全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（6）：1183–1190 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–01–21；修回日期：2014–04–10
基金项目：国家自然科学基金项目（31201593）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：chenxs@sdau.edu.cn；Tel：0538-8249338）
红皮梨花青苷调控基因 PyMYBa 的克隆与表达
分析
孙莎莎，王 楠，冀晓昊，冯守千*，张宪省，吴树敬，李 敏，王延玲，
陈学森*
（山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018）
摘 要：以红皮梨‘奥冠’为试材，采用 RT-PCR 结合 RACE 技术获得 1 个 MYB 基因，命名为 PyMYBa。
该基因开放读码框共 714 bp，编码 237 个氨基酸。PyMYBa 分子量 27.4 kD，等电点 8.78。氨基酸序列分
析显示，在其 N 端具有保守的 R2R3-MYB 结构域，R3-MYB 结构域含有 bHLH 结合基序。进化树分析表
明，PyMYBa 与花青苷调控 MYB 转录因子的同源性很高。基因表达结果表明，PyMYBa 在梨叶、花、果
皮中表达量明显高于果肉，果皮中的表达量与花青苷调控基因 PyMYB10 相比，无显著差异。遮光及 MeJA
处理后果皮中 PyMYBa、PyMYB10 的表达量变化与花青苷合成量变化趋势相似，推测 PyMYBa 为梨花青
苷合成中重要的正向调控因子。通过原核表达试验获得了该基因的重组蛋白，SDS-PAGE 电泳检测结果与
预期蛋白分子量一致。
关键词：梨；花青苷；PyMYBa
中图分类号：S 661.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）06-1183-08

Cloning and Expression Analysis of an Anthocyanin-related Transcription
Factor Gene PyMYBa in Pear
SUN Sha-sha，WANG Nan，JI Xiao-hao，FENG Shou-qian*，ZHANG Xian-sheng，WU Shu-jing，LI Min，
WANG Yan-ling，and CHEN Xue-sen*
（College of Horticulture Science and Engineering，State Key Laboratory of Crop Biology，Shandong Agricultural
University，Tai’an，Shandong 271018，China）
Abstract：The 714 bp full length cDNA of PyMYBa gene was obtained using RT and RACE PCR
from pear skins. The predicted protein of PyMYBa had 237 amino acids，with a calculated molecular mass
of 27.4 kD and an isoelectric point of 8.78. The conserved R2R3 domain was observed in the N-amino
terminus of PyMYBa. A signature motif specific for the interaction between MYB and bHLH proteins was
observed in the R3 domain. Phylogenetic analysis revealed that PyMYBa is close with other MYB TFs
involved in anthocyanin biosynthesis. Transcription analyses revealed that higher transcript levels of
PyMYBa were in flower，leaf，fruit peel than in fruit flesh. In pear skins，the similar transcripts of PyMYBa
and PyMYB10 were detected. The expression level of PyMYBa is highly correlated with the concentration


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of anthocyanin in peel after shading treatment and MeJA treatment. Therefore，the PyMYBa is speculated
to be a positive MYB transcription factor gene regulating the biosynthesis of anthocyanin in pear. Through
a prokaryotic expression system，the recombinant protein of PyMYBa was obtained，whose molecular
weight was consistent with the size of expected protein.
Key words：pear；anthocyanin；PyMYBa

