全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（8）：1535–1544 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–03–17；修回日期：2014–06–19
基金项目：国家自然科学基金项目（31070589）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：xingsy@sdau.edu.cn）
叶籽银杏 DNA 甲基化水平与模式变异的研究
李际红，邢世岩*，张 倩，姚培娟，王聪聪
（山东农业大学林学院，农业生态与环境重点实验室，山东泰安 271018）
摘 要：以萌动期与展叶期的叶籽银杏和银杏为试材，采用基于 DNA 甲基化敏感扩增多态性分析
（Methylation-sensitive amplification polymorphism，MSAP）方法，在全基因组水平上探究叶籽银杏、银杏
不同发育期 DNA 序列中 CCGG 位点的甲基化水平及模式变化特征。萌动期选用 22 对引物，在叶籽银杏
和银杏中检测到扩增位点为 498 和 384 个，甲基化位点为 237 和 165 个，其总甲基化率分别为 47.6%和
42.4%；展叶期选用 40 对引物，在叶籽银杏有叶生胚珠（YZ2）、无叶生胚珠（YC）及银杏（CK）叶片中
检测到扩增位点 767、600 及 367 个，甲基化位点分别为 370、244 及 152 个，其总甲基化率分别为 48.3%、
40.5%及 41.5%。进一步对不同发育期叶籽银杏、银杏 DNA 甲基化模式的变化特征进行分析，结果显示：
萌动期、展叶期叶籽银杏与银杏相比均有超过半数的位点（52.1%、54.6%及 64.2%）DNA 甲基化模式发
生多态性变化，萌动期叶籽银杏相对于银杏其变化趋势以超甲基化为主；展叶期叶籽银杏有叶生胚珠相对
于叶籽银杏无叶生胚珠及银杏甲基化的变化趋势以超甲基化为主，叶籽银杏有叶生胚珠相对于银杏 DNA
甲基化模式变异幅度更大，超甲基化水平更高，显示出叶籽银杏基因组独特的 DNA 甲基化特征。
关键词：叶籽银杏；DNA 甲基化；甲基化敏感扩增多态性分析；甲基化模式
中图分类号：S 664.3 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）08-1535-10

The Changes in DNA Methylation Levels and Patterns of Ginkgo biloba var.
epiphylla
LI Ji-hong，XING Shi-yan*，ZHANG Qian，YAO Pei-juan，and WANG Cong-cong
（Key Laboratory of Agricultural Ecology and Environment，College of Forestry，Shandong Agricultural University，Tai’an，
Shandong 271018，China）
Abstract：Methylation-sensitive amplification polymorphism（MSAP）analysis was performed in
Ginkgo biloba var. epiphylla Mak.（epiphylla ginkgo）and Ginkgo biloba（ginkgo），at both the bud-burst
stage and the leaf-expansion stage，to characterize the DNA methylation levels and patterns of CCGG sites.
The results showed that 22 selected primer sets totally amplified 498 and 384 loci，respectively in bursting
buds of epiphylla ginkgo and ginkgo. And among them，237（47.6%）and 165（42.4%）loci were found
methylated. While at the leaf-expansion stage，40 selected primer sets totally produced 767，600 and 367
loci，respectively in epiphyllous-ovule leaf of epiphylla ginkgo（YZ2），normal leaf of epiphylla ginkgo
（YC）and ginkgo（CK）. And among them，370（48.3%），244（40.5%）and 152（41.5%）loci were
methylated. Further analysis revealed that more than half of the loci（52.1%，54.6%，64.2%）displayed

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changes in DNA methylation patterns in epiphylla ginkgo compared with ginkgo both at budding stages
and leaf-expansion stages. Hypermethylation was found more frequent in both YZ1 and YZ2 than in CK，
YC or CK. The greater variation of DNA methylation and more frequent hypermethylation occurred in
epiphylla ginkgo suggested the unique DNA methylation profile of epiphylla ginkgo. These findings
undoubtedly laid foundation for further discussing the origin and phylogeny of epiphylla ginkgo from the
perspective of epigenetics.
Key words：Ginkgo biloba var. epiphylla；DNA methylation；methylation-sensitive amplification
polymorphism（MSAP）；methylation patterns

