全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（8）：1591–1599 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–01–28；修回日期：2013–06–17
基金项目：国家自然科学基金项目（30471223）；广东省自然科学基金项目（S2012040008037）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：liuwei@scau.edu.cn）
利用SSH分离TDZ诱导金钗石斛成花相关基因
闻真珍，张 娥，刘运权，刘 伟*
（华南农业大学生命科学学院，广州 510642）
摘 要：以金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl.）腋芽为材料，利用抑制消减杂交（SSH）技术构建
了 TDZ 处理后金钗石斛腋芽的正向和反向 SSH 文库。通过 PCR 和反向 Northern 杂交验证后，得到的正
向文库的 314 个阳性克隆和反向文库的 59 个克隆测序后经过聚类，最终得到 39 条受 TDZ 正向调控的 EST
序列，以及 21 条受其反向调控的 EST 序列。对其中某些差异基因进行半定量 RT-PCR，结果显示这些基
因的表达受 TDZ 的影响。利用 Blastn 和 Blastx 进行比对分析，其中 20 个没有同源序列，属于未知功能
基因。其余序列的同源基因编码的产物参与包括光合作用、合成代谢、转录调控等多种生物学过程。在
反向文库中分离到 1 个 MADS-box 基因的同源序列和 1 个 Sos 同源基因，而正向文库中存在多个反转录
转座子，这些结果表明 TDZ 可以影响开花过程中的某些转录因子和信号基因的表达，进而促进金钗石斛
开花。
关键词：金钗石斛；开花；细胞分裂素；抑制消减杂交（SSH）；反转录转座子
中图分类号：S 682.31 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）08-1591-09

Primary Screening of Differentially Expressed Genes During TDZ Induced
Floral Initiation with SSH in Dendrobium nobile
WEN Zhen-zhen，ZHANG E，LIU Yun-quan，and LIU Wei*
（College of Life Sciences，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）
Abstract：A forward and a reverse suppression subtractive cDNA library were constructed，using
cDNAs from the TDZ-treated and non-treated axillary buds of Dendrobium nobile Lindl. A total of 314
and 59 recombinant clones were identified from the forward and reverse SSH library respectively，by PCR
and reverse Northern blotting. All of these clones were sequenced and assembled，finally 39 ESTs from the
forward library and 21 ESTs from the reverse library were obtained. Effects of TDZ on the transcription of
some ESTs were confirmed by semi RT-PCR. Of these sequences，twenty genes were not homologious to
the reported genes in GenBank，the rest were classified into photosynthesis，biosynthesis，metabolism or
regulatory function. A sequence homologious to MADS-box genes and a homology of Sos were identified
from the reverse library，and several retrotransposons were characterized from the forward library，these
