全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（8）：1631–1641 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–12–10；修回日期：2014–07–18
基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金项目（DL10CA03）；国家自然科学基金项目（J1210053）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：lyhshen@126.com）
芜菁花青素合成关键酶 DFR 基因启动子的克隆
及功能分析
许志茹，马 静，崔国新，李玉花*
（东北林业大学生命科学学院，林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040）
摘 要：在已经克隆的‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁二氢黄酮醇 4–还原酶（DFR）基因的基础上，
通过染色体步移法从两种芜菁基因组中克隆了 BrDFR1 和 BrDFR2 基因上游 1 296 和 1 297 bp 的启动子序
列。生物信息学分析表明，启动子片段中包含 TATA box、CAAT box、光调控元件、ABA 应答元件、伤
害应答元件、低温应答元件、防御与胁迫应答元件、MeJA 应答元件等多个顺式作用元件。启动子 BrDFR1P
和 BrDFR2P 仅在 15 个核苷酸位点存在差异。将 BrDFR1P 和 BrDFR2P 分别连接到 pCAMBIA1301 植物
表达载体上，构建 Promoter::GUS 载体，通过农杆菌介导遗传转化烟草。GUS 组织化学染色检测表明，
BrDFR1P 和 BrDFR2P 均能驱动 GUS 基因表达。构建 BrDFR1P 和 BrDFR2P 的一系列缺失体，融合 GUS
基因后遗传转化烟草。染色结果表明，BrDFR1P 和 BrDFR2P 缺失片段均具有相应的起始下游基因转录的
活性特征。
关键词：芜菁；二氢黄酮醇 4–还原酶基因；启动子；功能鉴定
中图分类号：S 631.3 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）08-1631-11

Cloning and Functional Analysis of the Key Enzyme DFR Promoters in
Turnip Anthocyanin Biosynthesis
XU Zhi-ru，MA Jing，CUI Guo-xin，and LI Yu-hua*
（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，College of Life Sciences，Northeast Forestry University，Harbin
150040，China）
Abstract：Based on the gene sequences of dihydroflavonol 4-reductase（DFR）which were cloned
from‘Tsuda’and‘Yurugi Akamaru’turnip，the 1 296 and 1 297 bp promoter fragments of BrDFR1 and
BrDFR2 genes were obtained from these two turnips’ genome by genome walking method. More
cis-acting elements of BrDFR1 and BrDFR2 promoters，such as TATA box，CAAT box，light responsive
elements，ABRE，WUN-motif，LTR，TC-rich repeats and MeJA responsive motif，were identified using
bioinformatics method. The nucleotide sequences of BrDFR1P and BrDFR2P had 15 differences. The
pCAMBIA1301 plant expression vectors containing these two promoter sequence respectively were
constructed with the GUS reporter gene，which were called Promoter::GUS vectors，and then transformed
into tobacco through the mediation of Agrobacterium tumefaciens. Histochemical staining analysis showed


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that the expression of GUS reporter gene could be driven by BrDFR1P and BrDFR2P. A series of 5′-end
deleted fragments of these two promoters were constructed，which were fused with GUS gene and then
transformed into tobacco. The stain result indicated that the deleted fragments of BrDFR1P and BrDFR2P
had relatively active characteristic that could start the expression of GUS gene.
Key words：turnip；dihydroflavonol 4-reductase gene；promoter；functional identification

