全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（10）：1967–1974 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–05–14；修回日期：2012–10–08
基金项目：国家自然科学基金项目（31070623）；湖北省自然科学基金项目（2007ABA005）；广东省产学研结合项目（2010B090400366）
* 并列第一作者
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wangcy@mail.hzau.edu.cn）
桂花开放与衰老过程中花瓣蛋白酶活性与种类
的变化
阳韶昆，蔡 璇*，邹晶晶，王彩云**
（华中农业大学园艺林学学院，园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉 430070）
摘 要：以自然栽培条件下的桂花（Osmanthus fragrans）品种‘柳叶金桂’花瓣为试材，对其铃梗
期、初花期、盛花期、盛花末期和萎蔫期的可溶性蛋白质和游离氨基酸含量及蛋白酶的活性和种类变化
进行了检测。结果表明，伴随开花进程，花瓣可溶性蛋白质含量先增后减，游离氨基酸含量则持续上升；
花瓣蛋白酶检测的最适温度为 37 ℃，最适 pH 为 8.0；分光光度计法及底物胶电泳法检测时均发现，桂花
开花与衰老过程中，花瓣总蛋白酶活性持续上升，在盛花末期达到峰值，至萎蔫期迅速下降；利用专一
性酶抑制剂检测到花瓣衰老过程中的丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶 3 种蛋白酶，其中丝
氨酸蛋白酶活性最强，约占总活性的 65% ~ 75%，是影响桂花花瓣衰老最主要的蛋白酶。
关键词：桂花；花朵；开放；衰老；蛋白酶；底物胶电泳
中图分类号：S 685.13 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2012）10-1967-08

The Proteinase Activity and Types of Osmanthus fragrans Petals During
Flower Opening and Senescence
YANG Shao-kun，CAI Xuan*，ZOU Jing-jing，and WANG Cai-yun**
（Key Laboratory of Horticultural Plant Biology，Ministry of Education，College of Horticulture and Forestry，Huazhong
Agricultural University，Wuhan 430070，China）
Abstract：The contents of soluble protein and free amino acid，the changes of proteinase activity and
types of Osmanthus fragrans‘Liuye Jingui’were determined during flower opening and development
stages from linggeng stage，initial flowering stage，full flowering stage，late full flowering stage to wilting
stage. The results showed that variation patterns between soluble protein and free amino acid were
different. The optimum temperature and pH for protease measure were 37 ℃ and pH 8.0 respectively. The
petal proteinase activity which was detected by spectrophotometry and gel-SDS-PAGE electrophoresis
increased continuously until late full flowering stage，and then sharply decreased at wilting stage. Three
kinds of proteinases，serine protease，cystein protease and metallo protease，were found by using proteinase
inhibitors. Serine protease，accounted for about 65%–75% in total，was the most active one among the
three proteases to influence petal senescence of sweet osmanthus.
Key words：Osmanthus fragrans；flower opening；senescence；proteinase；gel-SDS-PAGE

1968 园 艺 学 报 39 卷

前人研究认为，多种植物花瓣衰老过程与蛋白质的丧失紧密相关，且都有可溶性蛋白质含量锐
减和游离氨基酸含量上升的现象（Michael et al.，1992；Wagstaff et al.，2003；van Doorn & Woltering，
2008；Yamada et al.，2009）。蛋白酶在植物细胞程序性死亡（PCD）和衰老等系列生理活动中均起
重要作用（Distefano et al.，1999；Wagstaff et al.，2002；Xu et al.，2007）。桂花（Osmanthus fragrans）
作为中国传统名花，花香浓郁，但由于花期短，凋谢快，对其观赏及经济价值的利用有一定影响。
朱诚和曾广文（2000）曾以‘薄叶金桂’为材料，测定了花瓣中水解蛋白酶活性变化，发现盛花期
以后水解蛋白酶活性有一个迅速上升的过程，但并未具体指出花瓣衰老过程中起作用的蛋白酶的种
类。本研究中以华中、华东、西南等桂花适宜栽培区应用广泛、花期中等的‘柳叶金桂’为试材，
对其花瓣开放和衰老过程中的可溶性蛋白质、游离氨基酸以及蛋白酶种类和活性进行了测定和分析，
旨在从蛋白酶角度研究桂花花瓣衰老的机理，为进一步调控桂花花期提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于 2009 年 9 月—2011 年 10 月在华中农业大学进行。以 40 多年树龄的‘柳叶金桂’（O.
fragrans‘Liuye Jingui’）为供试材料，采样树四周光照均匀，无病虫害，生长势中等。参照 Zhou
等（2006）的方法，分别采取自然生长条件下铃梗期、初花期、盛花期、盛花末期及萎蔫期 5 个时
期的花瓣（图 1）进行相关指标检测。



图 1 桂花花瓣发育的时期划分
A. 铃梗期；B. 初花期；C. 盛花期；D. 盛花末期；E. 萎蔫期。
Fig. 1 The petal development stages of O. fragrans
A. Linggeng stage；B. Initial flowering stage；C. Full flowering stage；D. Late full flowering stage；E. Wilting stage.

