全 文 ：园 艺 学 报 ， （ ）： – 2014 41 11 2215 2224 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–08–22；修回日期：2014–10–24
基金项目：河北省海外高层次人才百人计划项目（E2013100011）；河北省杰出青年科学基金项目（C2013204118）；‘十二五’农村领域
国家科技计划课题（2012AA100202-5）；农业部农业科研杰出人才培养计划项目（2130106）；高等学校博士学科点专项基金项目（20121302110006）
大白菜叶色突变体的HRM鉴定及其叶绿素荧光
参数分析
刘梦洋，卢 银，赵建军，王彦华，申书兴*
（河北农业大学园艺学院，河北省蔬菜种质创新与利用重点实验室，河北保定 071000）
摘 要：将大白菜经甲基磺酸乙酯（EMS）诱变种子获得的 42 株叶色突变体按照生殖时期叶片颜色
和叶绿素含量分为 9 种类型：深绿色、灰绿色、绿色、浅绿色、白绿色、白浅绿色、黄绿色、黄浅绿色、
黄色；利用高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM）技术对叶绿素荧光基因 HCF164 突变进行
了筛选并结合叶绿素荧光参数测定，获得了 1 株黄绿色高光合效率突变体 A29，1 株黄绿色光合结构损伤
突变体 A35 和 1 株浅绿色光合电子传递受阻突变体 A21；对另外 7 个叶色相关基因的突变进行了 HRM 鉴
定，表明叶绿素相关基因 ATRCCR、CLH2、PORA 突变可能是造成 18 个突变体叶色变化的主要原因，黄
叶特异基因家族 YLS 突变与叶色变化也有关系。
关键词：大白菜；诱变；突变体叶色；HRM；叶绿素荧光
中图分类号：S 634.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）11-2215-10

HRM Identification and Chlorophyll Fluorescence Characteristics on Leaf
Color Mutants in Chinese Cabbage
LIU Meng-yang，LU Yin，ZHAO Jian-jun，WANG Yan-hua，and SHEN Shu-xing*
（College of Horticulture，Agricultural University of Hebei，Key Laboratory for Vegetable Germplasm Enhancement and
Utilization of Hebei，Baoding，Heibei 071001，China）
Abstract：Forty-two leaf color mutants of Chinese cabbage obtained through EMS seeds mutagenesis
were used as materials in this study. According to leaf color and leaf chlorophyll content at generative
growth mutations were suggested to be divided into 9 types：Dark green，gray-green，green，light green，
white-green，light white-green，yellow-green，light yellow-green and yellow. By detecting the nucleotide
variation of the gene HCF164 related to chlorophyll fluorescence using HRM technology and by
measuring chlorophyll fluorescence characteristics，we identified one yellow-green leaf color mutant A29
with high photosynthesis efficiency，one yellow-green leaf color mutant A35 with photosynthetic structure
damages，one light green mutant A21 with photosynthetic electron transport obstruction. Through
identifying other 7 leaf-color-related genes by HRM，mutation of chlorophyll-related genes ATRCCR，
CLH2 and PORA could be the main reason resulted in 18 leaf color mutants，mutation of yellow-leaf-
specific genes was also affected the variation of leaf color.

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：shensx@hebau.edu.cn）
2216 园 艺 学 报 41 卷
Key words：Chinese cabbage；EMS mutation；leaf color；HRM；chlorophyll fluorescence

