全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（11）：2142–2150 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–06–01；修回日期：2012–08–13
基金项目：国家自然科学基金项目（30860035）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：hejw4522@163.com）
三叶悬钩子自然居群遗传多样性的 ISSR 分析
和志娇 1,2，和加卫 1,*，程在全 2，杨正松 1，杨洪涛 1，和文佳 1
（1 云南省农业科学院高山经济植物研究所，云南丽江 674100；2 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，昆
明 650223）
摘 要：利用 ISSR 分子标记对云南特有植物三叶悬钩子（Rubus delavayi Fanch.）的 12 个居群共 248
个个体进行了遗传多样性分析。结果表明：16 个 ISSR 引物共扩增到 199 个位点，其中 185 个是多态性位
点，占 92.96%。三叶悬钩子居群具有很高的遗传多样性水平，在物种水平上平均每个位点的多态位点百
分率（PPB）为 97.99%，有效等位基因数（Ae）为 1.427，Nei’s 遗传多样性（H）为 0.267，Shannon’s 多
态信息指数（I）为 0.417；在居群水平上 PPB 为 62.10%，Ae为 1.289，H 为 0.177，I 为 0.275。居群间基
因分化系数 Gst = 0.3351，与 AMOVA 分析的居群间遗传变异量占总量的 33.03%相近，说明三叶悬钩子居
群间存在一定程度的遗传分化。居群间遗传分化占总遗传变异的 33.51%，居群内的遗传变异为 66.49%，
基因流（Nm）为 0.9923。通过 Mantel 检测，居群间的遗传距离与地理距离不存在相关性。UMPGA 聚类
分析和二维主成分分析（PCA）结果一致。导致居群内高遗传变异水平原因主要是有限的基因流，而居群
间较低的遗传多样性水平可能与生态破坏和生物入侵有关。
关键词：三叶悬钩子；ISSR；遗传多样性；遗传分化
中图分类号：S 663.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2012）11-2142-09

Genetic Diversity in the Natural Populations of Rubus delavayi
Demonstrated by Inter-simple Sequence Repeats
HE Zhi-jiao1,2，HE Jia-wei1,*，CHENG Zai-quan2，YANG Zheng-song1，YANG Hong-tao1，and
HE Wen-jia1
（1Institute of Alpine Economic Plant，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Lijiang，Yunnan 674100，China；
2Research Institute of Biotechnology & Genetic Germplasm，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650223，
China）
Abstract：Genetic diversity of 248 individuals from 12 natural populations of Rubus delavayi Fanch.，
which are specific but endangered species in Yunnan，was assessed using ISSR markers. The results
showed that 199 amplified bands were got in PCR when sixteen primers were used. Among those bands，
185（92.96% of the total bands）were polymorphic. A high level of genetic diversity was showed in these
populations. At species level，percentage of polymorphic loci（PPB）was 97.99%，effective number of
alleles（Ae）was 1.427，Nei’s gene diversity（H）was 0.267，and Shannon’s information index（I）was
0.417. At population level，PPB was 62.10%，Ae was 1.289，H was 0.177，I was 0.275. The level of genetic
differentiation between populations was lower than that within populations. The coefficient of gene

11 期 和志娇等：三叶悬钩子自然居群遗传多样性的 ISSR 分析 2143

differentiation（Gst）between the populations was 0.3351. And the gene differentiation contributed to
33.51% of the total genetic variations between the populations and to 66.49% within the populations. The
total gene flow（Nm）was 0.9923. There was no significant correlation between genetic and geographic
distances among population（r = 0.0286，P = 0.5240）in the Mantel test. The result of UPGMA clustering
analysis was basically similar to that of the principle coordinate analysis（PCA）. The high genetic variation
level within populations could be caused mainly by the significant genetic variation inside a population
together with the limited gene flow（Nm = 0.9923）between populations. While the lower genetic diversity
among the populations could be caused by severely destroyed and biological invasion of Eupatorium
adenophorum Spreng.
Key word：Rubus delavayi；ISSR；genetic diversity；genetic differentiation