DFR（dihydroflavonol 4-reductase，二氢黄酮醇 4–还原酶）是花青素合成下游阶段的关键酶，
催化二氢黄酮醇转变成橙色到砖红色的天竺葵素糖苷、红色的矢车菊素糖苷，蓝色到紫色的飞燕草
素糖苷（张龙 等，2008）。多种植物的 DFR 基因已被克隆，对其功能也进行了相关研究（Xie et al.，
2004；Singh et al.，2009；Chen et al.，2012；Viljoen et al.，2013；Yildiz et al.，2013）。
光是影响花青素合成的主要环境因子（胡可 等，2010；Meir et al.，2010；Wang et al.，2012）；
紫外线也可以调节植物中花青素的生物合成（Solovchenko & Schmitz-Eiberger，2003；Xie et al.，
2011）。例如，短暂光照增加了非洲菊花序最外轮舌状花花瓣中的花色素苷含量，并诱导 CHS 和 DFR
基因表达，基因表达水平与光照时间正相关（孟祥春 等，2007）。Wang 等（2011）克隆了茶[Camellia
sinensis（L.）O. Kuntze]受光照激活表达的 CsDFR2，此基因在光下的表达量高于 CsDFR1。
植物生长发育相关基因表达的调控主要体现在转录水平上，是多种顺式作用元件和反式作用因
子相互作用的结果（张春晓 等，2004）。花青素合成过程中，各种因子与催化酶基因启动子的顺式
作用元件结合，激活或者抑制其表达（Ludwig & Wessler，1990；Palapol et al.，2009；Hichri et al.，
2010；段岩娇 等，2012）。
油桃转录因子 MYB10 正调控 DFR 启动子，而 MYBPA1 是 DFR 启动子的负调控因子，由此暗
示，油桃的 MYB10 调控花青素合成，而原花青素的合成由 MYBPA1 控制（Ravaglia et al.，2013）。
烟草花的 MYB 转录因子基因 NtAn2 在烟草和拟南芥中组成型表达后可诱导整株植株产生花青素，
同时 DFR 等基因的表达上调；抑制 NtAn2 表达可以获得白色烟草花。在烟草原生质体中瞬时共表达
NtAn2、Lc 及拟南芥 TT8 可以激活 CHS 和 DFR 启动子（Pattanaik et al.，2010）。
目前部分植物 DFR 基因的启动子元件已经确定（Huits et al.，1994）。Shimada 等（2007）发现
菠菜 SoDFR 只在种子中表达；其启动子中含有的 RY 基序（种子特异性启动子中存在）与此特性相
符。
百脉根 DFR 基因家族 5 个成员的胁迫应答和组织表达特异性均不同；5 个基因的启动子序列中
均含有 MYB 结合位点和 bHLH 结合位点；只有 DFR2 启动子可以被 MYB、bHLH 和 WDR 转录因
子复合物激活。由此表明 DFR 家族成员具有独立的调控方式（Yoshida et al.，2010）。
‘津田’芜菁（‘Tsuda’turnip）块根着色需要光，受光一侧合成矢车菊素糖苷呈紫红色，背阴
一侧不着色；‘赤丸’芜菁（‘Yurugi Akamaru’turnip）块根着色不依赖光，黑暗条件下即可合成花
葵素糖苷呈砖红色。
‘津田’芜菁 BrDFR1 和‘赤丸’芜菁 BrDFR2 基因均为单一拷贝；BrDFR1 在黑暗条件下不
表达，光照后其表达量增加；BrDFR2 基因在黑暗条件下即可表达。这两个基因的表达特性与‘津
田’芜菁和‘赤丸’芜菁花青素合成的依光性和非依光性相符。
本研究旨在克隆两种芜菁 DFR 基因的启动子序列，同时构建一系列调控元件缺失体，通过这些
片段驱动 GUS 基因在烟草中的表达，确定启动子序列及其缺失片段的生物学功能。这些工作将为阐
明‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁 DFR 基因的光诱导表达调控机制奠定研究基础。
8期 许志茹等：芜菁花青素合成关键酶DFR基因启动子的克隆及功能分析 1633