叶色突变体作为研究植物叶绿素合成分解途径、遗传表达机理、光合作用机制的特殊材料，具
有重要的研究意义。高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM）技术，可以辅助表型筛选，
高效精细地鉴定点突变位点。将 HRM 技术应用于芸薹属甲基磺酸乙酯（EMS）诱变育种中具有巨
大的发展潜力。该技术是通过实时监测升温过程中双链 DNA 荧光染料与 PCR 扩增产物的结合情况
（Gingerast et al.，2005；Hoffmann et al.，2007），利用高通量遗传变异扫描系统 Lightscanner，高灵
敏高特异性地扫描最长达 400 bp 的扩增子中是否存在变异。
目前在模式植物拟南芥中已经鉴定出了突变体 ch1 的相关基因（Block et al.，2002；Pontier et al.，
2007）。大白菜和拟南芥同属十字花科，存在大量同源基因，利用拟南芥相关基因鉴定大白菜叶色突
变体，为大白菜叶色突变机理的研究提供了条件。本试验利用经 EMS 诱变获得的大白菜叶色突变
体，对其在生殖期的叶片光合特性进行了研究，并通过 HRM 技术对相关基因的碱基变化进行了鉴
定，旨在为创造可稳定遗传的叶色突变材料奠定基础，为叶色突变体的应用提供更多的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
选用经 EMS 诱变大白菜自交系 A03 的种子获得的叶色突变体（卢银 等，2014）M2 世代 42
株及野生型 A03 作为试验材料。于 2013 年 9 月播种于温室，同年 11 月大株留种，2014 年 1 月移栽，
进入生殖生长时期，正常管理。
1.2 方法
1.2.1 叶绿素含量与叶绿素荧光参数的测定
参照刘绚霞等（2004）的方法测定叶绿素含量。采用德国 WALZ 公司生产的调制式荧光成像
系统（MINI-IMAGING-PAM）测定叶绿素荧光参数（Genty et al.，1989；王俊玲 等，2011）——
PSⅡ最大光化学量子产量 Fv/Fm、光化学荧光猝灭系数 qP、非光化学荧光猝灭系数 qN、实际光化学
量子产量 Y（Ⅱ）、调节性能量耗散的量子产量 Y（NPQ）、非调节性能量耗散的量子产量 Y（NO）、
吸光系数 Abs。
1.2.2 高分辨率熔解曲线（HRM）分析
分别取叶色突变体及野生型新鲜叶片采用 CTAB 法提取 DNA，利用微量分光光度计 K5600 测
定 DNA 模板浓度，分别稀释至 100 ng · µL-1。
叶色基因来源于大白菜基因组数据库（http：//brassicadb.org），共发现大白菜 6 个黄叶特异基
因（YLS2-1、YLS2-2、YLS9、YLS7、YLS4、YLS8）及 5 个叶绿素相关基因（ATRCCR、CLH2、HCF164、
PORA、HCF107）。应用软件 Premier 5 分别设计了 14 和 12 对引物（表 1），扩增片段为 50 ~ 400 bp。
PCR 反应体系参考 Xiao 等（2013）的报道。样品在避光 96 孔板中（野生型 3 次重复）进行 PCR
扩增，PCR 反应总体系 10 µL，体系中各组分含量为：10 PCR Buffer（含 Mg2+）1 µL，2.5 mmol · µL-1
dNTPs 0.8 µL，1 U Taqase 0.1 µL，50 ng · µL-1 Forward primer 0.5 µL，50 ng · µL-1 Reverse primer 0.5
µL，100 ng · µL-1 模板 DNA 1 µL，其它用灭菌双蒸水补齐。PCR 扩增程序：94 ℃预变性 4 min，
94 ℃变性 30 s，退火温度 30 s，72 ℃延伸 1 min，35 个循环，72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存。扩增
产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测，保证扩增出单一条带。