1.2 方法
1.2.1 可溶性蛋白质含量和游离氨基酸含量测定
可溶性蛋白含量的测定参照李合生（2000）的考马斯亮蓝 G-250 法，以牛血清白蛋白（BSA）
为标准蛋白。游离氨基酸含量的测定参照李合生（2000）的茚三酮试剂显色法。
1.2.2 蛋白酶活性测定
参照 Wang 等（2004）的方法，略有改进。称取 0.4 g 桂花花瓣，用 2 mL 经 4 ℃预冷的 50 mmol · L-1
pH 7.5 Tris-HCl 缓冲液[1 mmol · L-1 乙二胺四乙酸（EDTA），1 mmol · L-1 二硫苏糖醇（DTT），0.04%
巯基乙醇（ME），5%聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）]在冰上研磨，在 4 ℃冰箱中浸提 30 min，然后 4 ℃，
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12 000 r · min-1 离心 40 min，上清液用于蛋白酶活性测定。酶反应体系由 100 μL 上述提取液，600 μL
50 mmol · L-1 pH 8.0 的 Na-Pi（测定酶活的 pH 效应时分别加入 50 mmol · L-1 pH 5 的柠檬酸—磷酸缓
冲液；pH 6 ~ 8 的 Na-Pi；pH 9 ~ 10 的 Tris-HCl 缓冲液；pH 11 的 NaOH-NaHCO3 缓冲液），100 μL
0.6%偶氮酪蛋白（azocasein）组成，37 ℃温育 3 h（测定酶活的温度效应时分别设定 22、27、32、
37、42 和 47 ℃），加入 400 μL 10%三氯乙酸（TCA）终止反应（对照管在温育前加 TCA），4 ℃
静置 30 min，在 4 ℃条件下 10 000 r · min-1 离心 10 min。取上清液于紫外—可见分光光度计下测定
388 nm 下的吸光度。蛋白酶活性以蛋白酶比活（ΔA388nm · h-1 · mg-1）表示。
1.2.3 蛋白酶种类确定
蛋白酶专一性抑制剂选用金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA，浓度为 10 mmol · L-1，
溶于 pH 8.0 Na-Pi）、丝氨酸蛋白酶抑制剂苯基磺酰氟化物（PMSF，浓度为 5 mmol · L-1，溶剂为甲
醇）、半胱氨酸蛋白酶抑制剂碘乙酸（IA，浓度为 1 mmol · L-1，溶于 pH 8.0 的 Na-Pi）、天冬氨酸
蛋白酶抑制剂抑胃酶肽（PEP，浓度 0.05 mmol · L-1）。按照测蛋白酶活性的方法，在酶反应体系中
再加入 0.1 mL 抑制剂溶液（对照和 100%酶活体系都分别加入 0.1 mL 抑制剂溶液的相应溶剂）。
反应完成后，上清液置于紫外－可见分光光度计测量 388 nm 下吸光值。抑制活性百分比（%）
以（1–Ai388 nm / Ao388 nm）× 100 表示，其中 Ao388 nm、Ai388 nm分别为 100%酶活体系在 388 nm 波长下
的吸光度。
1.2.4 蛋白酶活性与种类的底物胶电泳检测
参照赵喜亭（2005）的方法略有改变。将粗酶液用于蛋白酶底物胶电泳。将蛋白酶提取液（含
4 μg 蛋白）用非还原性样品缓冲液[100 mmol · L-1 Tris-HCl，pH 6.8，20%甘油，2%（质量体积比）
十二烷基硫酸钠（SDS），1%（质量体积比）溴酚蓝］按 1︰1（体积比）稀释后在 40 ℃处理 10 min，
上样，于 4 ℃恒压电泳，其中，浓缩胶浓度为 4%，电压为 100 V，分离胶浓度为 12%且含 0.1%明
胶，电压为 200 V。
电泳结束后将凝胶片置于复性缓冲液中复性 75 min[2.5%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），
50 mmol · L-1 Tris-HCl，pH 7.0]，中间换 3 次复性液。之后用去蒸馏水清洗，并于反应缓冲液（50
mmol · L-1 Na-Pi，pH 7.0）中于 37 ℃下温育 24 h。用考马斯亮蓝染色液（0.1% 考马斯亮蓝 G-250，
10%冰乙酸，45%甲醇）染色 2 h。然后用脱色液（5%异丙醇，7%冰乙酸）脱色直至酶解带显现。
选用不同的抑制剂检测蛋白酶的种类时，电泳前将不同的抑制剂分别加入盛花期花瓣的蛋白酶提取
样品中，灌胶、电泳、复性等步骤同前，温育反应时将凝胶条分别置于含有 20 mmol · L-1 EDTA；5
mmol · L-1 IA；5 mmol · L-1 PMSF 的 50 mmol · L-1 Na-Pi，pH 8.0 的反应缓冲液中，于 37 ℃下温育反
应 24 h，以底物胶蛋白条带的变化来检验蛋白酶抑制剂对蛋白酶活性的抑制效应。
1.2.5 数据分析
所有试验均重复 3 次，取其平均值用于分析。采用 Excel 软件进行数据整理和作图，用 SAS 8.0
软件进行统计分析，统计方法采用邓肯氏新复极差法（P < 0.05）和 One-Way ANOVA。
2 结果与分析
2.1 桂花花瓣可溶性蛋白质与游离氨基酸含量的变化
从图 2 中看出，随着花朵逐渐开放与花瓣发育，可溶性蛋白质含量呈上升趋势，至盛花期达到
高峰；盛花末期至萎蔫期较为平缓下降（图 2，A）。花瓣中游离氨基酸的含量变化呈上升趋势，在
盛花期和盛花期末期保持平稳，直至萎蔫期呈现迅速上升的趋势（图 2，B）。
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图 2 桂花花瓣可溶性蛋白质（A）及游离氨基酸（B）含量变化
不同字母表示任意两个数值之间在 0.05 水平上差异显著。下同。
Fig. 2 Changes of soluble protein（A）and free amino acid（B）contents in petals of O. fragrans
Values followed by the same letter are not significantly different at P < 0.05 based on Duncan’s new multiple range test. The same below.