1 材料与方法
1.1 材料与引物
材料为‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁膨大 60 d 的块根，2010 年取自东北林业大学生命科学学
院花卉生物工程研究所苗圃。
根据已经克隆的‘津田’芜菁 BrDFR1（EU402418）和‘赤丸’芜菁 BrDFR2（EU402419）基
因序列和染色体步移试剂盒的相关要求，设计引物扩增两个基因的启动子序列。引物 pDFR-TSP-1：
5′-GTCTATCTCCTCACTCGCTTAC-3′ ； pDFR-TSP-2 ： 5′-GGTCGCTTCTTTGTTGGCCTTG-3′ ；
pDFR-TSP-3：5′-TGTCTGGGCGGTTGTTGAAGC-3′。
根据测定的 BrDFR1 和 BrDFR2 启动子序列设计引物进行载体构建；引物两端含有 BamHⅠ和
NcoⅠ酶切位点及保护碱基。引物 BrDFRP-F： 5′-CGCGGATCCCATGAACCGATGAATC-3′；
BrDFRP-R：5′-CATGCCATGGTTTTGTGTGTTAGAAAGATG-3′。构建启动子系列缺失体的引物序
列 BrDFRP1084-F：5′-CGCGGATCCAAGAAGAGGAGTAAGCGAGTGAG-3′；BrDFRP720-F：5′-CG
CGGATCCATTCTTCCACTCCATTAAGG-3′；BrDFRP630-F：5′-CGCGGATCCGAGGAAGATTTCAG
CTCCCG-3′；BrDFRP452-F：5′-CGCGGATCCACTAGTAATTATCTTGTTAGGCC-3′；BrDFRP291- F：
5′-CGCGGATCCCACATTTCATCCGCCGGTAC-3′；BrDFRP-R：5′-CATGCCATGGT GTGTGTTAGAA
AGATGGATTATGC-3′。转基因植株 PCR 检测引物 GUS-F：5′-ACGTTAGCCGGGCTGCACTC-3′；
GUS-R：5′-CCGCCAACGCGCAATATGCC-3′。
1.2 BrDFR1 和 BrDFR2 启动子的克隆及序列分析
根据试剂盒说明书，利用 pDFR-TSP-1、pDFR-TSP-2 和 pDFR-TSP-3 引物进行 3 次 PCR 反应。
回收纯化 PCR 产物，与 pGM-T 载体连接后转化，挑取转化平板上的白色菌斑培养后提取质粒并进
行 PCR 验证，测序。利用 PlantCARE 和 PLACE 生物信息学软件分析 BrDFR1 和 BrDFR2 启动子序
列，查找并预测顺式作用元件。
1.3 BrDFR1 和 BrDFR2 启动子及系列缺失体表达载体的构建
根据 BrDFR1 和 BrDFR2 启动子顺式作用元件的分布情况，通过 PCR 方法从 5′端对启动子序列
进行逐步删除。初步将 BrDFR1P 和 BrDFR2P 分别删除为 5 个不同的长度，即–1 084 ~–1、–720 ~
–1、–630 ~–1、–452 ~–1 和–291 ~–1。
利用设计的引物，通过 PCR 扩增在启动子和系列缺失体的两侧引入 BamHⅠ和 NcoⅠ酶切位点，
回收纯化 PCR 产物。利用 BamHⅠ和 NcoⅠ酶切 PCR 纯化产物和植物表达载体 pCAMBIA1301。回
收目的片段、连接并转化；利用卡那霉素筛选转化平板上的单菌落。挑取单菌落液体培养后提取质
粒。质粒进行 PCR 和酶切检测。
1.4 表达载体遗传转化烟草及转基因植株 GUS 活性检测
农杆菌介导法遗传转化烟草：通过电转法将构建的表达载体转入农杆菌 EHA105 中。挑取菌斑
培养后提取质粒并进行 PCR 检测，即可获得含有 BrDFR1 和 BrDFR2 启动子及系列缺失体表达载体
的农杆菌菌株。
烟草无菌苗叶片剪成小块后在 OD600 = 0.3 的农杆菌菌液中侵染 2 min，在无菌滤纸上吸干多余
菌液、接种于 MS 培养基上，28 ℃黑暗共培养 2 d。之后用含 400 mg · L-1 头孢霉素的无菌水冲洗 3 ~
5 次，吸干水分后转到脱菌培养基（MS + BA 2.0 mg · L-1 + NAA 0.2 mg · L-1 + Cef 400 mg · L-1）上培
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表 1 BrDFR1P 和 BrDFR2P 核苷酸序列差异
Table 1 Difference of BrDFR1P and
BrDFR2P nucleotide sequence
核苷酸位点 Nucleotide site BrDFR1P BrDFR2P
61 G A
107 G A
156 G T
224 A C
310 C T
349 A T
358 A G
533 G A
632 G A
807 T C
851 A T
886 – A
959 G A
982 C T
1 227 G A