11 期 刘梦洋等：大白菜叶色突变体的 HRM 鉴定及其叶绿素荧光参数分析 2217
表 1 叶色相关引物信息
Table 1 The information of leaf-color-related primers
白菜基因
Brassica
rapa gene
白菜注解
Brassica rapa annotation
拟南芥基因
A. thaliana
gene
引物
名称
Primer
name
引物 Primer（5′–3′）
片段位置
Fragment
location
片段大小/bp
Fragment
size
LY1 F：TCCACGGAGAAGTCATAG
R：CGTTAGCGAAGTAAAGGTC
368 ~ 722 355 YLS2-1 黄叶特异基因 2-1
Yellow-leaf-specific gene 2-1
AT3G51430
LY2 F：TATTACATCAACGAGGAGC
R：AAGAAAGGGTATCTAAACG
869 ~ 1 097 229
LY3 F：ATACCTCCACTCGCTCTT
R：TCACGGATGCTTCTTACA
441 ~ 763 323 YLS2-2 黄叶特异基因 2-2
Yellow-leaf-specific gene 2-2
AT3G51430
LY4 F：GAGATGCCATTAGCGAAGT
R：GACGGATGAAGCAGAAGG
616 ~ 837 222
YLS9 黄叶特异基因 9
Yellow-leaf-specific gene 9
AT2G35980 LY5 F：TCTACGGTCCATCAGTCC
R：TGAGCCAGAAGATAAGAGC
29 ~ 184 156
LY6 F：GACCATCTTGCGGACTTG
R：TCGCTTGCTGCTCATACA
1 180 ~ 1 325 146
LY7 F；TAACACGCCTCCATTGCT
R：GGTCTCCCATTGCCCTGA
243 ~ 557 315
LY8 F：TTGCGTTTGCTATTGGTG
R：TCTGCTGCTACTATGGTGA
59 ~ 294 146
YLS7 黄叶特异基因 7
Yellow-leaf-specific gene 7
AT5G51640
LY9 F：ATGATGTGCCTTCTTTGG
R：GTTGGTCGAGCTTGAGTT
700 ~ 950 251
LY10 F：AGAAGCACTATCGAACCCTG
R：CAGCCGTAAGTAACCATTTC
971 ~ 1 072 102 YLS4 黄叶特异基因 4
Yellow-leaf-specific gene 4
AT5G11520
LY11 F：CCATGTTGGCTGAGGAAT
R：CACGGATCAAGGAGTATCTT
1 215 ~ 1 607 393
LY12 F：TTAGGAGCAATCACCAGC
R：TATGAAGGACAAGCAGGA
29 ~ 115 87
LY13 F：AAACTCCTGCTTGTCCTT
R：AGCGTCTCGTCGTCATAC
94 ~ 476 383
YLS8 黄叶特异基因 8
Yellow-leaf-specific gene 8
AT5G08290
LY14 F：CAGCCCACGACCTTTCCT
R：AGGTGCTTGCGTCTGTTG
43 ~ 302 260
CH1 F：AAAGACCTAGTTCGTCACCCTG
R：ACGCTCCAACCAAACCTCAA
750 ~ 1 004 255 ATRCCR 拟南芥红绿色素分解产物还原酶
Arabidopsis thaliana red
chlorophyll catabolite reductase
AT4G37000
CH2 F：GGGAAGACTTATGGATTG
R：TAGATTTGGGTAAACTGG
1 774 ~ 1 882 109
CH3 F：CTTGCCTCTAATCCCTTCA
R：GATACTCGTCCGACCTAA
184 ~ 500 317 CLH2 叶绿素酶 2
Chlorophyllase 2
AT5G43860
CH4 F：GTCCAAATGCCCGTAATC
R：TTCCACCACAAGTAACACCA
220 ~ 596 377
CH5 F：CAAGTGCGTTGACATTCT
R：CATTTATAGGGTTAGGGAG
105 ~ 393 289
CH6 F：TCGTAAGGCAAGGCTGAA
R：GGAGAAATTGGTGGTGGA
841 ~ 1 050 210
CH7 F：CAGAAGCAACAGCGACTC
R：GTGGATAATGGCTCAACT
929 ~ 1 037 109
HCF164 高叶绿素荧光 164
High chlorophyll fluorescence 164
AT4G37200
CH8 F：GAGCCATTATCCACCACC
R：GCCAGATTCTTCCGAGCC
1 024 ~ 1 149 126
CH9 F：CTTCTCGCTAACTTCCCAAAC
R：AGACCTCGGCTTCATTCG
19 ~ 104 86
CH10 F；ATACAACCAGGGTAGAGG
R：CGATGATAGATGGAGGAG
378 ~ 519 142
PORA 原叶绿素质化还原酶
Protochlorophyllide
oxidoreductase A

AT5G54190
CH11 F：AAAGTGCCCTAAATGGTT
R：GTGAGGCAGTTCGTTGAT
1 042 ~ 1 194 153
HCF107 高叶绿素荧光 107
High chlorophyll fluorescence 107
AT3G17040 CH12 F：CCAAACGCTTGCCTTACT
R：GATATGGTGGCCTGCTTA
987 ~ 1 064 78

PCR 扩增产物在 Lightscanner（Idaho Technology）仪器上进行 HRM 鉴定，与野生型比较熔解
曲线，确认突变株（Lochlainn et al.，2011）：样品在 70 ~ 96 ℃的温度条件下逐渐减链，减链速度
为 0.1 ℃ · s-1。随着温度的变化 DNA 链上的荧光染料 LC Green 在 510 nm 波长下被释放，其荧光
强度被采集并释放在熔解曲线上。检测完成后，使用 Scanning 功能命令分析基因型多态性。对 PCR

