全 文 ：园 艺 学 报 ， （ ）： – 2014 41 11 2196 2207 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–07–08；修回日期：2014–10–10
基金项目：国家自然科学基金项目（31201592）
梨反转录转座子逆转录酶序列预测及其进化和
转录分析
蒋 爽，蔡丹英，滕元文*
（浙江大学园艺系，农业部园艺植物生长发育与品质调控重点开放实验室，杭州 310058）
摘 要：基于生物信息学方法对‘酥梨’基因组中不同类型的逆转录酶进行预测，共获得 345 条 copia
类和 99 条 gypsy 类逆转录酶。通过系统聚类，copia 类逆转录酶可分为 Ivana、Ale、TAR、Angela、Maximus
和 Bianca 等 6 类；gypsy 类逆转录酶可分为 Athila、Tat、CRM、Reina 和 Tekay 等 5 类。序列比对结果显
示梨中逆转录酶具有较高的异质性，copia 类逆转录酶序列分歧度为 0.44，gypsy 类为 0.38。挑选出 8 类
逆转录酶设计引物，并对梨属其它植物进行 PCR 扩增，结果显示这 8 类逆转录酶广泛存在于梨属植物中。
在砂梨品种‘圆黄’的叶片、种子和果实中均发现该 8 类逆转录酶存在一定的转录水平，这是首次发现
在梨属植物正常生长组织中逆转录酶发生转录。
关键词：梨；Ty1-copia；Ty3-gypsy；逆转录酶；预测
中图分类号：S 661.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）11-2196-12

Prediction，Evolution and Expression Analysis of Reverse Transcriptase of
LTR Retrotransposons in Pear
JIANG Shuang，CAI Dan-ying，and TENG Yuan-wen*
（Department of Horticulture，The State Agricultural Ministry Laboratory of Horticultural Plant Growth，Development &
Quality Improvement，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）
Abstract：Different types of reverse transcriptase（RT）sequences in the whole genome of Pyrus
pyrifolia white pear group‘Suli’were predicted by bioinformatics methods. A total of 345 RT sequences
were obtained from copia group and 99 RT sequences were from gypsy group. The cluster analysis
indicated that there were six lineages（Ivana，Ale，TAR，Angela，Maximus and Bianca）in copia group
and five lineages in gypsy group（Athila，Tat，CRM，Reina and Tekay）. Sequence alignment showed a high
heterogeneity in both copia group and gypsy group，and the divergence of RT in both groups was 0.44 and
0.38，respectively. Eight types of RT were selected to design primers，each pair of primers showed clear
amplified bands by PCR using genomic DNA of other Pyrus species. Eight types of RT were expressed
with different levels in leaves，seeds and fruits of‘Wonhwang’pear，which was the first report on the
expression of RT in the organs of pear trees under normal growing condition.
Key words：Pyrus；Ty1-copia；Ty3-gypsy；reverse transcriptase；prediction