results indicated that TDZ could promote the flowering of D. nobile，by affecting the transcriptions of
some transcription factors and signal genes.


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Key words：Dendrobium nobile Lindl.；flowering；cytokinin；suppression subtractive hybridization
（SSH）；retrotransposon

金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl.）具有较高观赏价值，但目前催花技术不完善导致其质量低
下，改进现有催花技术是生产中亟待解决的关键问题。研究表明，细胞分裂素（cytokinin，CTK）
类物质如 6-BA（6–苄氨基腺嘌呤）、TDZ（N–苯基–N’–1,2,3–噻二唑–5–脲）等可以促进蝴
蝶兰（Blanchard & Runkle，2008）、建兰（Kostenyuk et al.，1999）等开花，对金钗石斛的研究也表
明 CTK 可以在常温下诱导其开花（Sakai & Ichihara，2010）。利用 CTK 诱导金钗石斛开花是经济可
行的催花手段，然而应用中存在处理效果不够稳定等一系列问题。该技术的改进有赖于对细胞分裂
素诱导金钗石斛成花的机理的了解。但目前对植物成花机理的研究主要限于拟南芥、水稻、小麦等
模式植物，对金钗石斛等单子叶植物的研究很少。而关于植物激素在花发端过程中的作用机理，相
关研究大都集中在生长素和 GA（赤霉素，Gibberellin）上，对 CTK 的报道较少（Davis，2009）。
本研究中利用抑制消减杂交（SSH）技术构建 TDZ 处理后的金钗石斛正向和反向消减文库，分
离 TDZ 处理前后金钗石斛腋芽中差异表达的基因，为揭示 TDZ 诱导金钗石斛成花的分子机制奠定
基础，以期为改进金钗石斛催花技术提供更进一步的理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料与处理
金钗石斛成株为华南农业大学植物种质繁育中心温室栽培 3 年以上的苗。选取生长状态一致的
植株，在当年假鳞茎完全成熟后（2010 年 11 月 10 日）分两组，分别喷施清水（对照）及 20 mg · L-1
TDZ 处理，15 d 后处理组材料可明显见到花芽突起（图 1，A）；处理 90 d 后，TDZ 处理组全部开
花，相对低温处理材料，花期提前，而对照组未见花芽（图 1，B）。用刀片切取 15 d 的对照和处理组
腋芽，称重后用液氮迅速冷冻，–80 ℃保存备用；同时取处理 5、10、15、20 d 的腋芽，留作半定
量 RT-PCR 的材料。


图 1 不同处理对金钗石斛开花的影响
A. TDZ 处理 15 d 后腋芽发育情况；B. 不同处理的催花效果。
Fig. 1 Effects of different treatment on floral development of D. nobile
A. Development of axillary buds after 15 d；B. Effects of different treatment on flowering.
8 期 闻真珍等：利用 SSH 分离 TDZ 诱导金钗石斛成花相关基因 1593

1.2 总 RNA 的提取
总 RNA 的提取采用 TIANGEN 公司的 Trizol 试剂。提取的总 RNA 用 DEPC 水溶解之后用 0.8%
琼脂糖凝胶电泳，检测其完整性，并用紫外分光光度计定量。
1.3 cDNA 合成及消减杂交
采用 Clontech 公司 PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit 中的试剂及反转录酶，合成双链 cDNA。
以处理后腋芽 cDNA 样品为 Tester，对照为 Driver，构建正向 SSH 文库；以对照腋芽 cDNA 样品为
tester，处理后为 driver，构建反向 SSH 文库。按照试剂盒说明书将上述合成的双链 cDNA 进行酶切、
接头连接和消减杂交，稀释的杂交产物用 primer1 进行 32 个循环的第 1 轮 PCR，产物稀释后用巢氏
PCR 引物进行 32 个循环的第 2 轮扩增，使差异表达片段富集。为进一步验证消减效率，以甘油醛–
3–磷酸脱氢酶（G3PDH）基因为检测目标，通过 PCR 检测消减前后 cDNA 样品中该基因的表达量。
1.4 SSH 文库的构建与差异筛选
两轮扩增后得到的 PCR 产物经过切胶回收纯化后，连接到 pMD18-T 载体并转化大肠杆菌
DH5α，通过蓝白斑筛选阳性克隆。随机挑取阳性克隆，用 M13 通用测序引物进行 PCR，0.8%琼脂
糖凝胶电泳检测插入片段的大小，并计算阳性克隆率。为进一步验证阳性克隆的表达差异，挑选部