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板中没有扩增的样品（Fluorescence < 800）、空缺位置和系统默认的 bad data 进行去除，不进行分析；
然后在“Normalize”选项卡里设置熔解曲线的取值区间为 1 ℃左右；最后在“Grouping”选项卡中，
调节敏感度“sensitivity level”命令，调节基因型分组。
2 结果与分析
2.1 叶色突变体表型变异及叶绿素含量
通过田间调查可看出，在生殖生长时期，不同类型突变体同一节位的新叶颜色变异明显，野生
型 A03 呈浅绿色，42 株叶色突变体出现不同叶色类型，根据肉眼观察并叶绿素 a 含量将其分为 9
组（图 1），包括①深绿色（Chl.a ≥ 2.000）、②灰绿色（0.900 ~ 1.600）、③绿色（1.000 ~ 2.000）、
④浅绿色（0.700 ~ 1.000）、⑤白绿色（0.400 ~ 0.700）、⑥白浅绿色（0.100 ~ 0.200）、⑦黄绿色（0.300 ~
0.700）、⑧黄浅绿色（0.100 ~ 0.250）、⑨黄色（0.100 ~ 0.200）等。


图 1 叶色突变体及野生型生殖生长时期的叶色分类
Fig. 1 The leaf color of mutants and wild type in generative growth phase

通过对 42 株叶色突变体及野生型 A03 叶片叶绿素含量的测定（图 2），发现深绿色突变体叶绿
素总含量最多，大于 2.50 mg · g-1；黄色突变体叶绿素总含量最少，小于 0.30 mg · g-1；灰绿色和绿
色突变体叶绿素总含量在 0.90 ~ 2.00 mg · g-1 之间；浅绿色的突变体和野生型 A03 叶绿素总含量在
11 期 刘梦洋等：大白菜叶色突变体的 HRM 鉴定及其叶绿素荧光参数分析 2219
1.50 ~ 1.80 mg · g-1 之间；其它颜色突变体叶绿素总含量小于 1.00 mg · g-1。失绿类型突变体主要与叶
绿素 a 含量显著相关，黄色突变体的叶绿素 a 含量最低。
将包含野生型 A03 的第④组作为对照，其叶绿素 a 含量在 0.70 ~ 1.00 mg · g-1 之间，失绿类型突
变体（第⑤ ~ ⑨组）叶绿素 a 含量在 0.10 ~ 0.70 mg · g-1 之间，绿色突变体（第① ~ ③组）叶绿素
a 含量在 1.00 ~ 2.00 mg · g-1 之间。


图 2 叶色突变体及野生型叶绿素含量测定
Fig. 2 Determination the leaf chlorophyll content of the leaf color mutants and wild type
2.2 叶色突变体及野生型叶绿素荧光参数分析
由表 2 可看出 Abs 数值和叶绿素含量成正相关，深绿色①组最高，其次为绿色③组、灰绿色②
组、浅绿色④组、黄绿色⑦组、白绿色⑤组、黄浅绿色⑧组、白浅绿色⑥组，黄色⑨组最低。
Fv/Fm在突变体①、②组中略高，③、④、⑤组中基本相同，⑥、⑦、⑧、⑨组中略有下降。
Y（II）在黄浅绿色⑧组和黄色⑨组明显低于其他组，其中灰绿色②组最高；在第⑦组中 A29 和
第⑧组中 A37，Y（II）数值高于所在组其他突变体，并且高于野生型 A03。
调节性能量耗散的量子产量 Y（NPQ）在第⑥、⑨组中低于其他组，其中③组中 A16 和⑤组中
A25 明显高于该组其他突变体，并显著高于野生型 A03。第⑨组中非调节性能量耗散的量子产量 Y
（NO）明显高于其他组，第②组略低于其他组。
光化学荧光猝灭系数 qP 在第②组中最高，第⑥、⑦、⑧、⑨组明显低于其他组别。
非光化学荧光猝灭系数 qN 在第①、②、⑦、⑧和⑨组明显高于其他组。