叶籽银杏（Ginkgo biloba var. epiphylla）最大特点在于叶生胚珠的发生，它们对研究银杏的系统
发育、起源、演化等具有重要意义（Douglas et al.，2007）。
李士美等（2007）通过对于叶籽银杏的形态发生和比较形态学研究认为，叶籽银杏的形态学特
征明显地再现了古银杏的特征，可能属返祖现象。造成这种返祖现象的原因可能是由于叶籽银杏对
胚珠器官发育的控制松弛或调节作用失效所致（周志炎，1994）。
“获得性”性状和“返祖”现象的发生可能是因为一组基因的活性被表观修饰所抑制，后来由
于一些因素的作用造成表观修饰的变化恢复了活性（董玉玮 等，2005）。表观遗传调控一旦出现差
错就必然会导致生物体生理生化过程的改变，最终出现形态解剖上的异常或抗性的改变（Reik，2007；
郭长花和康向阳，2008）。
董雷雷等（2008）在对叶籽银杏与银杏的 trnS-trnG 基因序列分析发现，两者的差异极小。王
京梅等（2009）研究发现，叶籽银杏 LEAFY 基因的两个同源异型基因没有发生突变。李保进（2008）
对叶籽银杏和银杏 cpDNA matK 全长基因序列（1 539 bp）的分析发现，仅有 96 bp（6.24%）发生
变异，在含有的 57 个变异位点中，仅有两个信息位点，这样少的信息位点致使它不能提供足够多
的信息进行系统发育树的构建。由此推测：叶籽银杏叶生胚珠的发生过程中可以产生许多不能用
经典遗传规律解释的可遗传变异，也许这种变异与表观遗传变异（epigenetic variation）有关（施
季森，2008）。
DNA 甲基化（DNA methylation）作为表观遗传的主要修饰形式，在植物基因表达、细胞分化以
及系统发育中起着重要的调节作用（Tariq & Paszkowski，2004）。近几年 DNA 甲基化及与之相关的
不同组织、不同发育时期、不同生理年龄甲基化的时空特异性已成为植物表观遗传学研究的热点（陆
光远 等，2005；Zhao et al.，2007；Monteuuis et al.，2008；Chen et al.，2009；潘雅姣 等，2009；
郭广平 等，2011；Yang et al.，2011）。韩晨静等（2011）认为叶籽银杏展叶期形成了能够观察到叶
籽银杏叶生胚珠的发端期，发端期是叶籽银杏叶生胚珠形成的关键时期。研究萌动期与展叶期叶籽
银杏甲基化水平、模式的变异，对进一步揭示叶籽银杏叶生胚珠发生的表观遗传修饰具有重要的意
义，对其表观遗传变异的深入研究，将有助于理解这类变异的进化意义及其在林木改良中的有效利
用。有关叶籽银杏不同发育时期甲基化的变异尚未见报道。
本研究中从表观遗传学的角度出发，以不同发育时期的叶籽银杏与银杏为试材，采用基于 DNA
甲基化敏感扩增多态性分析（Methylation-sensitive amplification polymorphism，MSAP）方法，探究
叶籽银杏叶生胚珠发育过程中的 DNA 甲基化水平与模式变化。通过阐释不同发育时期叶籽银杏与银
杏甲基化水平、模式的变异，为进一步从表观遗传学的角度探讨叶籽银杏起源及系统发育机制奠定
基础。
8 期 李际红等：叶籽银杏 DNA 甲基化水平与模式变异的研究 1537