三叶悬钩子（Rubus delavayi Fanch.）为蔷薇科（Rosaceae）悬钩子属（Rubus L.）空心莓组（Section
Idaeobatus Focke）直立矮小灌木，花白色，果橙红色，具有食用、药用和观赏价值（俞德浚 等，
1985）。三叶悬钩子为云南特有种，也是中国特有种，分布在云南丽江、大理、怒江、昆明、玉溪
等，生于海拔 1 600 ~ 3 000 m 常绿阔叶林或常绿落叶阔混交林下（和加卫 等，2008）。目前由于山
地开垦、环境破坏和外来植物入侵，三叶悬钩子的野生资源遭到不同程度的破坏，生境片段化较为
严重，加之三叶悬钩子是通过形成吸枝（吸芽）繁殖，发育比较缓慢，有些地区分布的三叶悬钩子
已经逐渐走向濒危和灭绝。
物种的遗传多样性既是维持其繁殖活力和适应环境变化的基础，也是其它一切多样性的基础和
最重要的部分，而居群的遗传多样性水平在相当程度上制约其对环境的适应能力，从而可预测这个
居群的发展趋势。同时遗传多样性的研究能为植物育种和遗传改良提供理论指导（Spiess，1989；
潘莹和赵桂仿，1998）。
ISSR（inter-simple sequence repeats）分子标记具有快捷、灵敏、稳定性好、多态性高等优点，
现已经被广泛应用于植物遗传多样性的研究（Jin et al.，2010；Patcharin et al.，2011；宋常美 等，
2011；宋杨 等，2011），也应用于悬钩子属植物的遗传多样性和遗传分化的研究（Hong et al.，2003；
Samir，2007；Anne et al.，2011）。
目前有关对三叶悬钩子的研究较少，仅见到繁殖生物学方面的报道（陈曦 等，2007），而有
关三叶悬钩子的遗传多样性研究尚未见报道。本研究中采用 ISSR 分子标记对三叶悬钩子的 12 个自
然居群的遗传多样性进行了分析，目的在于揭示其遗传多样性水平及遗传结构，为三叶悬钩子资源
的有效保护和合理利用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
于 2007 年 6 月对云南怒江、丽江、玉溪、昆明等地进行三叶悬钩子资源调查及样品采集（表 1）。
选取 12 个居群，每个居群选 3 ~ 5 个调查点，分别相距 30 km 以上。用全球定位系统（GPS）记录
各居群的经纬度信息。
每个调查点随机选取 3 ~ 5 个植株，每株分别采集树冠外围一年生健康幼嫩叶片。所采集样品
用硅胶干燥剂干燥，并及时提取 DNA，保存于–20 ℃备用。