2.2 桂花花瓣蛋白酶活性检测的最适温度和 pH 条件
以‘柳叶金桂’盛花期花瓣为材料，比较了不同温育温度对花瓣蛋白酶活性的影响。当温育温
度为 37 ℃时，蛋白酶活性达到最强（图 3，A）。当 pH 8.0 时，蛋白酶活性最高（图 3，B）。因此，
以优化的温育温度为 37 ℃以及 pH 8.0 的磷酸缓冲液作为该试验中桂花花瓣各时期蛋白酶活性检测
的基本条件。
图 3 温度（A）及 pH（B）对桂花花瓣蛋白酶活性的影响
Fig. 3 Effect of temperature（A）and pH（B）on the proteinase activity of O. fragrans petals

2.3 桂花花瓣蛋白酶活性及种类变化
用紫外分光光度法对‘柳叶金桂’花朵开放与衰老过程中花瓣蛋白酶的活性及种类进行了检测。
从图 4，A 中看出，随着花瓣发育从铃梗期至衰老，蛋白酶活性持续升高，至盛花末期达到最高值，
约为铃梗期的 3 倍左右；之后急剧下降。通过比较金属蛋白酶抑制剂 EDTA、丝氨酸蛋白酶抑制剂
PMSF、半胱氨酸蛋白酶抑制剂 IA 以及天冬氨酸蛋白酶抑制剂抑胃酶肽对蛋白酶活性的抑制效果发
现，PMSF 的抑制比最高，约在 65% ~ 75%之间（图 4，B），因此推测丝氨酸蛋白酶在桂花花瓣衰
老过程中是活性最强的蛋白酶；在桂花花瓣中也检测到少量的半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶活性，
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但几乎没有检测到天冬氨酸蛋白酶活性存在。
图 4 紫外分光光度计检测桂花花瓣蛋白酶活性（A）和种类（B）
PMSF 为丝氨酸蛋白酶抑制剂，EDTA 为金属蛋白酶抑制剂，IA 为巯基蛋白酶抑制剂，PEP 为天冬氨酸蛋白酶抑制剂。
Fig. 4 Determine the activity（A）and types（B）of proteinase by ultraviolet spectrophotometer
PMSF is Serine protease inhibitor，EDTA is metalloproteinase inhibitor，IA is Cysteine protease inhibitors，PEP is Aspartic protease inhibitor.