分阳性克隆的 PCR 产物进行点阵膜杂交，分别以正向消减杂交 cDNA 和反向消减杂交 cDNA 为探
针，差异筛选探针用 α-P32 标记，与高密度点阵膜杂交，BIORAD FX 自动成像系统扫描分析杂交结
果（Hybond-N+，美国 Osmonics 公司）。
1.5 测序及差异表达基因功能分析
挑取阳性克隆，用 M13 通用引物检测插入片段。将插入片段大小为 500 bp 以上的克隆送到上
海生工测序。得到的测序结果用 NCBI 的 vecscreen 去除载体序列后，用 DNAstar 进行聚类，得到的
序列用 BLASTx 进行比对分析，预测相应基因的功能及其与金钗石斛花发育的关系。
1.6 半定量 RT-PCR 分析
根据差异表达基因的序列设计引物，以 actin 基因为参照，在相同的扩增条件和相同的体系组
成的条件下，分别对目的产物和参照基因进行 PCR 扩增，用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，通过比
较产物的量初步研究目的基因的表达情况。
2 结果与分析
2.1 抑制差减文库的构建
利用金钗石斛花芽总 RNA（OD260/OD280 = 1.8 ~ 2.0）合成的双链 cDNA，经 RsaⅠ酶切后，得
到的酶切产物经平末端短片段加接头，进行两次消减杂交后，以消减杂交后的 cDNA 为模板，利用
巢式引物进行两轮 PCR 扩增，电泳结果表明未消减的 cDNA 扩增出的片段明显多于消减后扩增出
的片段，表明相应差异表达基因在 SSH 文库中得到有效地富集。这些基因的大小集中分布于 500 ~
1 500 bp 之间（图 2）。
为进一步验证消减效率，用 3–磷酸甘油醛脱氢酶（G3PDH）基因为检测指标，比较其在消
减杂交前后 cDNA 中的丰度。PCR 扩增后电泳结果（图 3）显示与未消减组 PCR 产物相比，消减
组 PCR 产物中 G3PDH 基因产物大大减少，说明杂交后消减效率较高。将两轮 PCR 后的产物经纯
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图 4 部分阳性克隆 PCR 鉴定结果
Fig. 4 PCR products of some randomly selected
subtracted-library clones
化后克隆到 pMD18-T 载体中转化大肠杆菌 DH5α，构建成 SSH 文库，通过蓝白斑筛选阳性克隆。
其中正向和反向文库中分别获得 846 和 221 个显示为白斑的阳性克隆。




2.2 转化子 PCR 鉴定
挑取正向和反向 SSH 文库中显示为白斑
的阳性重组子，进行菌液 PCR，琼脂糖电泳检
测结果显示 90.37%的克隆中插入的为单一片
段，大小多数分布于 250 ~ 1 500 bp（图 4）。
2.3 反向 Northern 杂交筛选
为进一步排除假阳性，将上述用 PCR 的方
法扩增出的插入片段点膜，制备 2 套重复的杂
交膜，采用随机引物法标记正向差减探针和反
向差减探针，再分别与 cDNA 拷贝膜杂交。对
比正向 SSH 文库中候选克隆与不同探针杂交
的两张重复拷贝膜的杂交信号，发现有些克隆与 Driver 探针杂交信号强但与 Tester 探针的杂交信号
弱（图 5，A，B，实线箭头所示），而另有部分克隆表现相反（图 5，A，B，虚线箭头所示），这些
克隆分别为 TDZ 处理后上调和下调表达的基因；还有一些克隆与正向、反向的差减探针杂交强度没


图 5 反向 Northern 杂交结果
Fig. 5 Reverse hybridization analysis
图 2 差减杂交后第 2 轮 PCR 电泳结果
Fig. 2 Analysis of the PCR products after subtraction
图 3 G3PDH 基因扩增结果
Fig. 3 Analysis of PCR products of G3PDH gene
8 期 闻真珍等：利用 SSH 分离 TDZ 诱导金钗石斛成花相关基因 1595

有明显区别，这些克隆是非差异表达的基因。同样的方法，得到反向 SSH 文库候选克隆中的差异表
达基因（图 5，C，D）。根据筛选结果，分别从正向和反向 SSH 文库候选克隆中，初步挑取了 314
和 59 个差异表达明显的克隆。
2.4 序列分析
挑取通过 PCR 和反向 Northern 杂交验证后的阳性克隆送上海生工测序，测序结果去除低质量
序列及载体序列后，用 DNASTAR 软件进行聚类后得到反向 SSH 文库中的 21 个差异表达序列，利
用 NCBI 的 Blastn 和 Blastx 进行同源比对后，得到的结果见表 1。
这些受 TDZ 反向调节的基因包括与植物细胞合成代谢、基因调控相关的基因，还包括
MADS-box 类转录因子和 MAPK 信号途径关键调节因子 Son of sevenless（Sos）。另外，有 7 个没有