MYB 转录因子是植物最大的转录因子家族之一，其中 R2R3-MYB 转录因子数量最多，广泛参
与植物的生命代谢活动。部分 R2R3-MYB 基因作为调控基因，参与花青苷的生物合成代谢（Dubos
et al.，2010），在植物花青苷合成调控及红色性状形成中起关键作用。MYB 转录因子可以独自或与
BHLH、WD40 形成蛋白复合体调控花青苷结构基因的表达（Grotewold et al.，2000；Hernandez et al.，
2004；Gonzalez et al.，2008）。自 Paz-Ares 等（1987）从玉米中克隆出第 1 个花青苷调控转录因子
基因 ZmMYBC1 以来，已有数十种花青苷调控 MYB 转录因子从拟南芥、矮牵牛、金鱼草、葡萄、
苹果、茄子等植物中克隆分离（Moyano et al.，1996；Quattrocchio et al.，1999；Stracke et al.，2001；
Kobayashi et al.，2002；Deluc et al.，2006；Espley et al.，2007；邵文婷 等，2013）。
植物花青苷调控 MYB 转录因子多以家族的形式存在。在拟南芥中存在 4 个花青苷调控基因
PAP1、PAP2、AtMYB113、AtMYB114，它们在花青苷调控中的作用明显不同（Stracke et al.，2001；
Gonzalez et al.，2008；Petroni & Tonelli，2011）。在葡萄中存在 VvMYBA1、VvMYBA2 等多个参与花
青苷合成调控的 MYB 基因，进一步研究发现 VvMYBA1 或 VvMYBA2 基因变异均可导致其基因表达
量降低，葡萄花青苷调控途径受阻，形成不同白皮葡萄类型（Kobayashi et al.，2004；Walker et al.，
2007；Cutanda-Perez et al.，2009）。在苹果中存在两类调控果肉花青苷合成的 MYB 基因 MdMYB10
和 MdMYB110，它们分别在不同红肉苹果类型中发挥调控作用（Espley et al.，2007；Chagné et al.，
2012）。
红皮梨稀少珍贵，与其他红色果实一样，梨果实的红色主要取决于果皮中花青苷的含量（Feng
et al.，2010）。目前从梨中已经分离鉴定了一个重要的花青苷调控 MYB 基因 MYB10（Feng et al.，
2010；Kui et al.，2010）。但是除 MYB10 外，梨中是否存在其它重要花青苷调控 MYB 基因尚不可知。
前期，课题组在克隆 PyMYB10（Feng et al.，2010）时，获得了另一个 MYB 转录因子中间片段，经
序列比对，其与植物花青苷调控 MYB 转录因子同源性非常高，因此推测，可能为调控梨花青苷合
成新的 MYB 基因，命名为 PyMYBa。在此基础上，本研究中利用 RACE-PCR 技术获得了该基因的
cDNA 全长，通过序列比对、进化树及基因表达模式分析推测其具有花青苷调控功能；通过原核表
达获得了重组蛋白，这为深入研究其花青苷调控功能及红皮梨育种奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料及处理
试验于 2012 年在山东农业大学作物与生物学国家重点实验室进行，所用红皮梨品种为‘奥冠’，
取自山东省聊城奥冠果业公司基地。MeJA（茉莉酸甲酯）处理：于花后 125 d 采摘果实，洗净，分
别在浓度为 2 × 10-5、2 × 10-4 和 2 × 10-3 mol · L-1 的 MeJA 溶液中浸泡 15 min，以含 0.02%（体积分
数）Tween 20 和 1%（体积分数）乙醇的蒸馏水处理的果实为对照。各处理重复 3 次，放置在光照
培养箱，温度 20 ℃，光照强度 22 000 lx，光照周期为光照 16 h/黑暗 8 h，10 d 后取果皮。花后 30 d
进行‘奥冠’果实套袋，花后 131 d 摘袋见光，取摘袋后 6 d‘奥冠’的果皮和同一时期套袋‘奥冠’
6 期 孙莎莎等：红皮梨花青苷调控基因 PyMYBa 的克隆与表达分析 1185