1 材料与方法
1.1 材料及其 DNA 提取
叶籽银杏为山东省沂源县油坊的一株叶籽银杏雌株，树龄约 1 300 年。2009 年 4 月 6 日采集萌
动期叶籽银杏的芽，剥去鳞片取出还没有展开的幼嫩叶片（YZ1），立即置于放有硅胶的保鲜袋中，
带回实验室，放入 4 ℃冰箱保存备用。2009 年 4 月 18 日，采集展叶期是着生叶生胚珠的叶片（YZ2）
和是没有着生叶生胚珠的正常叶片（YC），迅速投入液氮中速冻，带回实验室，在–70 ℃冰箱中保
存备用。普通银杏（CK）雌株选自山东省泰安市老君堂，树龄约 1 300 年。2009 年 4 月 1 日采集新
鲜嫩叶放入保鲜袋中（内装硅胶）带回实验室，置于冰箱 4 ℃中保存备用。
采用改良的 CTAB 法提取银杏叶片基因组 DNA；叶籽银杏基因组 DNA 的提取按照天根试剂盒
上的说明书进行操作；所提 DNA 均经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并用分光光度法定量分析，–20 ℃
保存备用。
1.2 酶切、连接、PCR 扩增及电泳
按照 Xiong 等（1999）的方法进行酶切、连接及 PCR 扩增。
54 对选择扩增引物设计参照李际红等（2011）的文献，而 EA00 +（TC、GA、CG、TG）、E00 +
（TC、GA、CG、TG）、E00 +（GC、CC、CA、CT、GG、GA）为添加两个碱基及 EA00 +（A、T、
C、G）为添加 1 个碱基分别与 TAG、TCG、TTC 完成组合的选扩增引物序列（表 1）。
选择扩增后的混合液经变性后，取 10 μL 上样于 6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳，电泳
3.5 h 左右后银染观察。
所有接头与引物序列均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。


表 1 MSAP 分析的接头和引物序列
Table 1 Sequence of adapters and primers used for MSAP analysis
名称 Name EcoRⅠ 序列 Sequence HpaⅡ/MspⅠ 序列 Sequence
接头 1 Adaptors 1 5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′ 5′-GACGATGAGTCTAGAA-3′
接头 2 Adaptors 2 5′-AATTGGTACGCAGTCTAC-3′ 5′-CGTTCTAGACTCATC-3′
预扩增引物 Preselective primers 5′-GTAGACTGCGTACCAATTCA-3′（EA00） 5′-GATGAGTCTAGAACGGT-3′
5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′（E00）
选扩增引物 Selective primers combinations EA00 +（TC、GA、CG、TG） TAG、TCG、TTC
E00 +（TC、GA、CG、TG） TAG、TCG、TTC
E00 +（GC、CC、CA、CT、GG、GA） TAG、TCG、TTC
EA00 +（A、T、C、G） TAG、TCG、TTC

1.3 甲基化变异类型的划分及数据统计
甲基化变异类型的划分参照 Chen 等（2009）的方法，MSAP 分析体系中 HpaⅡ与 MspⅠ同裂酶
的酶切位点相同，但 EcoRⅠ与二者酶切后两者对酶切位点甲基化修饰敏感性不同，将其甲基化模式
分为 3 种类型。Ⅰ型：HpaⅡ与 MspⅠ两者均有带，代表非甲基化位点；Ⅱ型：HpaⅡ有带、MspⅠ
无带，代表半甲基化位点；Ⅲ 型：HpaⅡ无带、MspⅠ有带，代表全甲基化位点。有带记为“1”，
无带记为“0”。

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将萌动期叶籽银杏（YZ1）与银杏（CK）之间，展叶期叶籽银杏叶生胚珠（YZ2）、叶籽银杏无
叶生胚珠（YC）和银杏（CK）之间的胞嘧啶甲基化变化模式分为两大类：Ⅰ类表示单态型条带，
表明在叶籽银杏与银杏中察觉到相同的 CCGG 位点；Ⅱ类表示多态型条带，依据胞嘧啶甲基化在叶
籽银杏与银杏之间的变化，又进一步分为Ⅱ-A、Ⅱ-B、Ⅱ-C、Ⅱ-D、Ⅱ-E 五亚类。Ⅱ-A 表示叶籽银
杏相对于银杏的甲基化减弱即发生去甲基化的位点；Ⅱ-B 类表示叶籽银杏相应银杏的甲基化增强即
发生超甲基化的位点；Ⅱ-C、Ⅱ-D、Ⅱ-E 表示叶籽银杏相应于银杏，部分表现为甲基化减弱、部分
表现为甲基化增强，但不易辨别，亦表现为多态性条带，而这种多态性条带可以用 Mendellan 遗传
进行位点解释（洪舟，2009）。
2 结果与分析
2.1 萌动期叶籽银杏 DNA 胞嘧啶甲基化水平及模式变异分析
2.1.1 萌动期叶籽银杏和银杏 DNA 胞嘧啶甲基化水平
从 54 对 MSAP 引物中选出 22 对引物组合，扩增产生叶籽银杏 498 条清晰可辨的 DNA 条带，
在全部扩增位点中检测到总甲基化位点 237 个，总甲基化率为 47.6%。其中，全甲基化位点为 139
个，全甲基化率为 27.9%；半甲基化位点为 98 个，半甲基化率为 19.7%（表 2）。
22 对引物组合，扩增产生银杏 384 条清晰可辨的 DNA 条带，在全部扩增位点中，检测到总甲
基化位点 163 个，总甲基化率为 42.4%。其中，全甲基化位点为 98 个，全甲基化率为 25.5%；半甲
基化位点为 65 个，半甲基化率为 16.9%（表 2）。
萌动期叶籽银杏和银杏均表现为全甲基化的水平高于半甲基化水平。