图 1 BrDFR1 和 BrDFR2 启动子 PCR 产物
M：DL2000 marker；1：PCR 产物；2：纯化产物。
Fig. 1 PCR product of BrDFR1P and BrDFR2P
M：DL2000 marker；1：PCR product；
2：PCR purification product.
养 2 ~ 3 周。当外植体长出良好的愈伤组织后转入分化筛选培养基（MS + BA 2.0 mg · L-1 + NAA 0.2
mg · L-1 + Cef 400 mg · L-1 + hyg 20 mg · L-1）中。切割 1 cm 以上的不定芽接种到生根培养基（1/2MS +
IBA 0.5 mg · L-1 + Cef 400 mg · L-1 + hyg 20 mg · L-1）中诱导生根。
组织化学染色法检测转基因烟草 GUS 活性：对获得的转化植株进行 PCR 检测。取转基因烟草
株系的叶片浸泡在 GUS 染色液中（李琳玲 等，2010），真空抽气 5 ~ 10 min 后迅速放气，重复 3 次。
37 ℃染色过夜。将染色后的组织转入 70%乙醇中脱色，至阴性对照材料呈白色为止。脱色后的蓝色
部位为 GUS 表达位点。观察并拍照记录。
2 结果与分析
2.1 ‘津田’芜菁 BrDFR1 和‘赤丸’芜菁 BrDFR2 启动子的克隆
以‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁总 DNA 为模板克隆 BrDFR1 和 BrDFR2 启动子。PCR 产物及
纯化结果如图 1所示，BrDFR1P和BrDFR2P长度在1 200 ~ 1 300 bp。测序结果显示，获得的BrDFR1P
和 BrDFR2P 片段实际长度为 1 296 和 1 297 bp。
BioEdit 软件比对结果（表 1）显示，BrDFR1P 和 BrDFR2P 的同源性为 99%，核苷酸序列在 15
个位点存在差异；另外，BrDFR1P 在第 886 bp 处缺失了 1 个核苷酸，而 BrDFR2P 在此位点是 A，
由此导致两个启动子长度出现了 1 个核苷酸的差异。BrDFR1P 和 BrDFR2P 在 GenBank 中的登录号
分别为 KF926983 和 KF926984。

2.2 BrDFR1P 和 BrDFR2P 顺式作用元件预测
在 PlantCARE 和 PLACE 数据库中分析 BrDFR1P 和 BrDFR2P 序列，顺式作用元件预测结果如
图 2 和表 2 所示。BrDFR1P 和 BrDFR2P 序列中除了含有大多数高等植物启动子具有的保守元件
（TATA box 和 CAAT box）外，还包含大量的光调控元件，如 G-Box、4cl-CMA2b、ACE、BoxⅠ、
GA-motif、GT1-motif、L-box、Sp1、TCCC-motif 和 rbcS-CMA7a。另外，BrDFR1P 和 BrDFR2P 序
列中还存在脱落酸反应元件、茉莉酸甲酯应答元件、低温应答顺式调控元件、防御与胁迫响应元件、
水杨酸反应元件、机械伤害反应元件和昼夜节律控制元件等一些与抗逆密切相关的顺式作用元件。
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图 3 BrDFR1P 和 BrDFR2P 重组质粒酶切结果
Fig. 3 Digestion result of BrDFR1P and BrDFR2P
recombinant plasmids
与 BrDFR1P 相比，BrDFR2P 在 354 ~ 360 bp 处还具有生长素应答元件 AuxRR-core（ATGGACC）；
在 106 ~ 111 bp 处缺失了 BrDFR1P 具有的调控因子结合元件 A-box。

图 2 BrDFR1P 序列和预测的顺式作用元件
方框内序列为 CAAT box 或 TATA box，ATG 为起始密码子。
Fig. 2 Nucleotide sequence and predicted cis-acting elements of BrDFR1P
The sequence in box is CAAT box or TATA box，ATG is the initiation codon.
2.3 BrDFR1P 和 BrDFR2P 的功能验证
PCR 扩增后可以在 BrDFR1P 和 BrDFR2P
两侧引入 BamHⅠ和 NcoⅠ酶切位点。
BamHⅠ和 NcoⅠ双酶切验证结果（图 3）
显示，BrDFR1P 和 BrDFR2P 重组质粒均可获
得启动子目的条带和载体条带，由此表明重组
载体构建成功，BrDFR1P 和 BrDFR2P 已经替
换了 pCAMBIA1301 上的 35S 启动子并与 GUS
基因融合。
重组质粒被命名为 pCAM-BrDFR1P1296
和 pCAM-BrDFR2P1297。