同源序列，属于未知功能基因。
正向 SSH 文库经聚类后得到 39 个序列，与 GenBank 数据库进行 Blast 同源比对后，分析结果
见表 2，其中 13 个没有同源序列，为未知功能基因。其他 26 个分别与植物的光合作用、细胞合成
代谢、基因调控、呼吸作用、花色、植物死亡、抗病与防御相关。

表 1 反向 SSH 文库中的差异表达序列
Table 1 Differentially expressed sequences isolated from the reverse SSH library
编号
Code
片段长度/bp
Size
同源序列（括号中标示的为相应序列的登录号）
Homologous sequence（GenBank accession number）
E 值
E value
克隆数
ESTs
RC1 772 无同源序列 No hits 26
RC2 443 铁皮石斛（Dendrobium officinale）微卫星序列（FJ712298.1）
Dendrobium officinale microsatellite SSR T095 sequence（FJ712298.1）
2e-51 4
RC3 221 番茄（Lycopersicon esculentum）GDP–甘露糖焦磷酸化酶基因（DQ449030.2）
Lycopersicon esculentum GDP-mannose pyrophosphorylase mRNA，complete cds
（DQ449030.2）
0.001 8
RC4 210 甜椒（Capsicum annuum）MADS-box 基因（AF072534.1）
Capsicum annuum pepper MADS-box protein（PepMADS）mRNA，complete Cds
（AF072534.1）
7e-12 3
RC5 702 牛 VI 型胶原蛋白 α-3 链（XP_003582086）
Collagen，type VI，alpha 3（Bos taurus）（XP_003582086）
0.002 1
RC6 198 硫化物：醌氧化还原酶，线粒体前体（ACO13065.1）
Sulfide：Quinone oxidoreductase，mitochondrial precursor（Lepeophtheirus salmonis）
（ACO13065.1）
8.6 1
RC7 736 抗菌肽前体（ABG76513.1）
Odorranain-E1 antimicrobial peptide precursor（Rana grahami）（ABG76513.1）
0.14 1
RC8 693 安乐蜥（Anolis carolinensis）胶原蛋白 α-1 链（XM_003226261.1）
Collagen alpha-1(I) chain-like（Anolis carolinensis）（XM_003226261.1）
0.002 1
RC9 703 II 型胶原蛋白 α-1 链（NM_203889.1）
Collagen，type II，alpha 1（NM_203889.1）
0.005 1
RC10 704 富含胶原蛋白（XM_001913134）
Collagen repeat-containing protein（XM_001913134）
0.026 1
RC11 107 无同源序列 No hits 1
RC12 651 无同源序列 No hits 1
RC13 685 胶原蛋白 α-1 链（XM_003260009.1）
PREDICTED：Collagen alpha-1(XXIV) chain（Danio rerio）（XM_003260009.1）
0.094 1
RC14 700 无同源序列 No hits 2
RC15 392 大鼠（Rattus norvegicus）son of sevenless 同源基因（NP_001129033.1）
Son of sevenless homolog 2（Rattus norvegicus）（NP_001129033.1）
1.3 1
RC16 732 无同源序列 No hits 1
RC17 607 无同源序列 No hits 2
RC18 264 无同源序列 No hits 1
RC19 271 小鼠（Mus musculus）液泡分选蛋白异构体 CRA_b（EDL41377.1）
Vacuolar protein sorting 37C (yeast)，isoform CRA_b（Mus musculus）（EDL41377.1）
0.15 1
RC20 140 无同源序列 No hits 1
RC21 651 磷酸组氨醇氨基转移酶（AEF96969.1）
Histidinol-phosphate aminotransferase（Methanotorris igneus Kol 5）（AEF96969.1）
0.72 1