表 2 叶籽银杏和银杏萌动期的全基因组的甲基化水平
Table 2 Methylation levels of budding stage in Ginkgo biloba var. epiphylla Mak. and G. biloba L.
MSAP 扩增带谱类型 MSAP band type
Ⅰ
非甲基化 Non-methylated
Ⅱ
半甲基化 Hemi-methylated
Ⅲ
全甲基化 Full methylated
材料
Material
扩增条带总数
Total amplified
bands
条带数 Bands % 条带数 Bands % 条带数 Bands %
叶籽银杏 YZ1 498 261 52.4 98 19.7 139 27.9
银杏 CK 384 221 57.6 65 16.9 98 25.5


2.1.2 萌动期叶籽银杏和银杏 DNA 胞嘧啶甲基化模式的变异
由图 1 和表 3 可知，叶籽银杏相对于银杏甲基化的变异类型表现为单态型位点有 414 个，占总
扩增位点的 47.9%，多态型位点有 450 个，占总扩增位点的 52.1%；在多态性变异类型中，叶籽银杏
相对于银杏发生去甲基化（表 3，Ⅱ-A1、Ⅱ-A2、Ⅱ-A3）的位点为 114 个，占总扩增位点的 13.2%；
发生超甲基化（表 3，Ⅱ-B1、Ⅱ-B2、Ⅱ-B3）的位点数 126 个，占总扩增位点的 14.6%；相对于这
3 类（表 3，Ⅱ-C、Ⅱ-D、Ⅱ-E 位点）多态型位点的总数 210 个，占总扩增位点的 24.3%，尽管在这
三者间观察到甲基化多态性，但是每一种多态性都可以用简单的孟德尔遗传解释。
研究发现叶籽银杏相对于银杏在甲基化变异类型上以多态性变异为主，叶籽银杏的超甲基化变
异高于其去甲基化变异。
8 期 李际红等：叶籽银杏 DNA 甲基化水平与模式变异的研究 1539

图 1 萌动期叶籽银杏与银杏甲基化模式的变化图
H：EcoRⅠ+ HpaⅡ双酶切；M：EcoRⅠ+ MspⅠ双酶切；M：2 000 bp DNA 分子量标准；YZ1：叶籽银杏；CK：银杏。
Fig. 1 The type of methylation amplified polymorphism sites of the Ginkgo biloba var. epiphylla and G. biloba L. at budding stage
H and M are the combinations of enzymes of EcoRⅠ/HpaⅡ and EcoRⅠ/MspⅠ，respectively.
M：2 000 bp the DNA molecular-weight marker. YZ1：Epiphylla ginkgo；CK：Ginkgo.