的果皮，比较两者的花青苷含量、PyMYBa 与 PyMYB10 的表达量。于花期（4 月 15 日）采集‘奥
冠’刚刚开放的花朵和幼叶，取花后 137 d 自然生长的‘奥冠’果皮、果肉。上述取样的花朵、幼
叶、果皮和果肉立即用液氮处理，–80 ℃保存备用。
1.2 总 RNA 提取与 PyMYBa 全长克隆
植物总 RNA 的提取方法参照 TianGen RNA plant Reagent 说明操作。RNA 提取后利用 SMARTTM
RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）试剂盒合成 cDNA。依据已知植物花青苷调控 MYB 基因
的保守序列设计兼并引物 F：5′-TGYATHRAYAARTAYGGIGARGGIAARTGG-3′，R：5′-GTRTTCCAR
TARTTYTTIACRTCRTTNGC-3′，进行 PCR 扩增。筛选同源性高的中间片段进行 5′和 3′RACE-PCR。
扩增 3′端引物 F：5′-GCAGGAAAAGCTGCAGACAGAGGTG-3′，5′端引物 R：5′-TCTTCCAGCAATTA
TTGACCACCTG-3′。UPM 通用引物由 RACE 试剂盒提供，根据试剂盒说明进行 PCR 扩增。扩增序
列经分析、拼接后，在两端设计全长特异引物 F：5′-ATGGAGGATAGTAATTTGCTGG-3′，R：5′-CTA
AATCTTAGTTATCTCTTCTTC-3′，获得对应的基因全长。
1.3 PyMYBa 生物信息学分析
利用 DNAMAN 软件进行序列分析，预测目标 cDNA 编码的蛋白质，将氨基酸序列提交到 NCBI
上进行 BLAST 同源序列比对，利用 MEGA5.0 软件对蛋白序列进行多重比对和进化分析。
1.4 花青苷含量测定
参照王慧聪等（2004）的方法，取 0.5 g 果皮鲜样，放入 10 mL 1% HCl 甲醇溶液在 4 ℃冰箱中
浸提 2 h。用分光光度计测定提取液在 553 nm 和 600 nm 处的吸光值。以每克果皮鲜质量的提取液
的光密度变化值 D553 nm–D600 nm = 0.01 作为 1 个花青苷单位，以 U 表示。
1.5 qRT-PCR 分析
提取‘奥冠’梨幼叶、花、果皮、果肉的 RNA，经 DNaseⅠ消化后利用 RevertAid 1st cDNA Synth
Kit（Fermentas）反转录为 cDNA，作为 qRT-PCR 模板。按 TaKaRa 公司 SYBR Premix 试剂盒说明
书操作，以梨 Actin（CN938023）作为内参基因。采用 iQTM5 software 和 iQTM5 Real-time PCR System
完成荧光定量 PCR 试验，每个样品进行 3 次重复。PCR 程序为 95 30 s℃ ；95 5 s℃ ，58 35 s℃ ，
40 个循环；95 15 s℃ ；60 60 s℃ ；95 15 s℃ 。反应结束后将数据导出到 Excel 表中，利用 2-ΔΔCt公
式计算基因的相对表达量（Livak & Schmitten，2001）。应用 DPS 软件进行显著性差异分析。引物
Actin F：5′-TCCAGAAGAGCATCCAGTCC-3′，R：5′-GCCAGGTCCAAACGAAGG-3′；PyMYB10 F：
5′-CAGCAGAAGATTTAAGTACGCCATC-3′，R：5′-TTCTAACAAGGTCTCCCACCAATC-3′；PyMYBa
F：5′-AACCACGGAGGGCTAGAGTT-3′，R：5′-GCCTACCATTGTCGATTGTGC-3′。
1.6 原核表达
根据 PyMYBa 的全长序列设计特异引物，获得该基因的开放读码框。将 PCR 扩增产物双酶切后
定向连接到原核表达载体 pET-30a BamHⅠ和 SalⅠ位点上，构建重组表达载体 pET-PyMYBa，将重
组质粒转化到大肠杆菌 BL21（DE3）中。
挑取阳性克隆接种到 LB 培养液中进行培养，至 OD600 ≈ 0.6 时加入 IPTG（终浓度分别为 0.2、
0.8、1.0 mmol · L-1）进行诱导表达。诱导 2、4、6 h，收集菌体，加入菌液体积 10%的 SDS-PAGE
上样缓冲液，100 ℃煮沸 5 min，取上清液进行 SDS-PAGE 电泳，考马斯亮蓝染色。对照为加 IPTG
（终浓度 0.8 mmol · L-1）诱导 4 h 的转化 pET-30a 质粒的 BL21 菌体蛋白。
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2 结果与分析
2.1 PyMYBa 全长克隆与序列分析
根据植物已知花青苷调控 MYB 转录因子保守区域设计兼并引物，获得一个长度为 249 bp 的中
间片段（图 1，A），登录 NCBI 进行核苷酸序列比对，结果表明该片段与 MdMYB10 的相似度高达
77%，认为该片段为梨 MYB 基因序列片段。5RACE 扩增得到一个长 327 bp 的片段（图 1，B），3RACE
扩增得到一个长 800 bp 的片段（图 1，C），两个序列中间有 140 bp 的重复序列。设计特异引物获得
该基因全长，命名为 PyMYBa。序列分析表明，PyMYBa 开放读码框 714 bp（图 1，D），编码 237
个氨基酸，理论分子量为 27.4 kD，等电点为 8.78。推导的氨基酸序列（图 2）具有明显的 R2R3-MYB