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表 2 正向 SSH 文库中的差异表达序列
Table 2 Differentially expressed sequences isolated from the forward SSH library
编号
Code
片段长度/bp
Size
同源序列（括号中标示的为相应序列的登录号）
Homologous sequence（Genbank accession number）
E 值
E value
克隆数
ESTs
FC1 786 甾醇 O–酰基转移酶（EGI59883.1）
Sterol O-acyltransferase 1（Acromyrmex echinatior）（EGI59883.1）
3.1 87
FC2 528 Girdin 蛋白（XP_001370455.1）
PREDICTED：Girdin-like（Monodelphis domestica）（XP_001370455.1）
2e-06 31
FC3 782 腺苷酸环化酶（XM_002381965.1）
Adenylate cyclase AcyA（Aspergillus flavus NRRL3357）（XM_002381965.1）
0.47 18
FC4 1190 假定蛋白 PC302034.00.0（XM_731436.1）
Hypothetical protein PC302034.00.0（Plasmodium chabaudi chaba udi）（XM_731436.1）
0.55 12
FC5 479 百草枯诱导蛋白 B（YP_856787.1）
Paraquat-inducible protein B（Aeromonas hydrophila subsp. hydrophila ATCC 7966）
（YP_856787.1）
3.4 17
FC6 791 成熟酶编码基因 matK（AB233803.1）
Maturase K（Gomphia serrata）（AB233803.1）
6.5 2
FC7 1051 麝香百合（Lilium longiflorum）苯乙醇腈裂解酶（DQ907931.1）
Lilium longiflorum putative mandelonitrile lyase，partial cds（DQ907931.1）
5e-06 21
FC8 1016 甜菜（Beta vulgaris）整合酶（FN357199.1）
Integrase（Beta vulgaris）（FN357199.1）
0.002 8
FC9 370 无同源序列 No hits 15
FC10 628 无同源序列 No hits 10
FC11 914 PsaB 基因（AY381048.1）PsaB（Orchis quadripunctata）（AY381048.1） 3e-42 2
FC12 301 核糖核酸酶 H（ABD28291.1）
Ribonuclease H（Medicago truncatula）（ABD28291.1）
2e-07 8
FC13 896 无同源序列 No hits 3
FC14 326 假定蛋白 DAPPUDRAFT_346811（EFX87867.1）
Hypothetical protein DAPPUDRAFT_346811（Daphnia pulex）（EFX87867.1）
8.6 17
FC15 928 无同源序列 No hits 2
FC16 833 Na+/H+逆向转运子 Nha1（XM_001822291.2）
Na+/H+ antiporter Nha1（Aspergillus oryzae RIB40）（XM_001822291.2）
1.2 5
FC17 328 无同源序列 No hits 2
FC18 369 Ty1-copia 类反转录转座子蛋白（ABF98209.1） Retrotransposon protein，putative，
Ty1-copia subclass（Oryza sativa Japonica Group）（ABF98209.1）
0.004 7
FC19 957 拟南芥（Arabidopsis thaliana）二磷酸核酮糖羧化酶激活酶（BAF01986.1）
Rubisco activase（Arabidopsis thaliana）（BAF01986.1）
6e-05 2
FC20 448 无同源序列 No hits 4
FC21 464 甘氨酰–tRNA 合成酶 β 亚基（ADH99854.1）
Glycyl-tRNA synthetase subunit beta（Bacillus selenitireducens MLS10）（ADH99854.1）
1.7 3
FC22 278 无同源序列 No hits 6
FC23 1271 马铃薯（Solanum demissum）gag-pol 多聚蛋白（AAT38744.1）