表 3 萌动期叶籽银杏和银杏甲基化模式的变化
Table 3 Different patterns of methylation in Ginkgo biloba var. epiphylla and G. biloba L.，
numbers of sites，and frequencies at budding stage
叶籽银杏 YZ1 银杏 CK 类型
Class EcoRⅠ/HpaⅡ EcoRⅠ/MspⅠ EcoRⅠ/HpaⅡ EcoRⅠ/MspⅠ
位点数
Number of sites
频率/%
Frequency
Ⅰ 414 47.9
Ⅰ-1 1 1 1 1 372
Ⅰ-2 1 0 1 0 12
Ⅰ-3 0 1 0 1 30
Ⅱ 450 52.1
Ⅱ-A 114 13.2
Ⅱ-A1 0 0 1 1 42
Ⅱ-A2 0 1 1 1 36
Ⅱ-A3 1 0 1 1 36
Ⅱ-B 126 14.6
Ⅱ-B1 1 1 0 0 36
Ⅱ-B2 1 0 0 0 42
Ⅱ-B3 0 1 0 0 48
Ⅱ-C 66 7.6
Ⅱ-C1 0 0 0 1 24
Ⅱ-C2 0 0 1 0 42
Ⅱ-D 90 10.4
Ⅱ-D1 1 1 0 1 30
Ⅱ-D2 1 1 1 0 60
Ⅱ-E 54 6.3
Ⅱ-E1 1 0 0 1 18
Ⅱ-E2 0 1 0 1 36
注：“0”：代表没有扩增出带；“1”：代表扩增出带。
Note：“0”stands for the absence of a band，and“1”stands for the present of a band.
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2.2 展叶期叶籽银杏 DNA 胞嘧啶甲基化水平及模式的变异分析
2.2.1 展叶期叶籽银杏和银杏 DNA 胞嘧啶甲基化水平
从 54 对 MSAP 引物中选出 40 对引物组合，扩增产生叶生胚珠（YZ2）与无叶生胚珠（YC）的
叶籽银杏及银杏（CK）767、600 及 367 条清晰可辨的 DNA 扩增位点，在全部扩增位点中检测到总
甲基化位点为 370 个、243 个及 152 个，总甲基化率为 48.3%、40.5%及 41.5%。其中，全甲基化位
点为 176 个、148 个及 107 个，全甲基化率为 22.9%、24.7%及 29.2%，半甲基化位点为 194 个、95
个及 45 个，半甲基化率为 25.4%、15.8%及 12.3%（表 4）。结果显示，展叶期 YZ2、YC 及 CK 的
DNA 胞嘧啶甲基化水平不同，YZ2 的甲基化水平高于 YC 与 CK，YC 与 CK 甲基化的水平接近。叶
籽银杏叶生胚珠的特异性状表达或许与其超甲基化有关。叶籽银杏的高甲基化率，将或许导致部分
基因表达沉默，银杏出现返祖现象。由此推测叶籽银杏叶生胚珠的形成与其系统发育有关。
表 4 40 对 MSAP 引物组合在展叶期叶籽银杏和银杏全基因组甲基化的扩增结果
Table 4 Number of bands amplified using 40 MSAP selective primer combinations in Ginkgo biloba and G. biloba var. epiphylla at
leaf-expansion stages
MSAP 扩增带谱类型 MSAP band type
Ⅰ 非甲基化 Non-methylated Ⅱ 半甲基化 Hemi-methylated Ⅲ 全甲基化 Full methylated
材料
Material
扩增条带总数
Total amplified
bands 条带数 Bands % 条带数 Bands % 条带数 Bands %
有叶生胚珠 YZ2 767 397 51.8 194 25.4 176 22.9
无叶生胚珠 YC 600 357 59.5 65 15.8 148 24.7
银杏 CK 367 215 59.6 45 12.3 107 29.2

分别用 EcoRⅠ+ HpaⅡ，EcoRⅠ+ MspⅠ（Fermentas Lithuanian）内切酶不同引物组合对展叶期
叶籽银杏、银杏基因组 DNA 进行酶切、连接、预扩增、选择性扩增、6%聚丙烯酰胺凝胶电泳、银
染检测，获得谱带清晰、重复性好、甲基化修饰位点丰富的展叶期叶籽银杏有叶生胚珠、叶籽银杏
无叶生胚珠及银杏 MSAP 扩增图谱（图 2）。













图 2 展叶期叶籽银杏和银杏基因组 DNA 甲基化差异位点的 MSAP 扩增图谱
Ⅰ：非甲基化位点；Ⅱ：半甲基化位点；Ⅲ：全甲基化位点。H：EcoRⅠ+ HpaⅡ双酶切；M：EcoRⅠ+MspⅠ双酶切；
M：Marker；a ~ d：不同选扩引物扩增结果。YZ2：叶籽银杏有叶生胚珠；YC：叶籽银杏无叶生胚珠；CK：银杏。
Fig. 2 MSAP fingerprints of Ginkgo biloba var. epiphylla and Ginkgo biloba genomic DNA at leaf-expansion stages
Ⅰ：Non-methylated sites；Ⅱ：Hemi-methylated sites；Ⅲ：Full-methylated sites. H：EcoRⅠ/HpaⅡdouble digestion；M：EcoRⅠ/MspⅠ
double digestion；M：Marker；a–d：Different primer combinations；YZ2：Epiphyllous-ovule leaf of epiphylla ginkgo；
YC：Normal leaf of epiphylla ginkgo；CK：Ginkgo leaf.
8 期 李际红等：叶籽银杏 DNA 甲基化水平与模式变异的研究 1541