2144 园 艺 学 报 39 卷
表 1 三叶悬钩子 12 个居群的采样情况
Table 1 The 12 populations of Rubus delavayi Fanch. sampled
居群
Population
经纬度
Locality
海拔/ m
Altitude
生境
Habitat
碧江 Bijiang 98°92E，26°55N 2 400 路边，包谷地边，云南松林下
Roadside，corn field boundry，under Pinus yunnanensis forest
贵峰 Guifeng 100°17E，26°46N 2 427 云南松林下
Under Pinus yunnanensis forest
金沙江河谷 Jinshajiang Hegu 99°58E，27°26N 1 980 云南松林下，黄背栎灌木丛中
Under Pinus yunnanensis forest and the Quercus pannosa and in
shrubs
白汉场 Baihanchang 100°22E，26°96N 1 990 云南松林下，灌木丛中
Under Pinus yunnanensis forest，in shrubs
新主植物园
Xinzhu Botanical Garden
99°98E，26°82N 2 256 云南松林下，灌木丛中
Under Pinus yunnanensis forest，in shrubs
美翕中山 Meixizhongshan 100°04E，25°71N 2 600 云南松林下，灌木丛中
Under Pinus yunnanensis forest，in shrubs
碧江知子罗 Bijiang Zhiziluo 98°93E，26°41N 2 400 云南松林下，灌木丛中
Under Pinus yunnanensis forest，in shrubs
福贡古泉 Fugong Guquan 98°84E，26°86N 1 700 云南松林下，灌木丛中
Under Pinus yunnanensis forest，in shrubs
昆明西山 Kunming Xishang 102°63E，24°96N 2 150 云南松林下，针叶林与阔叶林中
Under Pinus yunnanensis forest，coniferous and broad leaf forests
江川白石岩 Jiangchuan Baishiyan 102°71E，24°25N 2 050 云南松林下，灌木丛中
Under Pinus yunnanensis forest，in shrubs
昆明宜良 Kunming Yiliang 103°18E，24°87N 1 860 云南松林下，灌木丛中
Under Pinus yunnanensis forest，in shrubs
大理黄坪 Dali Huangping 100°45E，26°07N 2 500 云南松林下 Under Pinus yunnanensis forest
1.2 方法
1.2.1 总 DNA的提取
采用 CTAB 法（Doyle & Doyle，1990）提取总 DNA。用 SmartSpecTM3000 核酸蛋白仪测定 DNA
的浓度并稀释至 25 ng · μL-1 用于扩增反应。
1.2.2 ISSR引物的筛选和 PCR扩增
引物根据加拿大哥伦比亚大学（UBC）公布的第 9 套 ISSR 引物序列（http：//www. michaelsmith.
ubc. ca/services/NAPS/Primer-Sets/Primers. pdf），由上海生工生物公司合成。每个居群选取 2 个模板，
在 10 μL 反应体系中进行引物筛选及可重复性试验。经过比较和优化确定最适的 ISSR 反应条件为：
PCR 反应体积 10 μL，其中包括模板 DNA 溶液（25 ng · μL-1）6.95 μL，10 × Buffer（Mg+2）1.05 μL，
dNTP（2.5 μmol · L-1）0.8 μL，引物（12.5 μmol · L-1）0.1 μL，Taq 聚合酶（5 U · μL-1）0.1 μL，加
ddH2O，一滴石蜡油覆盖。反应热循环程序为：首先 94 ℃预变性 4 min，然后进入循环，每个循环
为 94 ℃变性 30 s，48 ~ 52 ℃退火 l min，72 ℃延伸 90 s，共 40 个循环，最后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃
冷却取出。扩增产物用 1.5%琼脂糖凝胶在 1 × TAE 缓冲液（pH 8.0）中电泳分离，以 Marker DL2000
为分子量标准，溴化乙锭（EB，0.5 µg · mL-1）染色后在凝胶成像系统 GDS-7501（UVP 公司）上扫
描与分析，所有的扩增反应重复 1 次。
1.2.3 数据统计与分析
在 ISSR-PCR 扩增结果电泳图谱中，扩增出的清晰稳定、重复性好的每条 DNA 带谱作为与引物
的一个结合位点，视为有效的分子标记（Clark，1998），根据电泳图谱中 DNA 条带的有无，将 ISSR
扩增结果转化为二元数据（有带的量化为 1，无带的量化为 0），构建二元数据矩阵。遗传多样性参
数：多态位点百分比（PPB），每个位点的观察等位基因数（Ao），有效等位基因数（Ae），Nei’s 的
遗传多样度（H），Shannon’s 多态信息指数（I），居群遗传分化系数（Gst）与基因流（Nm）。Nei’s
遗传距离用 POPGENE 1.31（Yeh et al.，1999）软件进行分析。用 NTSYSpc 2.1（Rohlf，2002）进
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行 UPGMA 聚类分析和主成分分析（principal coordinates analysis，PCA）。用 ARLEQUIN 2.000
（Schneider et al.，2000）进行居群遗传结构的分子方差 AMOVA（Excoffier et al.，1992）分析。应
用 TFPGA（Miller，1997）软件对自然居群间地理距离与遗传距离之间的相关性进行 Mantel 检验
（Mantel，1976）。
2 结果与分析
2.1 PCR 扩增结果
从 100 条 ISSR 引物中选出 16 个扩增条带清晰、反应稳定、重复性好的引物，对 12 个居群 248
个个体基因组进行了 PCR 扩增，共扩增到 199 个位点，平均每个引物 12.44 个条带，其中多态性位
点有 185 个，占 92.96%（表 2）。其中贵峰居群和大理黄坪居群用引物 846 的扩增图谱如图 1 所示。