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：ywteng@zju.edu.cn）
11 期 蒋 爽等：梨反转录转座子逆转录酶序列预测及其进化和转录分析 2197
反转录转座子是真核生物基因组中普遍存在的一类可移动的遗传因子，它们以 RNA 为媒介，
在基因组中不断自我复制（Beauregard et al.，2008）。在高等植物中，反转录转座子有丰富的拷贝，
是基因组的重要成分之一（Ellis et al.，1998；Kalendar et al.，2000；Petit et al.，2007）。反转录转
座子的转座机制不同于其它转座元件，它首先转录形成 RNA，再以 RNA 为媒介在逆转录酶作用下
逆转录成 DNA，最终插入到基因组的靶基因片段上。这种“复制—粘贴”的转座机制使得反转录转
座子能够快速自我扩增，从而在漫长的进化历史中改变整个基因组的大小（Kumar & Bennetzen，
1999；Havecker et al.，2004）。植物中反转录转座子根据其结构域可以分为 5 大类型（Wicker & Keller，
2007），其中以 LTR 反转录转座子报道较多。逆转录酶在 LTR 反转录转座子转座过程中发挥重要
的作用，而在梨基因组中，25.5%和 16.9% 的基因组为 copia 类型和 gypsy 类型反转录转座子（Wu et
al.，2013）。因而逆转录酶的特征及其转录水平是深入研究反转录转座子在梨属植物进化过程中作
用的关键。Wicker 和 Keller（2007）在研究水稻、小麦和拟南芥的逆转录酶后认为在单子叶和双子
叶植物分化前 copia 类型逆转录酶就存在有 6 个原始支系，分别为 Maximus、Ivana、Ale、Angela、
TAR 和 Bianca。植物中 gypsy 类型逆转录酶也可以分为 6 大支系，分别为 Galadriel、CRM、Reina、
Takay、Tat 和 Athila（Lloren et al.，2009）。
逆转录酶基因序列存在保守部分，前人的研究中多使用简并引物采用基因克隆方式测序得到反
转录转座子中的逆转录酶序列（Ma et al.，2008；刁卫平 等，2012；范付华 等，2012；Fan et al.，
2013）。周鹏等（2014）通过简并引物从早酥梨及红色芽变材料中共扩增获得了 59 条 copia 类型逆
转录酶序列。但通过 PCR 扩增方式获得序列存在以下不足：（1）使用的简并引物并不能通用于所有
植物；（2）使用克隆测序得到的序列多为逆转录酶的部分序列；（3）通过 PCR 扩增并不能够扩增出
全部类型的逆转录酶序列。由于一些分布广泛的逆转录酶在 PCR 过程中存在优势扩增现象，造成测
序结果中逆转录酶类型少。随着越来越多的生物基因组的公布，可以用生物信息学的方法进行预测，
从而克服上述缺点。本研究中使用生物信息学的方法从已经公布的‘酥梨’基因组（Wu et al.，2013）
数据中分离出编码逆转录酶的基因序列，并分析这些序列的特点，同时根据一些高同源性的逆转录
酶基因序列设计引物并对其在梨不同组织中的转录水平进行研究，进一步了解反转录转座子在梨属
植物中的转座情况，有助于深入了解梨属植物进化过程中的基因组变化。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以‘酥梨’基因组数据（AJSU00000000）为基础，采用生物信息学方法预测逆转录酶序列。2013
年 4 月选择‘圆黄’（Pyrus pyrifolia Nakai‘Wonhwang’）、‘酥梨’（P. pyrifolia white pear group‘Suli’）
（Bao et al.，2008）、杜梨（P. betulaefolia Bge.）、‘考密斯’（P. communis L.‘Comice’）叶片提取
DNA（Doyle & Doyle，1987）作为后续试验的 PCR 模板。从‘圆黄’梨的叶片、果肉、果皮及种
子中提取 RNA（Zhang et al.，2011），用分光光度计测试浓度，选择 1 μg RNA 逆转录成 cDNA 备
用。
1.2 逆转录酶序列的预测及聚类分析
采用 LTR-harvest（Ellinghaus et al.，2008）对‘酥梨’基因组进行反转录转座子的预测，将预
测获得的反转录转座子和 Repbase（http：//www.girinst.org/repbase/）数据库进行比对并将反转录转
座子分为 copia 类型和 gypsy 类型，将分类后的序列翻译成氨基酸序列（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/st/
emboss_transeq/）。采用 Hmmer3.0（Eddy，1998）并根据 RVT_1（Pfam：PF00078）和 RVT_2（Pfam：