2.2.2 展叶期叶籽银杏和银杏 DNA 胞嘧啶甲基化模式的变异
由图 3 和表 5 可知，从 40 对扩增引物中检测到 1 734 条扩增条带，展叶期叶生胚珠（YZ2）相
图 3 展叶期叶籽银杏甲基化变化模式图
Fig. 3 The ratios of methylation amplified polymorphism sites of the Ginkgo biloba var. epiphylla at leaf-expansion stages

表 5 展叶期叶籽银杏叶生胚珠相对于无叶生胚珠及银杏甲基化模式的变化
Table 5 Different patterns of methylation in Ginkgo biloba var. epiphylla and Ginkgo biloba L.，numbers of sites，
and frequencies of at leaf-expansion stages
有叶生胚珠
YZ2
无叶生胚珠
YC
有叶生胚珠
YZ2
银杏
CK 类型
Class H M H M
位点数
Site
频率/%
Frequency

H M H M
位点数
Site
频率/%
Frequency
Ⅰ 261 45.4 179 35.8
Ⅰ-1 1 1 1 1 199 1 1 1 1 116
Ⅰ-2 1 0 1 0 11 1 0 1 0 10
Ⅰ-3 0 1 0 1 51 0 1 0 1 53
Ⅱ 314 54.6 321 64.2
Ⅱ-A 47 8.2 24 4.8
Ⅱ-A1 0 0 1 1 11 0 0 1 1 7
Ⅱ-A2 0 1 1 1 30 0 1 1 1 14
Ⅱ-A3 1 0 1 1 6 1 0 1 1 3
Ⅱ-B 92 16.0 140 28.0
Ⅱ-B1 1 1 0 0 30 1 1 0 0 61
Ⅱ-B2 1 0 0 0 35 1 0 0 0 34
Ⅱ-B3 0 1 0 0 27 0 1 0 0 45
Ⅱ-C 26 4.5 15 3.0
Ⅱ-C1 0 0 0 1 10 0 0 0 1 9
Ⅱ-C2 0 0 1 0 7 0 0 1 0 6
Ⅱ-D 84 14.6 81 16.2
Ⅱ-D1 1 1 0 1 24 1 1 0 1 62
Ⅱ-D2 1 1 1 0 14 1 1 1 0 19
Ⅱ-E 65 11.3 61 12.2
Ⅱ-E1 1 0 0 1 6 1 0 0 1 11
Ⅱ-E2 0 1 0 1 52 0 1 0 1 50
注：H：EcoR +Ⅰ HpaⅡ双酶切；M：EcoRⅠ+ MspⅠ双酶切。
Note：H and M are the combinations of enzymes of EcoR /Ⅰ HpaⅡ and EcoR /Ⅰ MspⅠ，respectively.
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对于无叶生胚珠（YC）、银杏（CK）甲基化的变异类型表现为单态型位点有 261 个、179 个，占总
扩增位点的 45.4%、35.8%，多态型位点有 314 个、321 个，占总扩增位点的 54.6%、64.2%；在多态
型变异类型中，YZ2 相对于 YC 及 CK 发生去甲基化（表 5，Ⅱ-A1、Ⅱ-A2、Ⅱ-A3）的位点为 47
个、24 个，占总扩增位点的 8.2%、4.8%；发生超甲基化（表 5，Ⅱ-B1、Ⅱ-B2、Ⅱ-B3）的位点 92
个、140 个，占总扩增位点的 16.0%、28.0%，相对于这 3 类（表 5，Ⅱ-C、Ⅱ-D、Ⅱ-E 位点）多态
性位点为 175 个、157 个，占总扩增位点的 30.4%、31.4%。结果显示，展叶期叶生胚珠的叶籽银杏
相对于无叶生胚珠的叶籽银杏及银杏甲基化变异类型以多态性变异为主，叶生胚珠相对于无叶生胚