表 2 各个引物序列、扩增位点数与多态位点数
Table 2 Primer sequences，number of loci and number of polymorphic loci
引物
Primer
序列（5′→3′）
Sequence（5′→3′）
退火温度/℃
Annealing temperature
统计位点数
Number of loci
多态位点数
Number of polymorphic loci
807 （AG）8T 52 14 14
811 （GA）8C 50 13 12
814 （CT）8A 52 13 13
825 （AC）8T 52 12 12
826 （AC）8C 52 13 12
827 （AC）8G 52 12 11
834 （AG）8 YT 52 12 12
835 （AG）8YC 52 15 14
844 （CT）8RC 52 9 8
846 （CA）8RT 52 15 14
848 （CA）8RG 52 13 12
856 （AC）8YA 52 9 6
864 （ATG）6 52 10 8
873 （GACA）4 48 14 14
880 （GGAGA）3 50 14 13
890 VHV（GT）7 52 11 10
R = A/G，Y = C/T，H = A/C/T，V = A/C/G.

图 1 引物 846 对贵峰居群（1 ~ 21）和大理黄坪（22 ~ 41）居群样本 PCR 扩增后电泳图谱
Fig. 1 ISSR amplification products generated by primer ISSR 846 from samples of
population Guifeng（1–21）and Dali Huangping（22–41）
2146 园 艺 学 报 39 卷
2.2 居群遗传多样性分析
12 个居群 248 个个体的遗传多样性分析（表 3）表明：物种水平的遗传多样性相对较高，多态
位点百分比（PPB）达 97.99%，Nei’s 遗传多样性（H）为 0.267，Shannon’s 多态信息指数（I）为
0.417；居群水平略低，居群平均多态位点百分比为 62.10%，平均有效等位基因数（Ae）为 1.289，
平均 Nei’s 遗传多样性（H）为 0.177，Shannon’s 多态信息指数（I）为 0.275。
从多态位点百分比（PPB）看，各自然居群间相差比较大，贵峰最高（PPB = 81.91%），碧江最
低（PPB = 34.17%）。从其他指数看，贵峰的遗传多样性相对最高，金沙江河谷次之，而昆明宜良
和大理黄坪相当，碧江最低。

表 3 ISSR 分析的三叶悬钩子的遗传多样性
Table 3 Genetic variability of Rubus delavayi Fanch. detected by ISSR
居群
Population
样本数
Number of
Individuals
（N）
有效等位基因数
Mean observed
number of alleles
（Ae）
Nei基因多样性
Nei’s genetic
diversity（H）
Shannon信息指数
Shannon’s Index of
diversity（I）
多态位点百分/%
率Percentage of
polymorphic loci
（PPB）
碧江 Bijiang 21 1.173 0.104 0.159 34.17
贵峰 Guifeng 21 1.383 0.231 0.359 81.91
金沙江河谷 Jinshajiang Hegu 23 1.377 0.224 0.339 70.35
白汉场 Baihanchang 20 1.324 0.196 0.301 65.33
新主植物园 Xinzhu Botanical Garden 25 1.242 0.146 0.226 51.76
美翕中山 Meixizhongshan 24 1.310 0.190 0.294 64.82
碧江知子罗 Bijiang Zhiziluo 23 1.319 0.197 0.307 70.85
福贡古泉 Fugong Guquan 21 1.294 0.186 0.295 69.85
昆明西山 Kunming Xishang 24 1.283 0.180 0.287 71.86
江川白石岩 Jiangchuan Baishiyan 13 1.323 0.200 0.307 65.33
昆明宜良 Kunming Yiliang 12 1.240 0.147 0.227 49.25
大理黄坪 Dali Huangping 21 1.204 0.126 0.198 49.75
居群水平平均 Mean at population level 21 1.289 0.177 0.275 62.10
物种水平 Total at species level 248 1.427 0.267 0.417 97.99

2.3 三叶悬钩子遗传分化与基因流
三叶悬钩子居群间存在一定程度的遗传分化。12 个自然居群的基因分化系数（Gst = 0.3351，表
4）与 AMOVA 分析的结果（Fst = 0.3303，表 5）基本一致，即居群间遗传变异量约占总遗传变异量
的 33.03%，而居群内遗传变异量占总变异量的 66.99%，说明三叶悬钩子的遗传多样性主要分布在
居群内，居群间的遗传分化也达到了显著性水平（P < 0.001）。
基于 T 值估算基因流公式，Nm = 0.5（1–GST）/GST（McDermott & McDonald，1993；Yeh et al.，
1999），所计算的居群间基因流 Nm为 0.9923（表 4），说明三叶悬钩子居群间存在着一定的基因流。

