全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（2）：333–340 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–10–23；修回日期：2013–01–21
基金项目：四川省教育厅重点培育专项（2011A005）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wangxrtj@163.com）
基于 SSR 标记的四川野生中国樱桃遗传多样性
和居群遗传结构分析
陈 娇 1,2，王小蓉 1,2,*，汤浩茹 1,2，陈 涛 1,2，黄晓姣 1,2，梁勤彪 1,2
（1 四川农业大学园艺学院，四川雅安 625014；2 四川农业大学果蔬研究所，成都 611130）
摘 要：采用 SSR 分子标记技术对四川野生中国樱桃 5 个居群共 133 株的遗传多样性水平及居群的
遗传结构进行了研究。结果显示：10 对 SSR 引物共检测到 78 个等位基因，平均每位点等位基因 7.8 个。
Nei’s 基因多样性指数（H）为 0.6112 ~ 0.6689，Shannon’s 信息指数（I）为 1.1984 ~ 1.3786。基于分子方
差分析（AMOVA），92.53%的变异来自居群内，7.47%的遗传变异来自于居群间。居群间遗传距离（GD <
0.2416）、遗传一致度（GI > 0.7854）、遗传分化指数（Fst = 0.0844）以及较强的基因流（Nm = 2.7125）均
表明居群间的遗传分化水平较低，居群内存在显著近交现象（Fis = 0.3986），且居群在大多数位点上偏离
Hardy-Weinberg 平衡。基于上述结果，分析讨论了居群较高遗传多样性和居群间较低遗传分化形成的可能
原因，并提出野生中国樱桃的保护利用策略。
关键词：野生中国樱桃；SSR；遗传多样性；遗传结构
中图分类号：S 662.5 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）02-0333-08

Assessment of Genetic Diversity and Populations Genetic Structure in Wild
Chinese Cherry from Sichuan Province Using SSR Markers
CHEN Jiao1,2，WANG Xiao-rong1,2,*，TANG Hao-ru1,2，CHEN Tao1,2，HUANG Xiao-jiao1,2，and
LIANG Qin-biao1,2
（1College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Ya’an，Sichuan 625014，China；2Institute of Pomology and
Olericulture，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China）
Abstract：Genetic diversity and genetic structure of five wild Chinese cherry（Prunus pseudocerasus
Lindl.）populations from Sichuan were investigated using ten SSR markers selected from 31 markers. A
total of 78 alleles were successfully amplified，and the number of alleles per locus ranged from 5 to 10，
with an average of 7.8. The relatively high levels gene diversity（H：0.6112–0.6689）and Shannon’s
diversity（I：1.1984–1.3786）revealed relatively rich genetic diversity in the five wild Chinese cherry
populations. The AMOVA analysis revealed low genetic differentiation among populations，with only
7.47% of total variability partitioned among populations（P < 0.001）. This consisted with genetic distance
（GD < 0.2416)，genetic identity（GI > 0.7854），genetic differentiation（Fst = 0.0844）and strong gene
flow（Nm = 2.7125）. Five populations showed inbreeding and deviated from Hardy-Weinberg Equilibrium


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at most loci. Based on these results，the possible formation of the high level genetic diversity and the low
genetic differentiation were discussed， and further strategies and suggestions for utilization and
conservation of these resources were also proposed.
Key words：wild Chinese cherry；Prunus pseudocerasus；SSR；genetic diversity；genetic structure