表 2 叶色突变体及野生型叶绿素荧光参数
Table 2 The chlorophyll fluorescence characteristics of the leaf color mutants and wild type
组号
Group number
Abs Fv/Fm Y（Ⅱ） Y（NPQ） Y（NO） qN qP
① 0.885 ± 0.001 a 0.821 ± 0.001 a 0.677 ± 0.001 a 0.104 ± 0.002 a 0.285 ± 0.003 f 0.338 ± 0.005 b 0.883 ± 0.009 b
② 0.851 ± 0.006 c 0.818 ± 0.001 a 0.683 ± 0.004 a 0.099 ± 0.002 ab 0.219 ± 0.005 f 0.376 ± 0.007 a 0.903 ± 0.010 a
③ 0.864 ± 0.001 b 0.806 ± 0.002 b 0.652 ± 0.007 b 0.100 ± 0.002 ab 0.278 ± 0.008 b 0.333 ± 0.001 bc 0.835 ± 0.004 d
④ 0.845 ± 0.002 d 0.806 ± 0.003 b 0.653 ± 0.002 b 0.095 ± 0.002 bcd 0.273 ± 0.006 cd 0.328 ± 0.004 bc 0.850 ± 0.005 c
⑤ 0.666 ± 0.002 f 0.797 ± 0.004 c 0.661 ± 0.002 b 0.093 ± 0.002 a 0.259 ± 0.003 de 0.324 ± 0.003 c 0.856 ± 0.002 c
⑥ 0.585 ± 0.003 h 0.792 ± 0.008 c 0.600 ± 0.007 c 0.087 ± 0.004 e 0.277 ± 0.001 c 0.291 ± 0.006 d 0.859 ± 0.002 c
⑦ 0.773 ± 0.001 e 0.793 ± 0.005 c 0.656 ± 0.003 b 0.094 ± 0.005 cd 0.250 ± 0.007 e 0.284 ± 0.005 d 0.873 ± 0.005 b
⑧ 0.614 ± 0.004 g 0.797 ± 0.005 c 0.496 ± 0.003 d 0.097 ± 0.003 abc 0.268 ± 0.005 cde 0.274 ± 0.005 e 0.898 ± 0.003 a
⑨ 0.495 ± 0.003 i 0.798 ± 0.003 c 0.446 ± 0.002 e 0.086 ± 0.002 e 0.388 ± 0.004 a 0.239 ± 0.010 f 0.894 ± 0.012 a

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2.3 叶色突变体高分辨率熔解曲线（HRM）分析
PCR 后经琼脂糖凝胶电泳检测，有 12 对引物有明显的单一条带，其中包括大白菜黄叶基因引
物 6 对（覆盖 4 个基因 YLS2、YLS4、YLS7、YLS8）及叶绿素相关基因引物 6 对（覆盖 4 个基因 ATRCCR、
CLH2、HCF164、PORA）。HRM 筛选结果如图 3 所示。

图 3 叶色突变体及野生型叶色相关引物 HRM 分析
Fig. 3 HRM analysis of the leaf color mutants and wild type in leaf-color-related primers
11 期 刘梦洋等：大白菜叶色突变体的 HRM 鉴定及其叶绿素荧光参数分析 2221
叶绿素特异基因引物 CH1 的 HRM 曲线明显分为 3 种类型，大部分突变体的曲线同为灰色，部
分同为红色曲线（包括野生型 A03），蓝色曲线为突变体 A9；CH4 的 HRM 曲线明显分为 4 种类型，
大部分突变体曲线同为灰色（包括野生型 A03），部分同为红色，蓝色为突变体 A42，深绿色为突变
体 A2；CH5 的 HRM 曲线明显分为 5 种类型，大部分突变体同为灰色，部分同为红色（包括野生型
A03），蓝色为突变体 A21、A29、A35、A36，橙色为突变体 A9，深绿色为突变体 A32；CH9 的 HRM
曲线明显分为 4 种类型，大部分突变体曲线同为灰色，部分同为红色曲线（包括野生型 A03），蓝色
曲线、突变体 A21、A22、A24、A42，深绿色曲线为突变体 A33；CH10 的 HRM 曲线明显分为 5
种类型，大部分同为灰色，部分同为红色（包括 A03 野生型），部分为蓝色 A1、A15、A19、A27、
A30、A32，深绿色为突变体 A7、A18，橙色曲线为突变体 A33；CH11 的 HRM 曲线明显分为 4 种
类型，大部分突变体曲线同为灰色，部分同为红色曲线（包括野生型 A03），蓝色为突变体 A3、A37、
A38、A39、A40，深绿色为突变体 A4。
黄叶特异基因引物 LY3 的 HRM 曲线明显分为 4 种类型，大部分突变体曲线同为灰色，部分同
为红色（包括野生型 A03），蓝色为突变体 A3，深绿色为突变体 A2；LY4 的 HRM 曲线明显分为 5
种类型，大部分突变体曲线同为灰色，部分同为红色（包括野生型 A03），蓝色为突变体 A3、A20，
深绿色为突变体 A35，橙色为突变体 A37；LY6 的 HRM 曲线明显分为 4 种类型，大部分突变体曲
线同为灰色，部分同为红色（包括野生型 A03），蓝色为突变体 A37，深绿色为突变体 A32；LY9
的 HRM 曲线明显分为 4 种类型，大部分突变体曲线同为灰色（包括野生型 A03），部分同为红色，
蓝色为突变体 A9、A24，深绿色为突变体 A3；LY11 的 HRM 曲线明显分为 4 种类型，大部分突变
体曲线同为灰色（包括野生型 A03），部分同为红色，蓝色为突变体 A2、A10、A18、A29，深绿色
为突变体 A9、A24，橙色为突变体 A33；LY14 的 HRM 曲线明显分为 4 种类型，大部分突变体曲线
同为灰色，部分同为蓝色（包括 A03 野生型），部分为红色包括 A17、A19、A21、A22、A30、A31、
A34，深绿色为突变体 A36。
2.4 叶色突变体相关基因突变位点分析
参考 HRM 熔解曲线图，将与野生型 A03 熔解曲线相近的（红色和灰色）突变体标为黄色，与
野生型 A03 熔解曲线差距较大的突变体用不同颜色表示（同种颜色表示在同一引物中熔解曲线相
同），分别标为粉色、蓝色和绿色，结果如图 4。7 个突变体在黄叶特异基因 YLS4（引物 LY11）的
扩增片段中发现突变位点；分别有 2 个和 4 个突变体在 YLS2 基因（引物 LY3 和 LY4）的扩增片段
中发现突变位点；8 个突变体在基因 YLS8（引物 LY14）的扩增片段中发现突变位点；分别有 2 个
和 3 个突变体在 YLS7 基因（引物 LY6 和 LY9）的扩增片段中发现突变位点。