表 4 三叶悬钩子居群的基因多样性 Nei’s 分析
Table 4 Nei’s genetic diversity in populations of Rubus delavayi Fanch.
项目
Item
居群总基因多样度
Total gene diversity
（Ht）
居群内基因多样度
Gene diversity within
population（Hs）
居群间遗传分化指数
The coefficient if gene
differentiation（Gst）
居群每代迁移数
Estimate if gene flow
from Gs（Nm）
平均 Mean 0.2668 0.1774 0.3351 0.9923
标准差 Standard deviation 0.0230 0.0092

11 期 和志娇等：三叶悬钩子自然居群遗传多样性的 ISSR 分析 2147

表 5 三叶悬钩子居群间的 AMOVA 分析
Table 5 AMOVA analysis of twelve natural populations of Rubus delavayi Fanch.
变异来源
Source of variation
自由度
d.f.
离差平方和
Sum of squared
Deviations
（SSD）
方差分量
Variance
component
方差分量比率/%
Percentage of
variation
固定指数
Fixation index
（FST）
P
居群间 Mongpopulations 11 855.2126 10.469 33.03 0.3303 < 0.001
居群内 Within population 236 1 750.8084 21.250 66.99 – < 0.001
总和 Total 247 2 606.0210 31.710 100.00 – –

2.4 聚类分析
为了进一步揭示居群分化趋势和亲缘关系，依据Nei’s遗传距离的UPGMA聚类分析结果（图 2），
三叶悬钩子居群可以明显分为 5 个组：碧江居群、新主植物园居群、昆明宜良居群和大理黄坪居群
各成为一个组以外，其他居群都聚为一个组。
基于居群间的遗传距离和地理距离的 Mantel 检测表明，三叶悬钩子居群的遗传距离和地理距离
之间并不存在显著相关性（r = 0.0286，P = 0.5240），表明三叶悬钩子居群遗传分化不太符合 Wright
的地理距离分化模式（Wright，1943）。





















图 2 三叶悬钩子 12 个居群的 UPGMA 聚类图
Fig. 2 A dendrogram of 12 Rubus delavayi Fanch. populations based on Nei’s genetic distance
using UPGMA clustering analysis

2.5 三叶悬钩子居群的 PCA 分析
主成分分析结果与聚类分析结果（图 3）基本相似，贵峰居群的部分个体、昆明宜良居群的部
分个体、大理黄坪居群、碧江与其他居群在二维空间图中分布明显分离。说明它们之间的亲缘关系
较远；其余各居群亲缘关系较近，个体之间存在不同程度交叉聚集，特别是昆明西山居群和江川白
石岩居群、美翕中山居群和碧江知子罗居群、金沙江河谷居群和白汉场居群聚集程度更高，明显高
于其他居群。这说明，三叶悬钩子居群的遗传变异主要来自于居群内，居群的地理距离与遗传距离
不存在相关性。
2148 园 艺 学 报 39 卷
图 3 三叶悬钩子 ISSR-PCR 扩增产物的二维 PCA 分析图
Fig. 3 Two-dimension principle correspondence analysis of Rubus delavayi Fanch.
based on ISSR-PCR amplified products
3 讨论
3.1 三叶悬钩子居群的遗传多样性
用筛选到的 16 对 ISSR 引物对三叶悬钩子居群进行 PCR 扩增，所有样品均能扩增出清晰、重
复性好的有效片段，扩增出的位点数为 9 ~ 15 条不等，平均每个引物扩增出 12.44 条 DNA 片段。相
对于 RAPD 标记（Korpelainen，1999），使用共显性标记研究三叶悬钩子居群遗传多样性和遗传结
构方面具有大的优势（Jia，1996；Samir，2007）。
12 个三叶悬钩子居群间的遗传多样性水平存在较大的差异，以贵峰的遗传多样性相对最高
（PPB = 81.91%），碧江居群最低（34.17%）。ISSR 引物 Shanonn’s 多样性指数的变化范围为 0.159 ~
0.359，Shannon’s 信息指数平均为 0.275。综合分析比较各参数，平均有效等位基因数和 I 值的变化
趋于一致，平均有效等位基因变异数值大的 ISSR 位点其 I 值也大，能够真实反映群体遗传多样性。
三叶悬钩子居群水平的遗传多样性（H = 0.177）明显低于 Nybom（Nybom，2004）基于 RAPD、AFLP、
ISSR 等显性标记所统计的多种植物居群水平遗传多样性的平均值（H = 0.22 或 0.23），仅高于一年
生（H = 0.13）或自交物种（H = 0.12）RAPD 检测的居群遗传多样性的平均值（Nybom & Bartish，
11 期 和志娇等：三叶悬钩子自然居群遗传多样性的 ISSR 分析 2149