据《中国植物志》记载，中国有 46 种原产樱亚属植物，四川分布有 30 种以上，很多野生樱桃
个别性状突出，其中野生中国樱桃（Prunus pseudocerasus Lindl.）分布广且多样性丰富（俞德浚，
1986；黄晓姣 等，2011）。据资料和近年的调查，野生中国樱桃中不乏风味佳、产量高的野生个体，
而现栽培中国樱桃总体已表现出遗传背景狭窄，部分资源已经或正在流失。因此，深入研究该地区
野生中国樱桃居群遗传多样性水平及居群遗传结构，对科学有效制定野生樱桃资源保护策略，收集
野生优良樱桃资源，丰富和改良现有栽培品种，以及探明中国樱桃的起源、演变都具有重要意义。
过去对中国樱桃遗传多样性的研究多以栽培品种为主，多基于形态（王贤荣和向其柏，1997）、
花粉亚显微形态（周丽华 等，1999；雷海清，2001）以及基于显性分子标记如 RAPD（蔡宇良 等，
2006；Cai et al.，2007；宋常美和文晓鹏，2011）和 ISSR（宋常美 等，2011）的种质资源分析。而
对野生居群遗传多样性及遗传结构研究较少，仅见基于 RFLP（曹东伟 等，2007）和 ISSR（Li et al.，
2009）标记的研究，而由于其标记本身揭示的遗传信息量有限以及涉及单个居群样本数量较小，说
服力有限。SSR（simple sequence repeat）标记具有多态性丰富、共显性遗传特性，较 RFLP 成本低
而简便，已被成功用于樱亚属植物居群遗传分析（Yoshiaki et al.，2009；Mariette et al.，2010；Antonius
et al.，2012）。目前国内外尚未见采用 SSR 标记对中国樱桃居群遗传多样性及居群遗传结构进行研
究的报道。本研究中选取四川野生中国樱桃分布较密集的 5 个居群为研究对象，采用 SSR 标记探究
其遗传多样性以及居群遗传结构，以期明确该范围内现存居群的遗传多样性水平及居群遗传结构，
以此为中国樱桃资源的有效保存和合理利用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于 2009—2012 年进行。选取 5 个四川野生中国樱桃分布广泛的代表采样点（表 1），根据
居群现有分布规模对每个居群以株为单位随机取样，样本间距离大于 50 m，共 133 株。以株为单位
采集幼叶立即放入装有干燥硅胶的自封塑料袋中干燥，备用。

表 1 来自四川的 5 个野生中国樱桃居群采样点概况
Table 1 Description of the five sampling sites of wild Chinese cherry in Sichuan Province
居群代号
Population code
居群来源地
Sampling localities
样本数量
Sample size
海拔/m
Altitude
纬度
Latitude（N）
经度
Longitude（E）
QC
SM
YZ
GX
TL
青川县清溪镇 Quixi，Qingchuan
石棉县栗子坪乡 Liziping，Shimian
雅安周公山 Zhougongshan，Ya’an
北川县桂溪乡 Guixi，Beichuan
北川县桃龙乡 Taolong，Beichuan
23
11
23
44
32
1304
1725
828
876
1566
32°24′09.9″
29°31′42.8″
29°54′25.6″
32°00′50.4″
31°59′39.6″
104°50′03.5″
102°10′44.4″
103°0146.3″
104°39′66.1″
104°07′33.7″
1.2 DNA 提取和 SSR-PCR
采用改良 CTAB 法提取基因组 DNA（Li et al.，2009）。SSR-PCR 采用包含 0.2 mmol · L-1 引物，
30 ~ 60 ng DNA 模板，10 µL PCR MIX 混合液（天根公司）共 20 µL 反应体系。其反应程序为：94 ℃
预变性 4 min；94 ℃变性 1 min，54 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，共 34 个循环后 72 ℃延伸
2 期 陈 娇等：基于 SSR 标记的四川野生中国樱桃遗传多样性和居群遗传结构分析 335

10 min。选择来自蔷薇科 31 对 SSR 引物（21 对来自甜樱桃和 10 对来自桃），根据居群规模从 5 个
居群中随机取样 42 份作为引物筛选，从中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富、重复性好的 10 对 SSR
引物（表 2）。用此 10 对引物对全部样品进行 PCR 扩增，PCR 扩增产物用 8%的变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳分离，改良银染法染色（梁宏伟 等，2008），对所呈现的带谱进行统计。

表 2 筛选出的适合本研究的多态性 SSR 引物信息
Table 2 Polymorphic SSR primers used for the analyses of all 133 P. pseudocerasus samples
引物名称
Primer name
观测等位基因
Na
来源
Origin
引物获得文献
Reference of primers
EMPA022
EMPA026
EMPA027
EMPaS02B
EMPaS06B
EMPaS12A
pchgms1
UDP98-022
UCD-CH31
UCD-CH39
5
9
7
10
8
5
10
7
10
7
甜樱桃 Prunus avium
甜樱桃 Prunus avium
甜樱桃 Prunus avium
甜樱桃 Prunus avium
甜樱桃 Prunus avium
甜樱桃 Prunus avium
桃 Prunus persica
桃 Prunus persica
甜樱桃 Prunus avium
甜樱桃 Prunus avium
Clarke et al.，2009
Clarke et al.，2009
Clarke et al.，2009
Vaughan & Russell，2004
Vaughan & Russell，2004
Vaughan & Russell，2004
Sosinski et al.，2000
Testolin et al.，2000
Struss et al.，2003
Struss et al.，2003