图 4 叶色相关基因引物对 42 株叶色突变体（A1 ~ A42）及野生型（A03）的筛选结果图
Fig. 4 The screening results of the 42 the leaf color mutants（A1–A42）and wild type（A03）in leaf-color-related gene primers

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19 个突变体在叶绿素相关基因 PORA（3 对引物）的扩增产物中共发现 20 个突变位点，11 个
突变株集中在颜色变浅的⑤ ~ ⑨组中，其中突变体 A33 为黄绿色，存在 2 个突变位点。黄浅绿色⑧
组中的 3 个突变株均在叶绿素相关基因 PORA（引物 CH11）的扩增片段上存在突变，叶绿素相关基
因 PORA 和原叶绿素酸酯氧化还原酶有关，该位点的突变可能是造成该组叶片颜色变化的主要原因；
仅在 A2、A42 中存在叶绿素相关基因 CLH2（引物 CH4）扩增片段的突变位点，CLH 是编码叶绿素
酶的相关基因，推测可能是该位点突变造成叶片颜色呈深绿色；仅在 A9 中存在叶绿素相关基因
ATRCCR（引物 CH1）扩增产物的突变位点，ATRCCR 基因和红色叶绿素代谢产物还原酶有关，推
测该位点突变造成 A9 叶色变化。
共有 21 个突变株在 3 种叶绿素相关基因位点上发生突变，其中 7 个突变株叶片颜色变深，3 个
突变株叶片颜色失绿，8 个突变株叶片颜色变黄，3 个突变株颜色未发生变化。
共有 6 个叶色突变材料（A9、A21、A29、A32、A35、A36）在叶绿素荧光相关基因 HCF164
中存在突变位点。分析其叶色变化与叶绿素荧光参数之间的关系（表 3），6 个叶色突变体的叶绿素
荧光参数与野生型相比，都有不同程度的变化，A29、A21 和 A35 突变体表现最为显著。
在 Abs 上，A21 虽然颜色为浅绿色，但是 Abs 值低于浅绿色野生型，黄绿色突变体全部低于野
生型，A32、A36 比 A29、A35 更低；突变体 Fv/Fm值均高于野生型；Y（Ⅱ），A29 和 A36 明显高
于野生型，A9 和 A35 明显低于野生型；Y（NPQ），A35 明显高于野生型，A21 和 A29 明显低于野
生型；Y（NO），A21、A29、A36 明显低于野生型；qN，A29、A32、A36 明显低于野生型；qP，A29
最高，A35 最低。
突变体 A29 的 Fv/Fm、Y（Ⅱ）和 qP 明显高于野生型，但是 Y（NPQ）、Y（NO）和 qN 明显低于
野生型，这表明 A29 虽然叶绿素合成受阻，但是捕获光能效率更高，对于光能的转换效率也更高。
突变体 A21 的 Fv/Fm高于野生型，但是 Y（NPQ）、Y（NO）和 qN明显低于野生型，这表明 A21
虽然叶色表现为浅绿色，可以捕获较多光能，用于消耗的光能较少，但是实际用于光合电子传递的
光能并未增加。突变体 A35 的 Fv/Fm、Y（NPQ）和 Y（NO）高于野生型，但是 Y（Ⅱ）、qP 和 qN
低于野生型，这表明 A35 叶绿素合成受阻。