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表 2 PlantCARE 和 PLACE 软件预测的 BrDFR1P 和 BrDFR2P 顺式作用元件
Table 2 Cis-acting elements of BrDFR1P and BrDFR2P predicted by PlantCARE and PLACE software
调控元件
Regulatory element
序列
Sequence
来源
Organism source
数量
Number
特性
Characteristic
TATA box TATA/TATAAA
TAATA
拟南芥 Arabidopsis thaliana
大豆 Glycine max
8/1
1
转录起始–30 核心启动子元件 Core promoter
element around -30 of transcription start
CAAT box CAAT
CAAAT
大麦 Hordeum vulgare
芜菁 Brassica rapa ssp.
rapifera
5
6
启动子和增强子区调控元件
Common cis-acting element in promoter and
enhancer regions
4cl-CMA2b TCTCACCAACC 欧芹 Petroselinum crispum 1 光调控元件
Light responsive element
ACE GCCACGTACC 欧芹 Petroselinum crispum 1 光调控元件
Light responsive element
BoxⅠ TTTGAAA 豌豆 Pisum sativum 1 光调控元件
Light responsive element
G-Box CACGTA（G） 欧洲油菜 Brassica napus 3 光调控元件
Light responsive element
Sp1 GGGCGG 水稻 Oryza sativa 1 光调控元件
Light responsive element
GT1-motif GGTTAA 拟南芥 Arabidopsis thaliana 1 光调控元件
Light responsive element
L-box TCTCACCAACC
CTCACCTACCAA
欧芹 Petroselinum crispum 1
1
光调控元件
Part of a light responsive element
TCCC-motif TCTCCCT 菠菜 Spinacia oleracea 1 光调控元件
Part of a light responsive element
GA-motif AAAGATGA 向日葵 Helianthus annuus 1 光调控元件
Part of a light responsive element
rbcS-CMA7a GGCGATAAGG 玉米 Zea mays 1 光调控元件
Part of a light responsive element
ABRE ACGTGGC
CACGTG
拟南芥 Arabidopsis thaliana 1
3
脱落酸反应元件 Cis-acting element involved
in the abscisic acid responsiveness
CGTCA-motif CGTCA 大麦 Hordeum vulgare 2 茉莉酸甲酯应答元件
MeJA responsive element
TGACG-motif TGACG 大麦 Hordeum vulgare 2 茉莉酸甲酯应答元件
MeJA responsive element
LTR CCGAAA 大麦 Hordeum vulgare 1 低温应答顺式调控元件
Involved in cold stress response
TC-rich repeats ATTTTCTTCA
GTTTTCTTAC
烟草 Nicotiana tabacum 1
1
防御与胁迫响应元件 Cis-acting element
involved in defense and stress responsiveness
TCA-element TCAGAAGAGG
CCATCTTTTT
甘蓝 Brassica oleracea
烟草 Nicotiana tabacum
1
1
水杨酸反应元件
Salicylic acid response element
WUN-motif TCATTACGAA 甘蓝 Brassica oleracea 1 机械伤害反应元件
Wound responsive element
circadian CAAAGATATC 番茄 Lycopersicon esculentum 1 昼夜节律控制元件 Cis-acting regulatory
element involved in circadian control
A-box CCGTCC 欧芹 Petroselinum crispum 1 顺式作用调控元件
Cis-acting regulatory element
AuxRR-core ATGGACC 烟草 Nicotiana tabacum 1 生长素响应元件 Cis-acting regulatory element
involved in auxin responsiveness