底物胶电泳检测花瓣蛋白酶活性结果见图 5，A。除萎蔫期外，在桂花开放至衰老的各个阶段都
可以检测到 3 条蛋白酶带，依其分子量大小命名为蛋白酶 P1（180 kD）、P2（94 kD）和 P3（63 kD）。
随着花瓣的衰老，蛋白酶活性逐渐增加，但至萎蔫期时，除蛋白酶 P3 仍保持较强的活性外，蛋白
酶 P1 和 P2 的活性接近消失。

图 5 底物胶电泳分析蛋白酶活性（A）和蛋白酶抑制剂对蛋白酶活性（B）的影响
PMSF 为丝氨酸蛋白酶抑制剂，EDTA 为金属蛋白酶抑制剂，IA 为巯基蛋白酶抑制剂，PEP 为天冬氨酸蛋白酶抑制剂。
Fig. 5 Determine the proteinase activity（A）and the effects of proteinase inhibitors on proteinase activities（B）in gel-SDS-PAGE
PMSF is serine protease inhibitor，EDTA is metalloproteinase inhibitor，IA is cysteine protease inhibitors，
PEP is Aspartic protease inhibitor. 2：10 mmol · L-1 EDTA；3：5 mmol · L-1 IA；4：5 mmol · L-1 PMSF；
5：10 mmol · L-1 EDTA + 5 mmol · L-1 PMSF；6：5 mmol · L-1 IA + 5 mmol · L-1 PMSF.
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利用底物胶电泳法分析蛋白酶抑制剂对蛋白酶活性的影响，结果见图 5，B。凝胶在加入金属蛋
白酶抑制剂 EDTA 和半胱氨酸蛋白酶抑制剂 IA 的缓冲液中温育后，与对照相比没有明显的差异；
而凝胶在含丝氨酸蛋白酶抑制剂 PMSF 的磷酸缓冲液中温育后，蛋白酶活性显著降低，蛋白酶 P2
和 P3 的活性完全被抑制，蛋白酶 P1 活性大部分被抑制。为进一步了解蛋白酶 P1 的性质，将凝胶
分别置于含专一性蛋白酶抑制剂 10 mmol · L-1 EDTA + 5 mmol · L-1 PMSF 以及 5 mmol · L-1 IA + 5
mmol · L-1 PMSF 的磷酸缓冲液中温育。结果表明，在 5 mmol · L-1 IA + 5 mmol · L-1 PMSF 的磷酸缓
冲液中温育后，P1 蛋白酶活性完全被抑制，由此可知，蛋白酶 P1 中不能被 PMSF 抑制的部分为半
胱氨酸蛋白酶。P1 蛋白酶同时具有丝氨酸蛋白酶活性和半胱氨酸蛋白酶活性。这可能是因为两者分
子量都较大，需要更为优化的条件才能在电泳过程有效分离。在桂花花瓣的底物胶电泳过程中，尚
未检测到金属蛋白酶活性。
3 讨论
3.1 桂花花朵开放与衰老过程中花瓣可溶性蛋白及游离氨基酸含量的变化
花瓣的衰老总是与蛋白质的丧失相关联（沈成国，2001）。本研究结果表明，桂花花朵自铃梗
期至盛花期，可溶性蛋白质含量呈上升趋势，至盛花末期下降，至萎蔫期较为平缓下降。这一结果
与前人从初花期开始的其他桂花品种瓶插试验结果（朱诚和曾文广，2000；程正渭，2003）较为相
似。同样，伴随着花瓣衰老进程，游离氨基酸含量呈上升趋势。这也与前人报道的其它切花衰老（高
勇，1991；丛日晨 等，2003）具有相似的规律。但本试验中从桂花花瓣发育的铃梗期就开始采样，
从更早的阶段分析蛋白质和氨基酸的变化规律。此外，本研究中是从树体上直接采集各个发育时期
的花瓣进行测试，比瓶插处理更直观地认识桂花自然开花进程和花瓣蛋白质代谢之间的关系。
3.2 桂花花朵开放与衰老过程中花瓣蛋白酶活性和种类的变化
不同植物组织蛋白酶活性的最适温度及最适 pH 的差异较大，其温度范围在 20 ~ 60 ℃之间，pH
范围在 3.5 ~ 10.0 之间。本研究中通过分光光度计法得到桂花花瓣蛋白酶活性的最适宜温度为 37 ℃，
最适 pH 为 8。在前人报道的其他物种中，荠菜叶片蛋白酶活性在 50 ~ 60 ℃时最强，pH 6 ~ 10 的条