表 3 部分叶色突变体及野生型叶绿素荧光参数
Table 3 The chlorophyll fluorescence characteristics of some the leaf color mutants and wild type
材料
Material
颜色
Color
Abs Fv/Fm Y（Ⅱ） Y（NPQ） Y（NO） qN qP
A9 绿 Green 0.855 ± 0.004 a 0.813 ± 0.009 a 0.609 ± 0.005 c 0.093 ± 0.009 bc 0.297 ± 0.009 b 0.313 ± 0.009 bc 0.880 ± 0.012 bc
A21 浅绿
Light green
0.850 ± 0.007 ab 0.819 ± 0.004 a 0.665 ± 0.003 b 0.077 ± 0.009 d 0.248 ± 0.008 cd 0.323 ± 0.003 b 0.877 ± 0.011 bc
A03 野生型
Wild type
浅绿
Light green
0.844 ± 0.009 b 0.747 ± 0.001 b 0.661 ± 0.005 b 0.090 ± 0.006 c 0.346 ± 0.010 a 0.341 ± 0.004 b 0.828 ± 0.009 d
A29 黄绿
Yellow-green
0.844 ± 0.002 b 0.816 ± 0.002 a 0.721 ± 0.008 a 0.067 ± 0.001 d 0.212 ± 0.009 d 0.289 ± 0.008 c 0.929 ± 0.007 a
A32 黄绿
Yellow-green
0.798 ± 0.003 c 0.772 ± 0.009b 0.655 ± 0.010 b 0.103 ± 0.007 b 0.276 ± 0.005 bc 0.287 ± 0.012 c 0.867 ± 0.008 c
A35 黄绿
Yellow-green
0.775 ± 0.006 d 0.841 ± 0.003 a 0.573 ± 0.02 c 0.121 ± 0.006 a 0.296 ± 0.010 b 0.331 ± 0.010 b 0.797 ± 0.004 e
A36 黄绿
Yellow-green
0.768 ± 0.001 d 0.825 ± 0.006 a 0.686 ± 0.010 ab 0.098 ± 0.005 bc 0.216 ± 0.007 d 0.374 ± 0.010 a 0.898 ± 0.007 b
3 讨论
本研究在大白菜 DUS 标准的基础上，结合叶绿素 a 含量，将大白菜叶色标准分级进一步细化，
共分为深绿色、灰绿色、绿色、浅绿色、白绿色、白浅绿色、黄绿色、黄浅绿色、黄色共计 9 种不
11 期 刘梦洋等：大白菜叶色突变体的 HRM 鉴定及其叶绿素荧光参数分析 2223
同叶色类型，为区分大白菜叶色变异提供了分级参考。
针对大白菜叶色突变体叶片叶绿素荧光参数进行了分组分析，发现吸光系数 Abs 在一定程度上
反映叶绿素含量值的高低。叶色的变异对 PSⅡ最大光化学量子产量 Fv/Fm的影响不大，但是黄浅绿
色⑧组和黄色⑨组的实际光化学量子产量 Y（Ⅱ）值明显下降，说明叶绿素含量显著降低会影响实
际利用的光量子产额。调节性能量耗散的量子产量 Y（NPQ）和非调节性能量耗散的量子产量 Y（NO）
是衡量 PSⅡ活性的最重要指标（李志博 等，2005）。Y（NPQ）值在各组中差异不明显；但是 Y（NO）
值在灰绿色②组中明显低于其他组，黄色⑨组明显高于其他组，说明灰绿色突变体主要是将光能用
于光合电子传递，而黄色突变体未将过剩光能转换成调节机制。光化学荧光猝灭 qP 在一定程度上
与叶绿素缺乏存在联系（Genty et al.，1990），在②组中 qP 明显高于其他组，⑥、⑦、⑧、⑨组明显