Putative gag-pol polyprotein，identical（Solanum demissum）（AAT38744.1）
3.7 2
FC24 394 重组酶（EEA94519.1）
Site-specific recombinase，phage integrase family（Pseudovibrio sp. JE062）（EEA94519.1）
0.21 4
FC25 419 玉米（Zea mays）Opie-2 类反转录转座子（AAP94592.1）
Retrotransposon Opie-2（Zea mays）（AAP94592.1）
9e-40 1
FC26 583 大鼠（Rattus norvegicus）腺苷酸环化酶 2（EDL87605.1）
Adenylate cyclase 2（Rattus norvegicus）（EDL87605.1）
0.75 2
FC27 509 水稻（Oryza sativa Japonica Group）逆转录酶（AAP44701.1）
Putative reverse transcriptase（Oryza sativa Japonica Group）（AAP44701.1）
2e-08 6
FC28 255 拟南芥（Arabidopsis thaliana）非典型蛋白（AEE83300.1）
Uncharacterized protein（Arabidopsis thaliana）（AEE83300.1）
3e-04 2
FC29 586 无同源序列 No hits 1
FC30 833 无同源序列 No hits 2
FC31 343 L–肉毒碱脱水酶（ADL01726.1） L-carnitine dehydratase/bile acid-inducible protein F
（Brevundimonas subvibrioides ATCC 15264）（ADL01726.1）
2.3 2
FC32 611 无同源序列 No hits 1
FC33 443 Ty1-copia 类反转录转座子蛋白（ABF98209.1） Retrotransposon protein，putative，
Ty1-copia subclass（Oryza sativa Japonica Group）（ABF98209.1）
4e-15 2
FC34 1560 金钗石斛（Dendrobium nobile）CHS 基因（DQ462460.2）
Chalcone synthase（Dendrobium nobile）（DQ462460.2）
0 2
FC35 437 无同源序列 No hits 1
FC36 137 无同源序列 No hits 1
FC37 481 主要促进子超家族蛋白（ZP_05343524.1）
Major facilitator superfamily protein（Thalassiobium sp. R2A62）（ZP_05343524.1）
6.4 1
FC38 173 无同源序列 No hits 1
FC39 190 无同源序列 No hits 1
8 期 闻真珍等：利用 SSH 分离 TDZ 诱导金钗石斛成花相关基因 1597

2.5 部分基因的表达分析
为验证分离到的基因是否受 TDZ 诱导差异表达，利用半定量 RT-PCR 分析 SSH 文库中的部分
基因在对照和 TDZ 处理过程中的表达情况。结果（图 6）表明，反向文库中的 RC4、RC15 的表达
量在 TDZ 处理后逐渐降低，而对照中其表达量维持稳定；正向文库中的 FC2、FC7、FC11、FC18、
FC19、FC23、FC24、FC25 以及 FC33 的表达在不同程度上受到 TDZ 的促进。这些结果表明相应
的基因确实受 TDZ 诱导差异表达，进一步证实了 SSH 和反式 Northern 杂交的结果。




























图 6 部分差异基因半定量 RT-PCR 结果
Fig. 6 Semi-quantitative RT-PCR products of some differentially expressed genes
3 讨论
SSH 是一种以抑制 PCR 为基础的 cDNA 缩减杂交法（Diatchenko et al.，1996），1999 年 Birch
等第一次将此技术成功运用于对马铃薯晚疫病的研究中。随后，这一技术被广泛用于分离与植物生
长发育、组织特异性以及抗逆性相关的基因。在兰花特异基因的分离方面，研究者利用 SSH 技术成
功获得了与文心兰花序发育相关的基因（Wang et al.，2007）、与万代兰（Vanda Mimi Palmer）香气
相关的基因（Chan et al.，2011）以及蝴蝶兰唇瓣突变体中的差异表达基因（Chen et al.，2005）。在
石斛兰的研究方面，魏小勇（2005）分别以 4 年生和 1 年生铁皮石斛叶片 cDNA 为 tester 和 driver