珠和银杏在多态性变异中表现为超甲基化（16.0%、28.0%）高于去甲基化（8.2%、4.5%），YZ2 相
对于 CK 其超甲基化率更高，变异幅度也更丰富。
3 讨论
DNA 甲基化在植物的生长发育过程中起着重要的调控作用，在不同组织或同一组织的不同发育
阶段，基因组 DNA 的甲基化水平和模式存在差异（Zhao et al.，2007）。陆光远等（2005）的研究证
明，白菜（Brassica campestris L.）种子萌发过程中同时发生甲基化和去甲基化，以去甲基化占据主
导地位，白菜可能通过甲基化和去甲基化的方式调控基因的表达，并最终决定植株的生长发育和器
官分化。
萌动期叶籽银杏的甲基化水平（47.6%）显著高于银杏（42.4%）；展叶期叶籽银杏叶生胚珠、无
叶生胚珠及银杏的甲基化水平分别为 48.3%、40.5%和 41.5%。不论是萌动期还是展叶期，叶籽银杏
的甲基化水平均高于银杏。研究显示，DNA 的甲基化程度越高，转录和翻译为功能蛋白质的可能性
越小（魏华丽 等，2009）。叶籽银杏的高甲基化，体现其形状的特异性与表观遗传修饰具有一定的
关联性。表观遗传调控一旦出现差错就必然会导致生物体生理生化过程的改变，最终出现形态解剖
上的异常（Reik，2007）。叶籽银杏的高甲基化与其形态特性的返祖性或许具有一定的相关性。本研
究为进一步从表观遗传学的角度探讨叶籽银杏起源及系统发育机制奠定了一定基础。
本研究中就叶籽银杏与银杏之间甲基化模式变异研究发现，不论是萌动期还是展叶期叶籽银杏
与银杏之间甲基化模式均存在广泛的变异，其多态性变异的比例明显高于单态性变异，在多态性变
异中存在着多种变异类型，即有去甲基化类型、又有超甲基化类型及两种类型均有但表达不是很明
确的第三类多态性变异类型。这与 Chen 等（2009）在对大花蕙兰（Cymbidium hybridium）拟原球茎
形成期与分化期研究的结果一致，在两个时期中存在着丰富的甲基化变异。在北美巨杉
（Sequoiadendron giganteum）等木本植物中的研究中也发现，DNA 甲基化水平及模式随着树木发育
阶段的转换而发生改变（Monteuuis et al.，2008）。
萌动期，叶籽银杏相对于银杏其单态性比例低于多态性比例，在多态性比例中超甲基化占主 导
地位；展叶期，叶籽银杏叶生胚珠相对于叶籽银杏无叶生胚珠及银杏的单态性比例明显低于其多态
性比例，在多态性比例中去甲基化比例仅为 8.2%和 4.5%，而超甲基化的比例为 16%和 28.0%，叶生
胚珠相对于无叶生胚珠及银杏以超甲基化变异类型为主，叶生胚珠相对于银杏其超甲基化水平更高、
变异幅度也更丰富。Santamaría 等（2009）在对欧洲栗（Castanea sativa）芽的形成与萌发阶段组蛋
白乙酰化和基因组 DNA 甲基化模式的研究中发现存在非常变化，如在顶芽中，芽萌动时甲基化水平
增加，展叶期甲基化水平降低；腋芽在顶芽展叶时 DNA 甲基化的水平恒定，DNA 甲基化在一年里
的波动不大。袁金玲等（2012）在对开花的孝顺竹研究发现，开花期的孝顺竹同时发生甲基化和去
甲基化，但发生去甲基化的概率明显大于发生甲基化的概率，最终导致其甲基化水平极显著降低。
本研究结果与其相近，虽然有所差异，但均在不同发育期存在丰富的变异。展叶期为叶籽银杏发端
8 期 李际红等：叶籽银杏 DNA 甲基化水平与模式变异的研究 1543

期形成的关键期（韩晨静 等，2011），由此推测，叶籽银杏发端期甲基化模式的广泛变异为其叶籽
银杏叶生胚珠形成提供了表观遗传学基础，说明叶籽银杏叶生胚珠的形成与其表观遗传修饰有关，
并能稳定遗传。魏丽华等（2009）的研究也认为，基因中异常的超甲基化导致转录抑制和基因沉默，
且这种异常的甲基化模式（methylation patterns）可遗传数代。

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