低于其他组；非光化学荧光猝灭 qN反映的是 PSII 天线色素吸收的光能以热形式耗散，也是一种自我
保护机制（Ogren，1991），叶绿素的变化可能会影响 qN值，①、②、⑦、⑧、⑨组 qN值高于其他组。
通过 HRM 技术发现叶色突变体相关基因可能存在单个碱基的突变。根据检测曲线的形状将不
同颜色如灰色和红色曲线（图 3）视同为一组（图 4 中黄色表示），保证了分析的准确性。
黄叶特异基因 YLS 与叶片衰老有关，编码叶片衰老过程中的相关蛋白（Yoshida et al.，2001），
但是 YLS 基因对叶片颜色影响的机制还不清楚。YLS2 预测编码异胡豆苷合成酶（Strictosidine
synthase），但缺少一个保守的谷氨酸残基，具体功能尚未明确；YLS4 编码天冬氨酸转氨酶相关的叶
绿素同工酶；YLS7 编码叶片衰老相关蛋白；YLS8 编码二甲基酰胺（Dimethyladenosine 1，DIM1）
同系物。本试验中发现了 4 个 YLS 变异的突变体 20 株，是否为产生叶色变化的主要原因还需要进
一步研究。
叶绿素相关基因 ATRCCR 和 CLH2 是叶绿素分解过程中的重要基因。ATRCCR 影响红色叶绿素
代谢产物还原酶（Red chlorophyll catabolite reductase，RCCR）催化分解叶绿素卟啉组件，进一步影
响蓝色荧光中间产物（pFCC-1-producing）（Mayer et al.，1999），突变体 A9 叶片颜色变深可能与该
基因突变有关。CLH2 编码叶绿素酶，该酶是叶绿素分解过程中的起始酶，它催化叶绿素形成脱植
基叶绿素和叶绿醇，突变体 A2 叶片颜色变深，A42 叶片颜色变浅可能与该基因突变有关。基因 PORA
和原叶绿素酸酯氧化还原酶（Protochlorophyllide oxidoreductase A，NADPH）有关，NADPH 是叶绿
素生物合成途径中重要的酶之一，它催化原脱植基叶绿素（Protochlorophyllide，Pchlide）在光下还
原成脱植基叶绿素（Chlorophyllide，Chlide），Kim 等（2012）推测该基因的突变可能是叶片颜色变
浅的主要因素。
基因 HCF164 主要编码细胞色素 b6f 蛋白复合体（Cytochrome b6f，Cyt b6f），该复合体是光合膜
上参与放氧光合作用电子传递链主要超分子蛋白复合体之一（Wang et al.，1997），它含有的 Chl.a
分子被激发后可以破坏蛋白复合体，突变体可能会导致 Chl.a 的光学性质发生改变，使其荧光产率
增强。本研究中通过对高叶绿素荧光基因 HCF164 的 HRM 筛选并结合叶绿素荧光参数分析，发现
了 1 个浅绿色突变体 A21、2 个黄绿色突变体 A29 和 A35。其中 A21 虽然叶色浅绿，可以捕获较多
光能，用于消耗的光能较少，但用于光合电子传递的光能并未增加，推测可能是光合电子传递途径
受阻；A35 叶绿素合成受阻，虽然捕获光能和光能转换效率高，但是仅有少部分用于光合电子传递，
大部分以能量耗散的形式释放；A29 叶色为黄绿色，但是能高效利用光能，有效转化为光化学电子
份额，热耗散量少。上述突变体的发现表明，高叶绿素荧光基因 HCF164 能够高效地筛选大白菜叶
色突变体，黄绿色突变体 A29 通过叶绿素荧光参数分析表现为高光合效率，但其在实际生产过程中
的产量及生长表现还需进一步确定。
综合分析，叶绿素相关基因 ATRCCR、CLH2、PORA、HCF164 是大白菜生殖生长时期叶片颜
色变化的重要基因，叶色变化和叶绿体的合成分解途径紧密相关，任何一个环节发生突变都有可能

2224 园 艺 学 报 41 卷
发生叶色突变，但是尚不能确定哪几个基因变化会对叶片颜色产生特定类型的变化，有必要进一步
研究叶绿素相关基因的表达。

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