDFR1 和 BrDFR2 序列在第 327 个氨基酸
之前是完全相同的。
氨基酸同源性比对显示（图 3），BrDFR1 和 BrDFR2 与多种植物 DFR 的氨基酸序列有高度同源
图 3 芜菁 BrDFR1 和 BrDFR2 与其他植物 DFR 的氨基酸序列比较
Fig. 3 Alignment of the amino acid sequences of DFR among turnip and other plants
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性，与大白菜、芥菜（Brassica juncea）、羽衣甘蓝（Brassica oleracea）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、
矮牵牛（Petunia × hybrida）、烟草（Nicotiana benthamiana）、葡萄（Vitis vinifera）、菊花（Chrysanthemum ×
morifolium）DFR 的同源性在 70% ~ 100%之间。
系统进化树显示（进化树中的数值为进化树的校验值，数值越大，进化树可信度越高），BrDFR1
和 BrDFR2 与大白菜、芥菜和羽衣甘蓝的 DFR 在进化关系上较近，与菊花、烟草和矮牵牛等植物的
DFR 在进化关系上较远（图 4）。



图 4 植物 DFR 蛋白的系统进化树
Fig. 4 Evolutionary tree of plant DFR

BrDFR1 和 BrDFR2 蛋白从第 8 到第 302 位氨基酸的肽段含有 FR_SDR_e 结构域。此结构域在
类黄酮等次生代谢途径的依赖于NADP的还原反应中发挥作用；结构域内分布着还原酶的活性位点、
NADP 结合位点和底物结合位点（图 5）。


图 5 BrDFR1 的结构域
Fig. 5 The domain of BrDFR1

ProtParam 程序预测 BrDFR1 和 BrDFR2 的分子量分别为 42.8 kD 和 37.5 kD；理论等电点分别
是 5.54 和 5.80；氨基酸组成中 Lys、Leu 分别占最大比例，均高达 8.1%；蛋白不稳定系数分别为 37.65
和 36.21，属于稳定蛋白。SignalP 3.0 Server 检测结果显示 BrDFR1 和 BrDFR2 不含信号肽序列，为
非分泌蛋白。二级结构预测表明，BrDFR1和BrDFR2中形成α螺旋的氨基酸分别占54.55%和50.30%，
形成伸展序列的氨基酸分别占 32.99%和 37.05%，形成 β 转角的氨基酸分别占 7.27%和 7.83%，形成
随意盘旋序列的氨基酸分别占 5.19%和 4.82%，两种蛋白中不含其他二级结构。
2.3 BrDFR1 和 BrDFR2 基因组序列的内含子
以两种芜菁基因组 DNA 为模板，利用 RT-PCR 引物扩增了 BrDFR1 和 BrDFR2 全长基因组序列；
测序后获得了长度分别为 1 556 bp 和 1 555 bp 的序列。BrDFR1 和 BrDFR2 全长基因组序列均包含 5
个内含子和完整的 ORF，内含子序列及位置完全相同。内含子序列符合真核生物内含子的典型边界
序列 GT-AG 法则。图 6 为 BrDFR1 的全长基因组序列。
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图 6 BrDFR1 的全长基因组序列
下划线序列为引物序列，斜体序列为起始密码子和终止密码子，阴影序列为内含子。
Fig. 6 The genome sequence of BrDFR1
The underlined sequences are the primers，the italic sequences are the initiation codon and the stop codon，
the shadow sequences are introns.

2.4 BrDFR1 和 BrDFR2 基因的拷贝数
提取两种芜菁块根皮总 DNA，酶切后进行 Southern 杂交。结果显示，‘津田’芜菁中，HindⅢ、
EcoRⅠ和 EcoRⅤ酶切总 DNA 后均检测到 1 个杂交信号，XbaⅠ酶切总 DNA 后检测到 2 个杂交信
号（图 7，A）。利用 XbaⅠ酶切其他的‘津田’芜菁株系总 DNA 后的杂交结果均可检测到 1 个杂交
信号（数据未显示）。由此推测，第 1 次杂交中 XbaⅠ酶切后检测到的 2 个杂交信号可能是由于个体
植株出现了单核苷酸多态性突变，在 BrDFR1 基因内形成了 XbaⅠ酶切位点造成的。