2198 园 艺 学 报 41 卷
PF07727）逆转录酶蛋白质家族结构域（http：//pfam. janelia. org/）分别对反转录转座子序列中逆转
录酶序列进行预测，所得到匹配的氨基酸序列即为反转录转座子逆转录酶序列。根据 Pfam 数据库
中逆转录酶蛋白质家族结构域的描述，RVT_1 和 RVT_2 涵盖了绝大部分物种中的逆转录酶类型，
在 Hmmer 检索过程中发现根据 RVT_2 只能在‘酥梨’copia 类型反转录转座子中找到逆转录酶，而
根据 RVT_1 仅在 gypsy 类型反转录转座子中发现逆转录酶。说明 Pfam 数据库中这两种类型逆转录
酶分别代表了反转录转座子中的 copia 和 gypsy 类型逆转录酶，这与 Muszewska 等（2011）的研究
结果一致。根据 Hmmer 检索结果，通过 Bioperl 程序查找梨基因组中与氨基酸序列对应的碱基位置。
采用 Clustal W 软件对逆转录酶氨基酸序列进行多重比对，采用 MEGA5.0（Tamura et al.，2011）
NJ 法构建系统发育进化树。采用 dnasp5（Rozas et al.，2003）计算支系同义突变和非同义突变。
1.3 逆转录酶基因序列的PCR扩增
选择成员数多、相似度大的 8 种类型逆转录酶设计引物，对梨属其它植物 DNA 进行 PCR 扩增。
反应体积 20 μL。95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 次循环；72 ℃ 10 min。
1.4 ‘圆黄’梨不同组织中逆转录酶基因的半定量分析
使用内参基因 actin（PyActin，JN684184）对‘圆黄’梨叶片、果肉、果皮以及种子中获得的
cDNA 分别进行 23、26、29 和 32 个循环的 PCR 扩增，根据电泳结果调整上述样品浓度使其一致。
选择 8 种类型逆转录酶引物对调整浓度后的样品分别进行 PCR 扩增并电泳检测。
2 结果与分析
2.1 反转录转座子及逆转录酶的预测
从‘酥梨’全基因组中共预测出 1 836 条反转录转座子并将其分为 copia 和 gypsy 类型，将每条
序列翻译成 6 种类型的氨基酸序列，共获得 11 016 条。对预测的反转录转座子氨基酸序列中逆转录
酶进行预测，共获得 769 条 copia 和 121 条 gypsy 类型逆转录酶（表 1）。

表 1 梨中不同类型逆转录酶的数量
Table 1 The number of copia and gypsy RT sequences in pear
类型
Group
移码突变
Frameshift mutation
终止突变
Prop. stops
后续分析
Sequences for analysis
总计
Total
copia 209 215 345 769
gypsy 2 20 99 121