1.3 数据分析
根据分子量大小对扩增结果读带，从大到小依次记为 A，B，C……（万宣伍 等，2010）。利用
Popgene 1.31 软件（Yeh et al.，1999）获得用于评价居群遗传多样性的指标，包括多态性位点比率
（PPL）、观测等位基因数（Na）、期望杂合度（He）、观测杂合度（Ho）、Nei’s 基因多样性指数（H）、
Shannon’s 信息指数（I）、总遗传多样性（Ht）、居群内的遗传多样性（Hs）和居群间遗传多样性（Dst），
及反映居群遗传结构指标，包括种群间分化系数（Fst）、基因流（Nm）、Nei’s 标准遗传距离（GD）
和遗传一致度（GI）。利用 FSTAT V2.9.3.2（Goudet，2001）计算居群内及物种近交系数（Fis）及其
显著性检验。
据 Tabare（2001）统计各居群稀有等位基因数量（频率小于 0.05 的等位基因的数量）和各居群
特有等位基因数量（同一位点仅某个居群含有的等位基因的数量）。
用 Arlequin3.0 软件（Excoffier et al.，2005）中的分子方差分析（AMOVA）估测遗传变异在居
群间和居群内的分布及居群遗传分化显著性检验，并进行遗传距离与地理距离的 Mantel 相关性检
验。居群间遗传距离聚类图的绘制用 MEGA4 软件（Tamura et al.，2007）采用 UPGMA 法完成。
2 结果与分析
2.1 SSR 引物扩增结果
根据结果统计可得，每对引物扩增一个位点，各位点等位基因数在 5 ~ 10 个之间（表 2）。除引
物 UDP98-022 在石棉栗子坪（SM）居群中表现出条带单一，其他各引物在各居群内均呈现多态性，
总多态性位点比例达 98%。开发自甜樱桃的 SSR 引物多态性低于开发自桃的 SSR 引物（等位基因
比为 7.0︰7.5），与 Mariette 等（2010）的研究结果一致。除 EMPaS12A 外，各引物在各居群中均扩
增得稀有等位基因。引物 EMPA022、EMPA026、EMPA027、EMPaS02B、UDP98-022、pchgms1 在
部分居群内得到居群的特有等位基因。图 1 为引物 pchgms1 在北川桂溪（GX）居群上的扩增电泳
图。
336 园 艺 学 报 40 卷








图 1 引物 pchgms1 对中国樱桃基因组 DNA 的扩增图谱
1 ~ 44：北川桂溪（GX）居群的 1 ~ 44 号单株；M：DNA 标准分子量。
Fig. 1 SSR amplification pattern of Chinese cherry genomic DNA by primer pchgms1
1–44：The samples of Guixi，Beichuan（GX）population；M：DNA molecular weight marker.

2.2 居群内遗传多样性
10 对引物在 133 份样品上总共扩增到 78 个等位基因，平均每个位点 7.8 个。在居群水平上 Ht、
Hs 及 Dst 的平均值分别为 0.6953、0.6357 和 0.0596。北川桃龙（TL）居群的基因多样性指数最高
（H = 0.6689），次之为北川桂溪（GX）居群（H = 0.6482），雅安周公山（YZ）居群最低（H = 0.6112），
青川清溪（QC）、石棉栗子坪（SM）居群分别居中。北川桂溪（GX）较北川桃龙（TL）居群 Shannon’s
指数高，其余 3 个居群高低与基因多样性指数一致（表 3）。
5 个居群均出现了稀有等位基因，北川桃龙（TL）中最多（15 个），北川桂溪（GX）次之（13
个），石棉栗子坪（SM）最少（1 个）。而特有等位基因只出现在北川桂溪（GX）居群（3 个）、北
川桃龙（TL）居群（2 个）和石棉栗子坪（SM）居群（1 个）。

表 3 基于 10 对 SSR 引物的 5 个中国樱桃居群的遗传多样性水平
Table 3 Statistics analysis of genetic diversity for the five wild populations of Chinese cherry based on 10 SSR markers
居群代号
Population code
多态位点比率/ %
Percentage of
polymorphic loci
PPL
观测杂合度
Observed
heterozygosity
Ho
期望杂合度
Expected
heterozygosity
He
基因多样性
Nei’s expected
heterozygosity
H
Shannon’s 信息指数
Shannon’s information
index
I
QC
SM
YZ
GX
TL
平均 Mean
种级水平 Species level
100
90
100
100
100
98
100
0.3938
0.3646
0.3976
0.4145
0.4190
0.3979
0.4057
0.6483
0.6521
0.6307
0.6567
0.6810
0.6538
0.6984
0.6316
0.6185
0.6112
0.6482
0.6689
0.6357
0.6953
1.2869
1.1984
1.2043
1.3786
1.3678
1.2872
1.5256