图 1 ‘奥冠’梨 PyMYBa 基因的 PCR 扩增结果
M：DL2000 DNA marker；A：中间片段；B：5′端片段；C：3′端片段；D：编码区 cDNA。
Fig. 1 The PCR amplification results of PyMYBa from‘Aoguan’pear
M：DL2000 DNA marker；A：Middle fragment；B：5 terminal fragment；C：3 terminal fragment；D：cDNA coding sequence.





















图 2 PyMYBa 与花青苷调控基因 MYB 转录因子氨基酸比对
Fig. 2 Comparison of predicted PyMYBa protein sequence with anthocyanin-related MYB proteins of other species
6 期 孙莎莎等：红皮梨花青苷调控基因 PyMYBa 的克隆与表达分析 1187

图 4 ‘奥冠’梨各组织 PyMYBa 的表达量比较
大、小写字母分别代表 1%和 5%差异显著水平。下同。
Fig. 4 Analysis of PyMYBa expression in tissues of‘Aoguan’pear
Different capital and small letters mean significant difference at
1% and 5% level，respecitively. The same below.

图 5 ‘奥冠’果皮 PyMYBa 和 PyMYB10
表达量比较
Fig. 5 Analysis of PyMYBa and PyMYB10 expression
in‘Aoguan’pear peel
结构域，在 R3-MYB 区域有与 bHLH 互作的结构功能域。在梨基因组网站中（http：//peargenome.
njau.edu.cn/）未找到一致序列，认为分离到的 PyMYBa 是梨中新的 MYB 基因。
通过 NCBI-Blast 比对后发现：PyMYBa 与植物已知调控花青苷合成的 MYB 转录因子同源性最
高，其中与苹果 MdMYB10 的一致性为 49%，与梨 PyMYB10 的一致性为 51%。
进化树分析结果（图 3）显示：PyMYBa 与 MdMYB10、AmROSEA1、AtPAP1、PyMYB10 等
调控花青苷合成的 MYB 转录因子亲源关系较近，表明 PyMYBa 可能具有相似的功能。
图 3 PyMYBa 与其它 MYB 蛋白系统进化树分析
Fig. 3 Phylogenetic relationship of PyMYBa and other MYBs

2.2 花青苷含量测定及 PyMYBa 基因表达分析
如图 4 所示，PyMYBa 在富含花青苷的梨叶、花、果皮中的表达量较高，分别约为果肉的 55、
80、70 倍。在果皮中，PyMYBa 与梨花青苷调控基因 PyMYB10 的表达量相比，无显著差异（图 5）。
遮光明显抑制了果皮中花青苷的合成，遮光处理果皮花青苷含量约为对照的 1/5，PyMYBa 和
PyMYB10 表达量分别约为对照的 1/10 和 1/11（图 6）。MeJA 处理促进果皮中花青苷合成，以 2 × 10-3
mol · L-1 浓度处理促进作用最为明显，为对照的 1.1 倍，PyMYBa 和 PyMYB10 的表达量分别约为对
照的 3 倍和 2.7 倍（图 7）。由以上结果可知，遮光及 MeJA 处理后果皮中 PyMYBa、PyMYB10 的表
达量变化与花青苷合成量变化趋势相似，表明 PyMYBa 可能是梨花青苷合成中重要的正向调控因子。

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图 6 套袋处理对‘奥冠’梨果皮中花青苷含量、
PyMYBa 和 PyMYB10 表达的影响
Fig. 6 Anthocyanin accumulation，PyMYBa and PyMYB10
expression under bagging and debagging
treatments in‘Aoguan’pear peel
图 7 MeJA 处理对‘奥冠’梨果皮花青苷含量、
PyMYBa 和 PyMYB10 表达的影响
Fig. 7 Anthocyanin accumulation，PyMYBa and PyMYB10
expression under MeJA treatment in
‘Aoguan’pear peel