copia 类型和 gypsy 类型逆转录酶氨基酸序列长度分别为 246 和 216 个氨基酸。本试验中获得的
copia 类逆转录序列平均长度为 242 个氨基酸，与数据库中数据相近，而 gypsy 为 153 个氨基酸。通
过比对‘酥梨’gypsy 逆转录酶和 RVT_2 蛋白质结构域发现，‘酥梨’中 gypsy 发生了 60 个氨基酸
的缺失。在预测的 769 条 copia 类型逆转录酶氨基酸序列中，209 条较短（< 180 个氨基酸），这些
序列只有部分区域被匹配找到，其余序列未能在 Hmmer 检索中被发现，推测这部分序列可能发生
了移码突变或者较大的变异。215 条序列（30.0%）出现终止密码子突变，剩余 345 条序列被用来做
进一步分析。在 gypsy 类型中，两条序列长度过短（< 120 个氨基酸），20 条序列（16.5%）出现终
止密码子突变。剩余的 99 条序列用做进一步分析。根据 Hmmer 预测的结果分别找到逆转录酶在基
因组中的位置（表 2），大部分序列 AT 含量高。AT 所占比例范围 50.79% ~ 70.83%。
11 期 蒋 爽等：梨反转录转座子逆转录酶序列预测及其进化和转录分析 2199
表 2 copia 类和 gypsy 类逆转录酶基因在‘酥梨’基因组中的位置
Table 2 Positons of copia group and gypsy group RT identified in‘Suli’pear
Copia 位置
Position
AT 含量/%
AT content
Gypsy 位置
Position
AT 含量/%
AT content
Pbcrt4 AJSU01026189（8812-9543） 57.51 Pbgrt3 AJSU01012234（56295-56774） 59.38
Pbcrt20 AJSU01008317（46768-47502） 55.51 Pbgrt10 AJSU01022140（22001-21522） 60.63
Pbcrt31 AJSU01009938（53908-54642） 55.24 Pbgrt11 AJSU01016051（2270-2752） 56.52
Pbcrt33 AJSU01022200（23078-22344） 55.51 Pbgrt14 AJSU01010035（3374-2892） 58.18
Pbcrt40 AJSU01002612（9359-8625） 58.50 Pbgrt16 AJSU01011102（4613-5089） 54.93
Pbcrt45 AJSU01013470（25325-24591） 57.82 Pbgrt20 AJSU01020436（55164-55640） 54.93
Pbcrt78 AJSU01023954（12934-12203） 53.69 Pbgrt38 AJSU01024573（45806-45327） 61.25
Pbcrt80 AJSU01022914（55050-54319） 58.06 Pbgrt39 AJSU01023659（15998-15528） 59.02
Pbcrt102 AJSU01005217（15253-15999） 57.56 Pbgrt40 AJSU01007319（79924-79463） 57.79
Pbcrt116 AJSU01002821（16360-15629） 58.33 Pbgrt44 AJSU01013147（2262-2621） 70.83
Pbcrt125 AJSU01015728（1797-2522） 57.44 Pbgrt47 AJSU01025597（6749-7213） 60.22
Pbcrt142 AJSU01023984（12197-11463） 59.32 Pbgrt55 AJSU01002139（106863-106402） 58.87
Pbcrt171 AJSU01009248（28518-29267） 62.80 Pbgrt59 AJSU01004780（7418-7882） 60.22
Pbcrt184 AJSU01006776（46310-45561） 60.40 Pbgrt60 AJSU01024920（5826-5362） 60.22
Pbcrt197 AJSU01003478（10996-11733） 59.76 Pbgrt61 AJSU01024345（15587-16054） 64.74
Pbcrt218 AJSU01015271（38369-39094） 59.23 Pbgrt68 AJSU01017936（47593-47126） 61.32
Pbcrt220 AJSU01015815（99607-98876） 60.79 Pbgrt74 AJSU01019172（8075-7611） 60.65
Pbcrt221 AJSU01020199（100112-99378） 59.32 Pbgrt78 AJSU01014939（43519-43058） 63.20
Pbcrt228 AJSU01000612（10791-11516） 58.95 Pbgrt85 AJSU01022982（5079-4615） 64.52
Pbcrt230 AJSU01023896（23930-24664） 60.82 Pbgrt94 AJSU01017133（9043-9420） 50.79
Pbcrt233 AJSU01010120（2669-3397） 59.26 Pbgrt96 AJSU01021763（1072-1533） 62.77
Pbcrt251 AJSU01017100（20349-19615） 60.82
Pbcrt256 AJSU01013922（32000-32707） 56.21
Pbcrt257 AJSU01011481（7017-7751） 59.86
Pbcrt259 AJSU01023139（53450-54184） 59.86
Pbcrt288 AJSU01003183（18045-18782） 59.62
Pbcrt302 AJSU01008260（64270-63587） 62.72
Pbcrt324 AJSU01011368（3207-3860） 55.66
Pbcrt329 AJSU01014431（26747-26019） 61.87
Pbcrt330 AJSU01017172（17302-16574） 61.04
注：部分相似性大的序列仅列出一个为代表。
Note：Only one sequence was list in some similarity of sequences.