图 7 ‘津田’芜菁（A）和‘赤丸’芜菁（B、C）Southern 杂交结果
Fig. 7 Southern result of‘Tsuda’turnip（A）and‘Yurugi Akamaru’turnip（B，C）
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图 8 UV-A 处理 0 h 和 48 h 后 BrDFR1 和 BrDFR2 的表达
Fig. 8 Expression of BrDFR1 and BrDFR2 genes after exposed
to UV-A for 0 h and 48 h
‘赤丸’芜菁中，XbaⅠ、EcoRⅠ和 EcoRⅤ酶切总 DNA 后均检测到 1 个杂交信号，HindⅢ酶
切总 DNA 后未检测到杂交信号（图 7，B）。在‘赤丸’芜菁的另一组试验中，总 DNA 经 HindⅢ、
EcoRⅠ和 XbaⅠ酶切后可以检测到 1 个杂交信号，而 BamHⅠ酶切总 DNA 后未检测到杂交信号（图
7，C），这可能是由于样品总 DNA 酶切不完全造成的。
综合以上杂交结果，初步证实‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁中 DFR 基因均为单一拷贝。
2.5 BrDFR1 和 BrDFR2 的光诱导表达模式
UV-A 处理‘津田’和‘赤丸’芜菁块根 0
和 48 h 后检测 BrDFR1 和 BrDFR2 基因表达量
的变化。未曾见光的块根皮中 BrDFR1 不表达；
UV-A 处理 48 h 后 BrDFR1 的表达量增加。
BrDFR2 基因在未见光和 UV-A 处理 48 h 后的
块根皮中均表达（图 8）。
为了确定 BrDFR1 和 BrDFR2 基因的表达
量与光处理时间长短的关系，利用 UV-A 处理
两种芜菁不同时间后进行 Northern 杂交。结果
（图 9）显示，‘津田’芜菁未见光的块根皮中
BrDFR1 基因不表达，UV-A 处理 6 h 后表达量明显增加并达到最高水平，BrDFR1 的表达量与 UV-A
光照时间存在相关关系。‘赤丸’芜菁未见光块根皮中 BrDFR2 基因表达，UV-A 处理后 BrDFR2 基
因的表达量没有发生明显变化。由此可见，BrDFR1 和 BrDFR2 基因的 UV-A 诱导表达特性存在一
定差异。


图 9 UV-A 处理不同时间 BrDFR1 和 BrDFR2 的表达
Fig. 9 Expression of BrDFR1 and BrDFR2 after exposed to UV-A for different time

2.6 BrDFR1 和 BrDFR2 蛋白的诱导表达及纯化
通过 PCR 可在 BrDFR1 和 BrDFR2 基因两侧加上酶切位点序列。利用 Nde Ⅰ和 Not Ⅰ酶切 PCR
纯化产物及载体 pET-14b。回收目的片段，连接，转化。挑取单菌落培养，提取重组质粒。重组质
粒的 PCR 验证反应能够扩增出 1 200 bp 左右的目的条带。酶切验证结果表明（图 10），BrDFR1、
BrDFR2 重组质粒酶切后均得到两条条带，分别对应空载体的酶切产物和 DFR 基因的 PCR 产物。
由此表明原核表达重组质粒构建成功。
鉴定后的重组质粒转化 BL21。挑取单菌落扩大培养后进行菌液 PCR 检测，可以获得目的条带。
验证后进行目的蛋白的小量诱导、大量诱导并纯化目的蛋白。SDS-PAGE 电泳检测结果如图 11 所示，
箭头指示条带为纯化的 BrDFR1 和 BrDFR2 蛋白，由于融合蛋白携带 His 标签，所以分子量比预期
的分子量（42.8 和 37.5 kD）稍大。
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图 10 原核表达重组质粒的酶切鉴定
M：Marker；1：BrDFR1 重组质粒；2、6：pET-14b 酶切产物；3：BrDFR1 重组质粒酶切产物；4：PCR 产物；
5：BrDFR2 重组质粒酶切产物；7：BrDFR2 重组质粒。
Fig. 10 The digestion result of the prokaryotic expression recombinant plasmids
M：Marker；1：BrDFR1 recombinant plasmid；2，6：Digested product of pET-14b；3：Digested product of BrDFR1 recombinant plasmid；
4：PCR product；5：Digested product of BrDFR2 recombinant plasmid；7：BrDFR2 recombinant plasmid.