将 pCAM-BrDFR1P1296、pCAM-BrDFR2P1297、pCAM-UTR（阴性对照，本实验室保存；利
用津田芜菁 CHS 基因的 3′-UTR 替换载体 pCAMBIA1301 的 35S 启动子，GUS 不表达）和
pCAMBIA1301 质粒（阳性对照）电转化农杆菌 EHA105，PCR 鉴定后获得了含不同重组质粒的农
杆菌菌株。通过叶盘法遗传转化烟草。
选取 PCR 检测有阳性扩增条带的转基因植株进行 GUS 染色，以此鉴定 BrDFR1P 和 BrDFR2P
的启动活性。结果表明，并不是所有转基因植株的 GUS 基因都能表达，pCAM-BrDFR1P1296、
pCAM-BrDFR2P1297 和 pCAMBIA1301 转基因烟草各 10 株中分别有 3、4 和 5 株表现出 GUS 活性；
pCAM-UTR 转基因株系和野生型烟草的染色结果均为阴性。比较染色结果后发现，BrDFR1P 和
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BrDFR2P 诱导 GUS 基因表达无组织特异性，因此仅将叶片的染色结果列出（图 4）。染色结果证明
了克隆的 BrDFR1 和 BrDFR2 的上游序列具有启动子功能。

图 4 BrDFR1P 和 BrDFR2P 转基因烟草叶片的 GUS 染色结果
Fig. 4 GUS stain result of the transgenic tobacco leaves contained BrDFR1P and BrDFR2P

2.4 BrDFR1P 和 BrDFR2P 系列缺失体的功能验证
通过 PCR 反应从 5′端对启动子序列逐步删除，BrDFR1P 和 BrDFR2P 分别被删除为 5 个不同长
度的启动子片段（图 5）。
图 5 BrDFR1P 的系列缺失体
Fig. 5 Series deleted fragments of BrDFR1P

利用 BrDFR1P 和 BrDFR2P 的系列缺失体替换载体 pCAMBIA1301 中的 35S 启动子，其构建过
程同启动子表达载体的构建。
BrDFR1P 和 BrDFR2P 系列缺失重组质粒的 BamHⅠ和 NcoⅠ双酶切鉴定结果如图 6 所示，
均可获得相应的目的条带和载体条带，由此表明，BrDFR1P 和 BrDFR2P 系列缺失重组载体构建成
功。鉴定后的重组质粒分别命名为 pCAM-BrDFR(1/2)P1084，pCAM-BrDFR(1/2)P720，pCAM-
BrDFR(1/2)P630，pCAM-BrDFR(1/2)P452，pCAM-BrDFR(1/2)P291。

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图 6 BrDFR1P 系列缺失体重组质粒的酶切结果
Fig. 6 Digestion result of series deleted fragments recombinant plasmids of BrDFR1P


重组质粒转化农杆菌，遗传转化烟草后进行转基因植株的 GUS 染色分析。各种启动子缺失体转
基因株系分别取 10 株进行染色。结果表明，pCAM-BrDFR1P720、pCAM-BrDFR2P291 和 pCAM-
BrDFR1P452 转基因植株各有 4 株表现出 GUS 活性；pCAM-BrDFR2P452、pCAM-BrDFR2P1084、
pCAM-BrDFR2P630 和 pCAM-BrDFR1P1084 转基因植株各有 3 株表现出 GUS 活性；pCAM-
BrDFR1P630、pCAM-BrDFR1P291 和 pCAM-BrDFR2P720 转基因植株各有 2 株表现出 GUS 活性。
BrDFR1P 和 BrDFR2P 各个缺失体诱导 GUS 基因表达无组织特异性。根据叶片染色程度可以看出，
不同启动子缺失体的转基因烟草中 GUS 基因的表达水平具有明显差异（图 7）。