2.2 逆转录酶的系统进化分析
对预测出的 345 条 Ty1-copia 类逆转录酶氨基酸序列和已鉴别的 39 条其它物种的逆转录酶进行
聚类分析（图 1）。该 39 条序列分别对应了 6 个已报道的 copia 类逆转录酶的 6 个支系（Wicker &
Keller，2007），分别为 Maximus、Ivana、Ale、Angela、TAR 和 Bianca。聚类结果显示‘酥梨’中存
在上述 6 个支系（表 3），其中最大的为 Ivana（150 个成员）和 Ale（115 个成员）。Ivana 可细分为
两个亚支系：I-1 支系包含有 59 个成员，这些成员表现出较高的同源性，平均序列分歧度为 0.14；
而 I-2 支系包含有 91 个成员，平均序列分歧度为 0.35。Ale 支系 115 个成员平均序列分歧度为 0.4，
表现出较高的异质性。Ale 可细分为两个亚支系：A-1 支系序列包含 78 个成员，序列分歧度范围为
0 ~ 0.5，平均为 0.38，说明大部分序列同源性低；A-2 支系包含有 38 个成员，与已报道的大麦 leojyg
逆转录酶聚在一起。Maximus 支系中仅发现了 3 个成员。TAR 支系中共发现了 27 个成员，其中 9 个
成员（Pbcrt 133、126、103、102、87、85、83、152 和 177）表现出较高的同源性（序列分歧度 0.015）。
Angela 支系中有 24 个成员，其中 Pbcrt 279、282、286、288、291、292、294、303、301 和 290 同源
性高。Bianca 支系包含有 26 个成员，该类型反转录转座子最初是从大麦中分离获得。‘酥梨’中 Bianca
支系序列分歧度范围为 0 ~ 0.32，除了 Pbcrt334 和 Pbcrt345 外，其余成员的序列表现出较高同源性。

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11 期 蒋 爽等：梨反转录转座子逆转录酶序列预测及其进化和转录分析 2201


图 1 ‘酥梨’345 条以及已报道的其他植物 39 条 Ty1-copia 类逆转录酶氨基酸序列聚类树
Fig. 1 Phylogenetic tree of the RT in copia group based on 345 RT amino acid sequences of‘Suli’pear and 39 identified
copia-type RT amino acid sequences


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表 3 不同支系 Ty1-copia 类型逆转录酶基因序列变异度分析
Table 3 Within-lineage estimates of RT sequence variation in Ty1-copia
支系 Lineage 数量 Number 长度/平均（bp）Length/Average 变异度/平均 Diversity/Average 非同义突变 πn 同义突变 πs πn/πs
Ty1-copia 345 543 ~ 750/727 0 ~ 0.60/0.44
Ivana 150 585 ~ 738/730 0 ~ 0.51/0.37
Subclade I-1 59 615 ~ 735/728 0.01 ~ 0.47/0.14 0.09 0.30 0.30
Subclade I-2 91 585 ~ 738/731 0 ~ 0.47/0.35 0.23 0.73 0.32
Maximus 3 735 /
Ale 115 543 ~ 735/720 0 ~ 0.54/0.4
Subclade A-1 78 573 ~ 735/719 0 ~ 0.50/0.38 0.28 0.73 0.38
Subclade A-2 37 543 ~ 735/722 0 ~ 0.47/0.33 0.23 0.63 0.37
TAR 27 723 ~ 750/746 0 ~ 0.48/0.32 0.22 0.68 0.32
Angela 24 615 ~ 741/726 0 ~ 0.45/0.32 0.22 0.67 0.33
Bianca 26 636 ~ 729/724 0 ~ 0.32/0.04 0.02 0.09 0.22

将‘酥梨’的 99 条 Ty3-gypsy 和已鉴别的 22 条其它物种分别对应 6 个已报道的支系 Athila、Tat、
CRM、Reina、Galadriel 和 Tekay（Llorens et al.，2009）的序列进行聚类分析（图 2）。‘酥梨’中存
在 5 个支系（表 4），未能找到 Galadriel 支系，绝大部分成员聚类到 Athila 支系（60 个成员）；第 2