构建了 SSH 文库，试图分离与石斛碱生物合成相关的功能基因。目前还未见任何利用 SSH 技术分
离金钗石斛开花相关基因的报道。本试验中以金钗石斛育种最常用的亲本——金钗石斛的腋芽为材
料，以 CTK 类物质 TDZ 处理前后腋芽的 cDNA 互为 tester 和 driver，成功构建了 TDZ 处理后金钗
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石斛腋芽的正向和反向 SSH 文库，并从中分离到与 TDZ 促进金钗石斛开花相关的基因，对其中部
分基因的半定量 RT-PCR 研究表明，这些基因的表达确实受 TDZ 的诱导。这是 SSH 技术在金钗石
斛花发育基因分离上的成功应用。
在分离到的受 TDZ 正向和反向调节的差异表达基因中，包括了与植物的光合作用、细胞合成代
谢、基因调控、呼吸作用、花色、植物死亡、抗病防御等各种功能相关的基因，其中 RC4 是一个 E
类 MADS-box 基因的同源基因，受 TDZ 反向调节。在花发育过程中，E 类 MADS-box 基因参与调
控胚珠的发育，而参与花转换调控过程的 MADS-box 基因分属于不同的类别。虽然目前还不清楚
CTK 调控植物开花的分子机理，但是研究证明参与花发育调控的 MADS-box 基因在这一过程中具有
重要作用。在 pAP1：：IPT4 转基因拟南芥植株中，花分生组织特征决定基因 LFY 以及花器官特征决
定基因 AP1、PI 和 AG 的表达量提高，最终产生排列密集的花（于明明 等，2009）。6-BA 可以抑制
MiR172 的作用，后者则阻止 AP2 类 MADS-box 基因的表达（Liu & Chen，2009）。在短日植物白芥
菜中，CTK 被证实可以促进开花转换调节基因 SOC1 同源基因 SaMADS A 的表达（Bonhomme et al.，
2000）。D’Aloia 等（2011）最近的研究也证明在短日条件下，CTK 通过调控 FT 同源基因 TSF 及其
下游基因 SOC1 的表达促进拟南芥开花。与上述 CTK 促进相应 MADS-box 基因表达的结果不同，
本研究中 RC4 受 TDZ 的反向调节，关于这一基因在金钗石斛花发育过程中的作用，需要进一步的
研究证实。
受 TDZ 反向调节还有一个 Sos（son of sevenless）的同源基因，在动物中 Sos 是 MAPK 信号通
路中的重要调节因子，通过与 Ras1 结合，启动 GTP 与 GDP 的交换，从而影响整个 MAPK 信号通
路（Bonfini et al.，1992）。在植物中，MAPK 信号通路同样在发育过程中起重要作用。研究证明，
在 ABA 和生长素信号途径中有 MAPK 的参与，而 CTK 信号途径中也可能有 MAPK 的参与（Morris，
2001），本研究的结果在一定程度上证明了这种可能性。
本研究中分离到的受 TDZ 正向调节的基因包括与光合作用相关的 Rubisco 活化酶基因（FC19）、
PSI 相关基因 PsaB 以及花色合成基因 CHS 等，值得注意的是，在这些基因中，包括多个反转录转
座子（FC18、FC23、FC25 和 FC33）。反转录转座子是植物基因组的重要组成部分，Hsu 等（2011）
利用细菌人工染色体技术（BAC）对蝴蝶兰的基因组序列进行分析表明，有 23%的 BESs（BAC end
sequences）包括重复 DNA 序列，其中 54.7%为反转录转座子。正常情况下，大部分反转录转座子
是没有活性的，少数在植物特定发育阶段和特定组织中转录（唐益苗和马有志，2005）。在胁迫环境
下，观察到有部分反转录转座子的激活（Grandbastien，1998）。Wang 等（2007）利用 SSH 技术分
离文心兰花序发育相关基因时，并没有检测到与本研究相似的反转录转座子的转录。但是 Chen 等
（2005）在组织培养导致的蝴蝶兰唇瓣突变体的花中分离到了大量转录的反转录转座子，并推测其
转录导致了花形态的突变。研究证实在小麦中，AtCopeg1 的转录活性受外施 ABA 以及 6-BA 的影
响（Duan et al.，2008），而且其中反转录转座子的转录会导致邻近基因表达方式的改变（Kashkush et
al.，2003）。本研究从金钗石斛 TDZ 处理后的腋芽正向 cDNA 文库中分离到了多个反转录转座子，
但是它们在 TDZ 诱导金钗石斛开花过程中的作用有待进一步的研究。
虽然 CTK 在植物开花过程中的作用已经有大量研究报道，但对其分子机理的研究尚处于起步阶
段，本研究分离到的与 TDZ 诱导金钗石斛开花相关的基因将为研究其分子机理提供基础，对相应基
因功能及其与 TDZ 之间的关系的深入研究将促进这一机理的进一步阐释，并最终促进现有金钗石斛
催花技术的进一步改善。

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