图 11 BrDFR1 和 BrDFR2 的诱导及纯化结果
M：Marker；1、6：诱导前样品；2、5：诱导后样品；3、4：纯化的蛋白。
Fig. 11 The result of induction and purification of BrDFR1 and BrDFR2
M：Marker；1，6：Sample before induction；2，5：Sample after induction；3，4：Purified protein.

2.7 BrDFR1 和 BrDFR2 基因表达载体的构建及功能鉴定
BrDFR1 和 BrDFR2 的 cDNA 和基因片段经过 BP 反应和 LR 反应后获得重组质粒，重组质粒
PCR 检测可以获得分子量与预期一致的片段。过量表达的 LR 重组质粒酶切验证结果（图 12）显示，
EcoRⅠ酶切重组质粒可以获得 1 个 > 10 000 bp 的片段；EcoRⅤ酶切后，空载体可以获得 > 10 000 bp、
1 716 bp 和 187 bp 的片段，重组质粒可以得到 > 10 000 bp、1 418 bp 和 187 bp 的片段；阳性对照为
DFR基因的PCR产物。酶切结果与预期相符，过量表达载体pH7DG2D-BrDFR1及pH7DG2D-BrDFR2
构建成功。
RNAi 的 LR 重组质粒酶切验证结果（图 13）显示，EcoRⅠ酶切空载体可以获得 > 10 000 bp
和 3 237 bp 的片段，酶切重组质粒只产生 > 10 000 bp 的片段。HindⅢ酶切空载体可以得到 > 10 000
bp 和 3 180 bp 的片段，酶切重组质粒可以获得 > 10 000 bp 和 2 065 bp 的片段，酶切结果与预期相
符，RNAi 载体 pH7GWIWG2(I)-DFR 构建成功。
4 期 许志茹等：芜菁二氢黄酮醇 4–还原酶基因的克隆与功能鉴定 697

图 12 BrDFR1 过量表达载体的酶切结果
M：1 kb marker；1：重组质粒的 EcoRⅠ酶切产物；
2：载体的 EcoRⅤ酶切产物；3：重组质粒的
EcoRⅤ酶切产物；4：PCR 产物。
Fig. 12 The digestion result of BrDFR1 over-expression vector
M：1 kb marker；1：EcoRⅠ digestion product of recombinant
plasmid；2：EcoRⅤ digestion product of vector；
3：EcoRⅤ digestion product of recombinant plasmid；
4：PCR product.
图 13 RNAi 载体的酶切结果
M：1 kb marker；1：重组质粒的 EcoRⅠ酶切产物；2：载体的 EcoRⅠ
酶切产物；3：重组质粒的 HindⅢ酶切产物；
4：载体的 HindⅢ酶切产物。
Fig. 13 The digestion result of RNAi vector
M：1 kb marker；1：EcoRⅠ digestion product of recombinant
plasmid；2：EcoRⅠ digestion product of vector；3：HindⅢ
digestion product of recombinant plasmid；
4：HindⅢ digestion product of vector.










图 14 转 BrDFR1 烟草植株的 Southern 杂交结果
1：野生型；2 ~ 9：转基因植株；10：质粒。
Fig. 14 The Southern result of transgenic tobacco plant
of BrDFR1 gene
1：Wild type；2–9：Transgenic plant；10：Plasmid.

利用含有过量表达载体和 RNAi 载体的农
杆菌 EHA105 侵染烟草叶盘。经过 3 ~ 4 周的
选择培养，从叶片周围的愈伤组织分化出不定
芽。将不定芽切割后诱导生根。提取野生型和
转化植株叶片总 DNA 进行 PCR 检测。选取有
扩增条带的转化植株进行 Southern 杂交检测
（图 14）。2 ~ 8 号转基因烟草株系及质粒的杂
交结果呈阳性，9 号转基因株系及野生型无杂
交条带；由此表明，芜菁 BrDFR1 基因已经整
合到部分烟草基因组中。转 BrDFR2 基因的烟
草植株 Southern 杂交结果也可以检测到杂交条
带。
温室培养转基因烟草植株，开花后观察植株的花色。转干涉载体的一部分烟草的花色明显变浅；
转过量表达载体的烟草花大部分颜色明显加深，一小部分没有变化（图 15）。