图 7 BrDFR1P 和 BrDFR2P 系列缺失体转基因烟草的 GUS 染色结果
Fig. 7 GUS stain result of transgenic tobacco leaves contained series
deleted fragments of BrDFR1P and BrDFR2P
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3 讨论
本试验中的材料津田芜菁和赤丸芜菁块根花青素合成对光的依赖性不同，花青素合成下游途径
的催化酶 DFR 基因的光诱导表达特性也存在差异。为深入分析 DFR 基因表达调控特性及转录调控
因子的异同，本研究中克隆了‘津田’芜菁 BrDFR1 和‘赤丸’芜菁 BrDFR2 基因的启动子序列，
同时分析了启动子顺式作用元件组成。光调控基因的启动子序列中常含有 GT1-motif、Box-Ⅰ和
G-Box 等顺式作用元件（崔国新 等，2010）。分析结果显示，BrDFR1P 和 BrDFR2P 中包含多个与
光诱导相关的保守元件；两类启动子中绝大多数顺式作用元件是相同的，包括光调控元件。但也存
在差异，如 BrDFR2P 比 BrDFR1P 多了生长素应答元件 AuxRR-core；而 BrDFR1P 具有的调控因子
结合元件 A-box 在 BrDFR2P 中不存在。目前还无法确定 BrDFR1 和 BrDFR2 基因表达特性的差异是
否与顺式作用元件差异（特别是 A-box 的差异）相关。另外，BrDFR1 和 BrDFR2 的光敏性表达差
异还可能源于不同的转录因子、光反应相关因子及光信号传导途径。由于本研究构建的大部分启动
子缺失体是多个顺式作用元件同时缺失，尚不能确定单一元件的相应功能，目前，正在通过点突变
和缺失等途径深入研究并验证单一调控元件的功能，以期更详细地阐明 BrDFR1P 和 BrDFR2P 光调
控元件及差异元件在‘津田’芜菁依光型和‘赤丸’芜菁非依光型花青素合成过程中发挥的作用。
另外，Zufall 和 Rausher（2004）的研究指出，茑萝松（Ipomoea quamoclit）红花的色泽是形成
花葵素同时矢车菊色素途径失活造成的。茑萝松中无矢车菊色素的主要原因有两个，一是几乎检测
不到 F3H 基因表达；二是 DFR 失去了代谢二氢栎皮黄酮（DHQ）的能力。本课题组以往的研究结
果也显示，在‘赤丸’芜菁中几乎检测不到 F3H 表达（许志茹 等，2008）；同时，均为单一拷贝
的‘津田’芜菁 BrDFR1 和‘赤丸’芜菁 BrDFR2 的核苷酸序列存在较大差异，BrDFR1 和 BrDFR2
分别由 385 和 332 个氨基酸组成；BrDFR2 是否具有代谢 DHQ 的能力尚需相关试验验证，在此基础
上结合 BrDFR1P 和 BrDFR2P 顺式作用元件的相关数据才能解析‘津田’芜菁含有矢车菊色素而‘赤
丸’芜菁形成花葵素的具体原因。
目前，用于分析启动子结构和功能的方法主要是启动子缺失分析（郑晓瑜 等，2011）。本研究
在验证启动子功能后，根据启动子光反应元件聚集区域，初步将 BrDFR1P 和 BrDFR2P 删除为 10
个缺失片段。将缺失片段与 GUS 基因融合后转化烟草，通过稳定表达研究了启动子片段的活性。染
色结果表明，启动子缺失体的转基因植株中 GUS 染色无组织特异性；这种特点与 BrDFR1 和 BrDFR2
基因的单拷贝特点相符。另外，缺失片段均具有起始 GUS 基因转录的活性特征；不同缺失体转基因
烟草株系的染色深浅程度不同，即 GUS 的表达量不同。目前还不能根据烟草叶片的染色程度确定启
动子缺失片段的活性强弱，染色深浅还取决于转基因烟草中 GUS 的拷贝数；因此，要准确地定性各
启动子片段的功能，鉴别删除的片段中是否存在增强或者削弱启动子表达的序列，必须确定转基因
烟草株系中 GUS 为单一拷贝。此鉴定可以通过实时荧光定量 PCR 技术进行。
本研究中也提取了启动子缺失片段转基因烟草株系的蛋白酶液，采用分光光度法（曾凡锁 等，
2009）测定了 GUS 酶活性（数据未显示）。后期工作可以综合 GUS 拷贝数、酶活力和染色结果，详
细分析启动子缺失体与启动子功能的相关关系；也可利用双荧光素酶技术结合已克隆的与花青素合
成相关的芜菁转录因子进一步确定启动子不同片段的生物学功能（Yoshida et al.，2010）；通过凝胶
阻滞法、染色质免疫共沉淀、酵母单杂交、Pull-down 等技术鉴定更详细的顺式作用元件及与其相互
作用的转录因子，这些工作将为确定‘津田’芜菁 BrDFR1 和‘赤丸’芜菁 BrDFR2 基因的光诱导
表达调控机制、阐明依光型和非依光型花青素合成机理奠定研究基础。

1640 园 艺 学 报 41 卷
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