2.3 居群遗传结构
居群间遗传距离（GD < 0.2416）较小，居群遗传一致度较高（GI > 0.7854）（表 4）。
表 4 居群间的 Nei’s 遗传距离（GD）和遗传一致度（GI）
Table 4 Nei’s genetic distance and genetic identity between populations
居群代号 Population code QC SM YZ GX TL
QC 0.8385 0.8514 0.8534 0.7854
SM 0.1762 0.7867 0.7965 0.8035
YZ 0.1609 0.2399 0.8547 0.8085
GX 0.1585 0.2275 0.1570 0.8139
TL 0.2416 0.2187 0.2125 0.2059
注：Nei’s 遗传距离（下三角）、遗传一致度（上三角）。
Note：Nei’s genetic distance（below diagonal）and genetic identity（above diagonal）.
2 期 陈 娇等：基于 SSR 标记的四川野生中国樱桃遗传多样性和居群遗传结构分析 337

分子方差分析（AMOVA）表明，92.53%的变异来自居群内，而 7.47%的变异来自居群间（P <
0.0001），居群内差异呈极显著性。居群间平均分化系数 Fst为 0.0844，居群间分化呈显著性（P < 0.05），
总的基因流估算值 Nm为 2.7125。居群内及物种近交系数分别为 0.3986、0.4200，均出现显著近交现
象（P < 0.001）。除 EMPA022 引物位点，居群在其余位点均偏离 Hardy-Weinberg 平衡（P < 0.05），
其表现为观测杂合度显著低于期望杂合度（表 3）。
2.4 聚类结果
基于中国樱桃居群间遗传距离（Nei，
1978），采用 UPGMA 法进行聚类分析，进一
步直观分析居群间遗传关系，如聚类图（图 2）
所示。雅安周公山（YZ）与北川桂溪（GX）
居群遗传距离最小，并与青川清溪（QC）居群
聚在一起组成第一组，而石棉栗子坪（SM）和
北川桃龙（TL）居群分别各居第二组和第三组，
表现出较远遗传距离。Mantel 相关性矩阵检验
表明，居群间遗传距离与地理距离不存在相关
性（r =–0.136，P = 0.637）。
3 讨论
3.1 中国樱桃居群及其物种水平遗传多样性
观测等位基因数（Na）是衡量 SSR 位点多态性和居群变异程度高低的重要指标。本研究中 5 个
中国樱桃野生居群在 10 个 SSR 位点上的平均观测等位基因数为 7.8，高于 Satoshi 等（2005）研究
的 11 种樱亚属观花树种（3.0 ~ 7.7）。与 551 个个体的欧洲甜樱桃研究相比，EMPaS02B 引物扩增出
的等位基因数稍高（为 10︰8），而 EMPaS06B、EMPaS12A 引物的稍低（分别为 8︰9 和 5︰7）（Vaughan
et al.，2007），其高低与研究对象的遗传特性有关，并在一定范围内随居群的个体增加而升高（黄磊
和王义权，2004）。Nei’s 基因多样性指数（H）和 Shannon’s 信息指数（I）是评价遗传多样性的重
要指标。本试验中的 5 个野生中国樱桃居群在 10 个 SSR 位点上得到其物种水平上 H = 0.6953，I =
1.5256，两者都高于马哈利樱桃 Prunus mahaleb（H = 0.1144，I = 0.1720；Jordano & Godoy，2000）
及其同属于蔷薇科的新疆野苹果 Malus sieversii（H = 0.262，I = 0.408；张春雨 等，2009）和同属
于李属的杏 Prunus armeniaca（H = 0.287，I = 0.458；He et al.，2007）。上述与多个近缘物种的多项
指标比较表明，本研究涉及的 5 个野生中国樱桃居群的遗传多样性水平较高。从地域分布来看，以
北川桃龙（TL）、北川桂溪（GX）和青川清溪（QC）居群遗传多样性较高，雅安周公山（YZ）居
群最低，表现出四川北部靠近秦岭以南区域的遗传多样水平更高。
此外，由 5 个居群均发现稀有等位基因的结果可知，居群中承载某些遗传变异的等位基因的频
率低于 0.05，其很可能仅存于某一个或极少数个体上，表明这些遗传变异正面临流失（黄磊和王义
权，2004）。而石棉栗子坪（SM）、北川桂溪（GX）和北川桃龙（TL）居群含有特有等位基因。
本试验中的北川桂溪居群（GX）成熟果实平均可溶性固形物含量达 21%，甚至有的个体高达
28%，很有开发利用价值。尽管 SSR 多态等位基因与表型的相关性还需进一步研究才能得到，然而
性状优良且含有特有等位基因的居群应该引起重视。
图 2 基于 Nei’s 遗传距离的居群 UPGMA 聚类图
Fig. 2 UPGMA dendrogram based on Nei’s genetic distance
338 园 艺 学 报 40 卷