图 2 ‘酥梨’99 条以及其他植物 22 条 Ty1-gypsy 类型逆转录酶氨基酸序列聚类树
Fig. 2 Phylogenetic tree of the RT in gypsy group based on 99 RT amino acid sequences of
‘Suli’pear and 22 identified gypsy-type RT amino acid sequences
11 期 蒋 爽等：梨反转录转座子逆转录酶序列预测及其进化和转录分析 2203
大支系 Tat 包含 22 个成员，变异度比 Athila 支系高，但内部存在一个高度同源含有 13 个成员的分
支。另外 3 个支系 CRM（7 个成员），Reina（2 个成员）和 Tekay（5 个成员）包含了较少的成员。
Pbgrt42、43 和 44 被独立聚到一支上，长度为 360 个氨基酸，这些逆转录酶序列有待进一步研究。

表 4 不同支系 Ty3-gypsy 逆转录酶基因序列变异度分析
Table 4 Within-lineage estimates of RT sequence variation in Ty1-gypsy
支系 Lineage 数量 Number 长度/平均（bp）Length/Average 变异度/平均Diversity/Average 非同义突变 πn 同义突变 πs πn/πs
Ty3-gypsy 99 360 ~ 480/460 0 ~ 0.58/0.38
Athila 60 375 ~ 480/467 0 ~ 0.32/0.19 0.07 0.62 0.11
Tat 22 369 ~ 477/448 0 ~ 0.47/0.26 0.19 0.50 0.38
CRM 7 447 ~ 480/475 0 ~ 0.03/0.02 0.01 0.06 0.13
Reina 2 480 /
Tekay 5 363 ~ 484/455 0.05 ~ 0.13/0.09 0.03 0.30 0.10
Unclassified 3 360 /
2.3 不同支系逆转录酶序列分析
根据图 1 和图 2 的分类结果，对不同类型的逆转录酶核酸序列特征进行分析（表 3、表 4），copia
类型逆转录酶核酸序列长度范围为 543 ~ 750 bp，而 gypsy 类型为 360 ~ 480 bp。两种类型均表现出
较高的异质性，其中 copia 类变异度（0.44）高于 gypsy 类型（0.38）。‘酥梨’中所有支系逆转录酶
核酸序列非同义突变与同义突变的比值均小于 0.4，说明这些支系逆转录酶经历了很强的负选择。
为了深入了解逆转录酶序列的特征，在每个不同支系的 copia 类逆转录酶氨基酸序列中选择一
条序列进行比对。比对结果（图 3）显示‘酥梨’copia 类型逆转录酶序列存在 3 个较为保守的区域，

图 3 梨的逆转录酶氨基酸序列比对
Fig. 3 Alignment of inferred RT amino acid sequences isolated from pear

2204 园 艺 学 报 41 卷
分别是前部的 KARLVA 区域、中部的 LYGLKQ 区域、后部的 YVDD 保守区域，与其它已报道的逆
转录酶序列相似；但序列其余部分的同源性低。‘酥梨’gypsy 类逆转录酶在序列上游含有相对保守
的 SGY*Q 以及中部保守的 MPFG 区域。从序列比对上可以看出‘酥梨’中 copia 类型逆转录酶比
gypsy 类型逆转录酶更为保守。
2.4 梨属植物中逆转录酶PCR扩增及半定量分析
与已报道的其他植物类似，‘酥梨’的逆转录酶也具有高度异质性，甚至同一支系内部不同逆
转录酶序列分歧度也较大（表 3、表 4），所以很难设计出一对通用引物可以扩增出全部类型的逆转
录酶序列。本研究中根据‘酥梨’逆转录酶聚类图，从中挑选出 8 个较保守的小分支进行转录活性
分析（图 1 和图 2 中分别标注了这些小分支位置），每个小分支要满足成员数大于 10 个且序列之间
同源性大于 95%。8 个小分支所属支系及其代表序列如表 5 所示。