件下蛋白酶均有很强的活性（徐杏连 等，2005）；月季花瓣蛋白酶的最适温度（朱旭辉，2003）虽
然与桂花相同都是 37 ℃，但不同月季切花品种中，耐失水胁迫品种最适 pH 为 10，而中度耐失水品
种最适 pH 为 6（丛日晨 等，2003）。因此，不同植物种类甚至同一品种不同状态下蛋白酶活性测定
的条件也不同。
关于花瓣衰老表观特征与蛋白酶活性的关系，前人认为，蛋白酶活性的峰值往往伴随着植物可
见的衰老症状的出现（Pak & van Doorn，2005）。本试验中发现桂花从铃梗期至盛花末期，花瓣蛋
白酶活性持续增强，盛花末期花瓣边缘开始出现褐化时蛋白酶活性达到顶峰，同时还发现，可溶性
蛋白含量在盛花末期显著降低，游离氨基酸含量持续上升，这些蛋白酶活性变化与蛋白质及游离氨
基酸含量的关系支持了蛋白酶涉及衰老组织中的蛋白质最终降解为氨基酸的理论（Friedrieh &
Huffaker，1980）。事实上，前人已发现很多植物花瓣均有类似的现象，如萱草（Guerrero et al.，1998）、
月季（丛日晨 等，2003）、唐菖蒲（Azeez et al.，2007）等。朱诚和曾广文（2000）也发现在桂花
花瓣盛花末期蛋白水解酶活性最强，至谢花期活性有所回落。
在植物器官生长发育的不同时期，起主要作用的蛋白酶种类往往会发生变化。Dominguez 和
Cejudo（1996）研究证明在麦粒发育早期丝氨酸蛋白酶大量存在，而在后期大量存在的则是天门冬
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氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。在采收后的花椰菜中，丝氨酸蛋白酶在衰老前期和衰老后期活性最强，
金属蛋白酶在衰老前期及中期起主要作用，而半胱氨酸蛋白酶和天门冬氨酸蛋白酶活性则在整个衰
老过程中持续上升（Wang et al.，2004）。本研究结果有所不同的是，桂花花瓣的衰老过程中活性最
强的始终是丝氨酸蛋白酶。丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶已被报道广泛参与了植物的衰老，除了
作用于蛋白质的降解，还常常作为一种信号转导涉及到细胞程序性死亡（PCD）或作为一种信号途
径调控细胞自噬的程度（Ueda et al.，2000；Mizushima et al.，2003；张鹏 等，2006；Azeez et al.，
2007；van Doorn & Woltering，2008）。在作者前期的研究中已经发现，桂花花瓣衰老的 PCD 过程启
动较早，可能在花朵开放至最大状态的盛花期前就已经启动（周媛，2008）。本研究中丝氨酸蛋白酶
的变化趋势表明，丝氨酸蛋白酶在初花期时就开始启动，可能是作用于桂花花瓣 PCD 的一个信号。
丝氨酸蛋白酶活性的持续上升，也导致可溶性蛋白含量降低及游离氨基酸含量增加。由此推测，丝
氨酸蛋白酶活性的上升与蛋白质降解和游离氨基酸的增加及花瓣衰老等现象紧密关联。金属蛋白酶
则是目前研究较少的一类，其参与植物衰老的功能和作用机理目前了解的并不多。
底物胶电泳分析法弥补了分光光度计比色法测定蛋白酶活性缺乏对专一蛋白酶特性了解的缺
陷。在检测到的 3 条蛋白酶带中，P2（94 kD）和 P3（63 kD）为丝氨酸蛋白酶，P1（180 kD）同时
具有丝氨酸蛋白酶活性和少量半胱氨酸蛋白酶活性，这可能是分子量较大的蛋白酶在电泳过程中移
动缓慢，导致分子量相近的蛋白酶无法有效分离的结果（薛秋华 等，2008）。在底物胶电泳过程中
未检测到金属蛋白酶活性，这可能是因为该蛋白酶活性较弱，或是电泳过程以及电泳前、后的处理
条件比较敏感而导致不可逆的变性（芮琪和徐朗莱，2002）。因此，本研究中虽然初步探索了桂花
花瓣蛋白酶活性检测的底物胶电泳法体系，但有关检测条件尚需优化与完善，为更多其它桂花品种
的研究提供参考与借鉴。

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