3.2 居群遗传结构
遗传分化是反映遗传结构的重要指标。如前所述，本研究中的中国樱桃野生居群间分化程度低
（Fst = 0.0844），大部分变异来自于居群内（92.53%），与亲缘关系较近的其它樱亚属植物基于 SSR
标记的研究有类似结果（Yoshiaki et al.，2009；Shuri et al.，2011），而且这些研究均表明遗传距离
与地理距离不相关或者相关性很低。而 Li 等（2009）基于 ISSR 标记分析获得的共 80 个个体的 10
个野生中国樱桃居群的居群遗传分化很大，且变异主要来自居群间，与上述结果有明显差异。这可
能与采样地不同有关，但更可能与其选用的显性 ISSR 标记和单个居群的个体数量偏小有关，因为
研究居群的大小及其对有效居群的代表性，会影响对居群遗传结构的评价（Estoup & Anges，1998）。
基因流一定程度上能反应居群间遗传物质的交流。Slatkin（1981）认为大于 1 的基因流 Nm会抵制遗
传漂变的作用，防止由此导致的居群遗传分化的发生。本研究中测得居群间基因流 Nm值为 2.7125，
表明影响本研究中 5 个居群遗传结构的主导因素很可能是由于居群间存在一定的基因交流。并且由
于本研究涉及的 5 个居群均来自人迹罕至的天然林区，推测河流和以樱桃果实为生的鸟兽是远距离
的传播基因交流的主要方式，在马哈利樱桃（Godoy & Jordano，2001）的研究也有类似推测。
评价居群遗传结构还需要结合物种的交配系统、繁殖特性、历史自然事件的发生等因素综合分
析（Hamrick et al.，1992）。Hardy-Weinberg 平衡可以反映交配系统对基因型频率的影响（Stark，2006）。
5 个中国樱桃野生居群在绝大部分位点均表现偏离 H-W 平衡，杂合度不足，纯合子代所占比例较高，
这与其具有天然的自交繁育系统有关（李晓 等，2007）。因为长期自交的植物或自花授粉植物在其
进化过程中会提高物种的纯合度，另一方面也降低物种的遗传多样性（Nybom，2004；Glémin et al.，
2006）。因此，理论上中国樱桃野生居群的遗传多样性应该不高，但本试验中各项指标均显示其遗传
多样性却较为丰富。究其原因：一是可能与其自身繁殖特性相关，中国樱桃野生居群基本以实生繁
殖为主，种子结实量大，树株抗逆性强，寿命长，居群延续持久，有利于遗传变异在居群中的保存；
二是由于四川北部与秦岭多样性中心相邻，推测这里的居群较为古老，长期的居群演化和延续使其
沉积较多遗传变异。更确切结果有待进一步研究。此外，值得注意的是，本研究中遗传多样性最高
的 3 个居群：北川桂溪（GX）、北川桃龙（TL）和青川清溪（QC）的地理位置恰好处于龙门山地
震带上，其历史上频繁的地震对中国樱桃野生居群的分布与遗传结构的形成可能有一定影响，此推
测若被证实将为进一步探究中国樱桃的分化样式及起源、演变提供重要线索。
根据野外实地调查得知，野生中国樱桃多以大范围零散分布为主，分布残缺，居群丢失较为严
重。结合本研究野生中国樱桃单个居群内遗传多样性较为丰富，而居群间遗传分化较小的结果，认
为在中国樱桃保护策略上，野生居群保护需给予重视。应在较大范围内保护现有个体数量维护居群
的完整性，同时应防止边缘个体因人为开采被损伤而造成潜在变异资源流失。在中国樱桃的遗传改
良和变异筛选工作中，可优先考虑从遗传多样性较丰富的居群获取材料，并可优先考虑在含特有等
位基因的居群内进行优良变异单株的选择。

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