表 5 PCR 扩增中使用的引物序列
Table 5 Primers used for PCR amplification
类型
Group
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence
来源
Origin
参考序列
Reference sequence
copia RT1 F：CAAGATAAAGCGTCGTCCAA；R：ATTTCTGCCTCATCATCACC Ivana I-1 Pbcrt20
RT2 F：GCAATCTGGACGAATGTGGT；R：AAGCCTTGTCCATACCAAATCG Binaca Pbcrt330
RT3 F：CGCAAGATACAAAGCACGACT；R：CCACATTCGTCCAGATTGCT Ivana I-2 Pbcrt4
RT4 F：CTACATTCAGCAACCGTCAG；R：CTGCTTGACTTCAATGCCTA Ivana I-2 Pbcrt40
RT5 F：ACGGCTCTATTGACCGCTAC；R：GCACTAGCATCATTGCCTGTA Ale A-2 Pbcrt233
gypsy RT6 F：TAAATGCCATGACTAGGAAAGA；R：TTCCCAATTCAAGACAAGGTTA Athila Pbgrt60
RT7 F：GTGTTTGCACCGATTACAGG；R：ATATGCAAATGTGCCAAAGG Athila Pbgrt38
RT8 F：GAAGACGAGGAACTAACAGCC；R：TCCAGAGGTGACGCCAAACG Tat Pbgrt16

使用 RT1 ~ RT8 所对应的引物对分属于不同梨属种或品种（‘酥梨’、‘圆黄’、杜梨和‘考密斯’）
的 DNA 进行 PCR 扩增，结果表明这 8 类逆转录酶广泛存在于不同梨属种或品种中（图 4），不仅存
在于东方梨的较原始种杜梨中，同样也存在于西洋梨‘考密斯’中，说明在东西方梨分化之前逆转
录酶就已经存在于梨属植物中。使用这 8 种类型逆转录酶序列分别对苹果基因组（ACYM00000000）
和桃基因组（CM001826 ~ CM001833）进行 Blast 检索，苹果基因组中发现有匹配到上述 8 种类型
逆转录酶的序列，而在桃基因组中，RT1、RT3、RT6 和 RT8 未能找到与之匹配的序列，说明桃基因
组中不包含有这些类型的逆转录酶。


图 4 不同梨品种 DNA 的 RT1 ~ RT8 PCR 扩增情况
A：‘酥梨’；B：‘圆黄’；C：杜梨；D：‘考密斯’。
Fig. 4 Genomic-PCR of pear RT1–RT8 in four pear accessions
A：P. pyrifolia white pear group‘Suli’；B：P. pyrifolia‘Wonhwang’；
C：P. betulaefolia；D：P. communis‘Comice’.
11 期 蒋 爽等：梨反转录转座子逆转录酶序列预测及其进化和转录分析 2205
为了进一步阐明逆转录酶在梨属植物不同组织中的转录情况，分别提取‘圆黄’梨的叶片、种
子、果皮、果肉 RNA 进行半定量分析，结果显示 RT1 ~ RT8 在这些组织中均有转录（图 5），其中
RT5 在所有组织中表达丰度均较高，RT1 在果肉中表达丰度高，而 RT4 在叶片和果肉中的表达水平
显著高于种子和果皮，说明梨不同组织中，逆转录酶转录水平存在一定差异。由于选择的试材均为
正常生长状态下的梨组织，说明在梨属植物中，逆转录酶并非一定需要逆境条件下才能激活，在正
常生长的‘酥梨’组织中该酶基因就有一定的表达。