2.3 PyMYBa 的原核表达与 SDS-PAGE 分析
构建重组质粒 pET-PyMYBa，转化到原核表达宿主菌 BL21（DE3）中，加入不同浓度的 IPTG，
在 37 ℃下分别以 2、4 和 6 h 进行诱导后，进行 SDS-PAGE 分析。结果（图 8）表明，重组质粒











图 8 pET-PyMYBa 重组蛋白 SDS 分析
M：Marker；CK：对照（0.8 mmol · L-1 IPTG 诱导 4 h 的 pET-PyMYBa）。
Fig. 8 SDS-PAGE analysis for pET-PyMYBa protein
M：Low molecular weight protein marker；CK：Control（pET-PyMYBa induced for 4 h by 0.8 mmol · L-1 IPTG）.
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pET-PyMYBa 经 IPTG 诱导后，在 22 ~ 30 kD 处有一条明显的蛋白条带，与预测的 PyMYBa 蛋白分
子量大小一致。重组蛋白的诱导量与诱导时间关系密切，在 6 h 表达量达到最大。
3 讨论
本研究中利用 RACE-PCR 技术从梨中分离了新基因，PyMYBa。结构分析表明，该基因含有两
个明显的 MYB 结构域，为典型的 R2R3-MYB 转录因子。进化树分析表明，PyMYBa 推导的氨基酸
序列与 PyMYB10、MdMYB1 等植物花青苷调控 MYB 转录因子亲缘关系最近，而与抑制花青苷合
成的 FaMYB1 亲缘关系较远。NCBI blast 结果表明，PyMYBa 与 PyMYB10 等花青苷调控 MYB 转
录因子同源性最高。因此推测 PyMYBa 可能具有与 PyMYB10、MdMYB1 等类似的功能，调控花青苷
的合成。梨中可能存在包含 PyMYB10、PyMYBa 在内的多个花青苷调控 MYB 转录因子，这一现象
与苹果、拟南芥等植物类似（Takos et al.，2006；Ban et al.，2007；Espley et al.，2007；Gonzalez et
al.，2008；Dubos et al.，2010；Chagné et al.，2012）。
基因表达模式能够反映基因特定的生物学功能。在梨中，PyMYB10 基因在幼叶、花、果皮等富
含花青苷的部位均有大量表达，调控以上部位花青苷的合成（Feng et al.，2010）。本研究中发现
PyMYBa 在幼叶、花、果皮等富含花青苷的部位表达量同样很高。在果实成熟期，PyMYBa 与 PyMYB10
在果皮中的表达丰度类似。并且果皮中 PyMYBa 和 PyMYB10 对遮光和 MeJA 处理的响应趋势与花
青苷含量变化趋势一致，意味着 PyMYBa 与 PyMYB10 一样在梨果皮、幼叶等器官花青苷合成中发
挥重要的正向调控作用。梨花青苷调控 MYB 基因的表达模式与其它物种存在差异，有其自身的特
点，如 PyMYBa、PyMYB10 在幼叶、花、果皮等器官均大量表达，而矮牵牛花青苷调控 MYB 基因
AN2、AN4 及 DPL 分别在花瓣、花药、花冠脉络等部位特异表达（Albert et al.，2011）；果实成熟期，
PyMYBa 与 PyMYB10 在梨果皮中的表达丰度类似，而杨梅花青苷调控 MYB 基因 MrMYB1 在成熟果
实中的表达量高，MrMYB2 表达量极低（牛珊珊，2011），认为与不同物种的遗传基础有关。
MYB 转录因子主要以蛋白的形式参与植物花青苷的调控，要深入了解它们在植物体内的生物
学功能，必须从蛋白水平上进行研究。原核表达系统为研究 MYB 蛋白功能提供了一条有效途径。
本研究中通过原核表达获得了 PyMYBa 重组蛋白，其大小与预测值一致。这一结果证实了 PyMYBa
具有完整的读码框，其生物学功能有待于进一步明确。

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