2000），揭示出三叶悬钩子居群内部遗传多样性的明显不足。相对而言，三叶悬钩子在物种水平上还
保持着较高的遗传多样性（PPB = 97.99%，H = 0.267）。这一研究结果将为育种工作者引种扩大三
叶悬钩子基因资源提供科学依据。
由于遭受森林资源的破坏、不合理的开垦和生物入侵，使三叶悬钩子原有的生境受到了严重破
坏，生存和繁衍受到很大威胁，导致其居群遗传多样性的迅速丧失。三叶悬钩子各居群的遗传多样
性水平存在很大的差异（H 值变化范围为 0.104 ~ 0.231）。贵峰居群的遗传多样性较高（H = 0.231），
而碧江、昆明宜良和大理黄坪居群的遗传多样性都相对比较低，原因是紫茎泽兰（Eupatorium
adenophorum Spreng.）入侵，尤其是昆明宜良和江川居群仅有有限的居群个体数量，加上人为的生
态破坏，已经接近濒危。除生物入侵和人为破坏使居群数量逐渐缩小外，其濒危机制有待进一步深
入研究。
3.2 三叶悬钩子居群间的遗传分化
三叶悬钩子居群的 GST 的值为 0.3351，表明 1/3 的遗传变异存在于居群之间，这一较高水平的
遗传分化与其居群间基因流过小有关。所得分析结果与 AMOVA 结论一致，AMOVA 分子变异分析
显示，三叶悬钩子居群的遗传分化系数 FST 分别为 0.3303，说明三叶悬钩子的遗传多样性或遗传变
异主要分布于物种内部。Wright（1965）提出可根据居群每代迁移数（Nm）的大小来判断居群间基
因流状况与分化程度：当 Nm < 1，则遗传漂变可能导致居群间的分化，表明基因流成为居群间遗传
分化的主要原因。低的基因流导致物种居群间的分化加大。三叶悬钩子居群的基因流为 0.9923，说
明在物种水平上基因流被限制，各个居群间的交流小，群体间虽存在一定程度的基因交流，但不足
以抵制居群内遗传漂变而引起的居群分化。
Cozzolino等（2003）研究表明，高山或河道的物理隔离对生物居群间的遗传分化有一定的影响。
然而，基于居群地理距离和遗传距离的Mantel检测表明，三叶悬钩子居群遗传分化不太符合Wright
（1943）的地理距离分化模式。说明除随机遗传漂变与地理隔离外，其遗传分化可能还与各地区的
人为破坏程度等因素有关。野外考察三叶悬钩子的生境，发现其直接暴露于高频繁的人为活动压力
下，并且有紫茎泽兰的生物入侵，使得有些地方的的居群数量逐渐缩小，甚至趋于濒临灭绝，如昆
明宜良、江川白石岩和碧江。另外，三叶悬钩子通过形成吸枝（吸芽）繁殖，发育缓慢，属开花与
果实发育同步类型（陈曦 等，2007），使得与其他自然居群基因交流比较少，这些是产生分化的直
接原因。从本研究的结果来看，贵峰居群的遗传多样性较高，是保护和利用的重点，但是三叶悬钩
子居群间有一定的遗传分化，基因流低，因此也要注意其它居群的保护和利用。建议加强就地或迁
地保护，尽快建立相应的保护区，保护生态环境，以促进居群的天然更新和繁衍。

References
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