图 5 RT1 ~ RT8 在‘圆黄’梨不同组织中的表达情况
Fig. 5 RT-PCR of RT1–RT8 in different tissues of‘Wonhwang’pear
3 讨论
本研究中使用生物信息学方法对梨的 Ty1-copia 和 Ty3-gypsy 类型反转录转座子逆转录酶序列进
行了分离，共获得 345 条 copia 类型逆转录酶序列和 99 条 gypsy 类型逆转录酶序列，比以前报道的
通过 PCR 克隆方法获得的序列（江彪 等，2008；刁卫平 等，2012；范付华 等，2012）数量多，
类型丰富，片段长度更长。NJ 进化树分析得出，‘酥梨’中 copia 类型逆转录酶可以细分为 6 个支
系（图 1），这 6 个支系广泛存在于水稻，小麦和拟南芥中（Wicker & Keller，2007），说明梨属植物
在进化过程中保留了这些类型的逆转录酶。在这 6 个支系中，Ivana 和 Ale 在‘酥梨’中分布更为广
泛，藜麦基因组中 Ale 支系成员也比较丰富，但 Ivana 支系成员少，说明不同的植物的反转录转座
子的进化历程不同（Kolano et al.，2013）。‘酥梨’中 Maximus 支系仅预测到 3 条序列，说明在进化
过程中，梨属植物逐渐丢失了该支系。在‘酥梨’中预测得到的 gypsy 类型逆转录酶可以分为 5 个
支系（图 2），60%的序列来自于 Athila 支系，而藜麦中大部分逆转录酶来自 Tekay 支系（Kolano et al.，
2013），说明不同植物中逆转录酶类型存在较大差异。逆转录酶序列分类结果历来作为反转录转座子
分类中的一个重要参考（Park et al.，2007；Hribova et al.，2010），本试验结果可以为梨属植物反
转录转座子分类提供一定的依据，同时所得的逆转录酶序列可为基于反转录转座子标记开发提供素
材。
逆转录酶氨基酸序列在其它物种中均显示出高度异质性（Ma et al.，2008；Ramallo et al.，2008），
在梨中也存在类似现象。梨属植物在进化过程中逆转录酶有着丰富的变异来源，杜梨被认为是梨属
植物中较为古老的种（Zheng et al.，2011），在杜梨中发现了同类型逆转录酶的存在（图 4），表明
反转录转座子及逆转录酶在梨属植物中存在时间久远。在漫长的进化过程中逆转录酶序列会发生一
定的突变。反转录转座子广泛存在于梨基因组中，本研究中鉴别出 1 836 条反转录转座子，众多的
反转录转座子提供了更多的变异来源。从目前报道来看，除了极少的一些反转录转座子插入到功能
基因中引起植物的突变外（Kobayashi et al.，2004；Butelli et al.，2012），大部分反转录转座子在基
因组中不具有功能，其突变过程不受自然选择的压力，这使得众多逆转录酶突变体在后代中被保留

2206 园 艺 学 报 41 卷
下来，其中包括大量发生终止突变的逆转录酶。这可能是逆转录酶高度异质性最主要的原因。
本研究中成功分离了‘酥梨’中同源性高的一些逆转录酶序列（表 4），并设计引物检测了其在
‘圆黄’梨不同组织中的转录水平（图 5）。前人报道逆转录酶多在受到胁迫时发生转录（Tapia et al.，
2005；De Felice et al.，2009）。但是本试验在砂梨品种‘圆黄’中分别在正常生长的叶片、果实及
种子中检测到逆转录酶的转录，而且通过 Blast 检索‘酥梨’芽的转录组数据（SRX147917）（Liu et
al.，2012）发现有 RT6、RT7 和 RT8 等 3 种类型逆转录酶转录本的存在。这表明在梨属植物正常生
长的组织中逆转录酶是活跃的。而逆转录酶在反转录转座子的转座过程中发挥重要的作用，芽及种
子内发生的反转录转座子的突变能够造成芽变及后代变异并能稳定遗传给后代，所以推测梨属植物
中逆转录酶的活跃可能是造成在梨基因组中 42.4%反转录转座子的一个重要原因。RT1、RT3、RT6
和 RT8 存在于苹果和梨基因组中，而通过检索桃基因组并未发现这 4 种类型的逆转录酶。说明在蔷
薇科不同物种中逆转录酶进化方式也有所不同。RT2、RT4、RT5 和 RT7 广泛存在于梨、苹果和桃中，
而聚类结果（图 1，图 2）显示这 4 种类型的逆转录酶所在支系在‘酥梨’中分布广泛，推测这些类
型的反转录转座子在梨属进化乃至蔷薇科进化过程中发生了多次转座。其中 RT4 和 RT5 在‘酥梨’
中依然保持着较高的转录水平。

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