图 15 转基因烟草植株
Fig. 15 The transgenic tobacco plants

698 园 艺 学 报 41 卷
图 16 转基因烟草植株花的 Northern 杂交结果
Fig. 16 The Northern result of the flowers in
transgenic tobacco plants
提取花色发生变化的转基因烟草植株和
野生型花瓣总 RNA，利用 DFR 探针进行
Northern 杂交。结果如图 16 所示，过量表达
BrDFR1 或 BrDFR2 的烟草植株中 BrDFR1、
BrDFR2 基因表达，而野生型和 RNAi 植株中
则无杂交条带。
3 讨论
花青素的生物合成在多种植物中已有所研究（葛翠莲 等，2012；Rahimi et al.，2013）。自然界
中植物花青素的生物合成与糖类的积累、光照和环境胁迫密切相关（Li et al.，2012b；Zhang et al.，
2013；Zhou et al.，2013）。DFR 是花色素苷生物合成晚期阶段的关键酶，催化产生无色花色素苷，
进而形成各种类型的花青素，使花、果实和种子等呈现不同颜色（Shimada et al.，2005；Trabelsi et al.，
2011）。目前，多种植物的 DFR 基因已被克隆（潘丽晶 等，2010），利用 DFR 基因进行的遗传转化
也可以使转基因植株的花色发生相应变化（Huang et al.，2012；Kazama et al.，2013）。
本研究中以花青素合成依光型‘津田’芜菁和非依光型‘赤丸’芜菁为试材，通过 RT-PCR 方
法克隆了 BrDFR1 和 BrDFR2 基因。Blast 比对表明，BrDFR2 基因的序列在 BrDFR1 基础上缺失了
一个核苷酸，由此造成移码突变，致使 BrDFR1 和 BrDFR2 蛋白存在明显差异；BrDFR1 编码 385
个氨基酸，而 BrDFR2 仅编码 332 个氨基酸，BrDFR1 和 BrDFR2 蛋白分子量的差异通过 BrDFR1
和 BrDFR2 基因的原核诱导表达和纯化得到了进一步验证。‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁中 DFR 基
因均为单一拷贝，而大多数植物中存在DFR 基因家族的不同成员，其功能也各不相同（Shimada et al.，
2005）。
另外，本研究中同时克隆了 BrDFR1 和 BrDFR2 的基因组全长序列，比对结果显示，这两个全
长基因均含有 5 个内含子，内含子的序列及位置完全相同。表达特性研究表明，BrDFR1 基因的表
达与 UV-A 光照时间存在相关关系，但是 UV-A 并未明显改变 BrDFR2 基因的表达量。‘赤丸’芜菁
未见光块根皮中 BrDFR2 基因表达的现象与其块根合成花葵素糖苷不需光特性相符，即‘赤丸’芜
菁在黑暗条件下就有 BrDFR2 表达，积累花葵素糖苷。由此可知，BrDFR1 和 BrDFR2 基因的表达
特性存在一定差异。
本研究中通过 Gateway 技术构建了 BrDFR1 和 BrDFR2 基因的过量表达载体和 RNA 干涉载体，
遗传转化烟草后，部分转基因植株的花色发生相应变化，出现颜色加深的深粉色花和颜色变浅的灰
粉色花。此试验结果证明，从‘津田’和‘赤丸’芜菁中克隆的 BrDFR1 和 BrDFR2 基因的编码产
物具有二氢黄酮醇 4–还原酶功能，在烟草中的异位表达增加了花青素的积累，由此验证了 BrDFR1
和 BrDFR2 基因的生物学功能。
后期的研究工作可以在克隆的 BrDFR1 和 BrDFR2 基因核苷酸序列基础上设计引物分离这两个
基因的启动子序列，确定相应的光诱导应答元件；通过酵母单杂交和双荧光素酶表达系统等技术手
段进一步确定与 BrDFR1 和 BrDFR2 基因启动子相互作用的转录因子及与光诱导应答元件作用的蛋
白质因子，从而进一步了解花青素合成依光和非依光途径的基本原理和涉及的光信号传导途径。因
此，本研究克隆的 BrDFR1 和 BrDFR2 基因将为通过转基因技术培育花卉及果实新品种奠定试验基
础，也可以为阐明依光型和非依光型花青素的合成机制奠定研究基础。


4 期 许志茹等：芜菁二氢黄酮醇 4–还原酶基因的克隆与功能鉴定 699

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