全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（1）：143–150 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–09–15；修回日期：2011–11–24
基金项目：国家自然科学基金项目（30871696，31171938）；公益性行业（农业）科研专项（201003021）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：lith@cau.edu.cn）
致谢：本研究承蒙北京市农林科学院林业果树研究所张开春研究员、闫国华副研究员提供试验材料，在此表示感谢。
甜樱桃 DELLA 蛋白基因 PaGAI 的克隆与表达
分析
钟 翡 1，沈欣杰 1，刘 芳 1，袁华招 1，刘兰英 2，李天红 1,*
（1 中国农业大学农学与生物技术学院，北京市果树逆境生理与分子生物学重点开放实验室，北京 100193；2 北京市
海淀区植物组织培养技术实验室，北京 100091）
摘 要：利用 RT-PCR 和 RACE 技术从甜樱桃（Prunus avium L.）嫩叶中克隆了赤霉素信号转导途径
中的关键负调控因子 DELLA 蛋白基因 cDNA 全序列，将其命名为 PaGAI。该基因 cDNA 全长 2 310 bp，
开放阅读框 ORF 为 1 788 bp，推测其编码一个含有 595 个氨基酸残基的多肽链，蛋白质分子量约 64 kD。
生物信息学分析结果表明，PaGAI 编码蛋白具有 DELLA 蛋白保守结构域，其 N 端存在两个非常保守的
酸性结构域 DELLA 和 VHYNP 作为信号感知区域，C 端有 VHIID、RVER 和 SAW 结构域作为阻遏区域。
PaGAI 与其它植物的 DELLA 蛋白具有较高的同源性，其中与苹果 MdRGL2b 蛋白同源性最高，达到 84%。
构建 pGEX-4T-1/PaGAI 原核表达体系，并转化 E. coli BL21，经 0.5 mmol · L-1 IPTG 诱导蛋白表达，
SDS-PAGE 检测获得了分子质量为 91 kD 的融合蛋白，半定量 RT-PCR 分析表明，PaGAI 在花、果实、叶
片、韧皮部中普遍表达，在花与韧皮部中的表达远远强于在果实与叶片中的表达。
关键词：甜樱桃；DELLA 蛋白；基因克隆；原核表达
中图分类号：S 662.5 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）01-0143-08

Cloning and Expression Analysis of PaGAI gene of DELLA Protein from
Prunus avium
ZHONG Fei1，SHEN Xin-jie1，LIU Fang1，YUAN Hua-zhao1，LIU Lan-ying2，and LI Tian-hong1,*
（1College of Agronomy and Biotechnology，Key Laboratory of Stress Physiology and Molecular Biology for Fruit Trees of
Beijing，China Agricultural University，Beijing 100193，China；2Laboratory of Plant Tissue Culture Technology，Haidian
District，Beijing 100091，China）
Abstract：DELLA protein is a key negative regulation factor of gibberellins（GAs）signal transduction
pathway. A whole cDNA sequence of DELLA protein gene，named PaGAI，was cloned from Prunus avium
L. tender leaves using RT-PCR and RACE-PCR. The cDNA of PaGAI had a length of 2 310 bp and
contain an opening-reading frame（ORF）of 1 788 bp，which was supposed to encode a 595 amino-acid
residues polypeptide of 64 kD. Bioinformatics analysis showed that the protein encoded by PaGAI had a
conservative structural domain of DELLA protein. It had two strict conservative amino acid domains
DELLA and VHYNP in the N terminal and three repression regions of VHVID，RVER and SAW in the C

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terminal. PaGAI，with high homologous with the DELLA proteins in some other plants，and showed the
highest homology of 84% with Malus domestica. The prokaryotic expression system of pGEX-4T-1/PaGAI
was constructed and transformated into E. coli BL21，and the protein expression was induced by 0.5
mmol · L-1 IPTG and a 91 kD fusion protein was detected by SDS-PAGE. Semi-quantitative RT-PCR
analysis showed that PaGAI widely expressed in flower，fruit，leaf and phloem，and PaGAI in the
expression of flower and phloem is much stronger than in fruit and leaf.
Key words：Prunus avium；DELLA protein；gene cloning；prokaryotic expression

赤霉素（Gibberellins，GA）的合成与代谢途径已研究得较为清楚，而且代谢关键酶和相应的基
因也相继得以克隆（Yamaguchi et al.，1998；Yamaguchi，2008），目前研究重点集中于对赤霉素信
号转导途径的分子机制的探讨（Harberd et al.，2009；Sun，2010）。在已发现的植物 GA 信号传递组
分中，有一类蛋白的 N 端极其保守，具有共同的 DELLA 结构域，称之为 DELLA 家族蛋白，其作
为一个关键调控因子，在 GA 信号传导过程中起负调节作用（Fleet & Sun，2005）。在没有 GA 的情
况下，DELLA 蛋白阻遏植物的生长发育过程；当有 GA 信号时，DELLA 蛋白通过泛素化途径降解，
从而解除其阻遏作用（Motoyuki et al.，2003；Dai & Xue，2010）。如果 DELLA 蛋白基因发生突变，
将使植物产生矮化等异常的生理现象。20 世纪 90 年代，有研究发现“绿色革命”中导致小麦产生
矮化性状的基因 rht1 即为 DELLA 蛋白的编码基因，该基因突变后导致小麦中的 GA 信号转导途径
受阻，影响下游基因的表达，因而形成一个新的矮化品种（Peng et al.，1999；Hedden，2003）。
甜樱桃（Prunus avium L.）矮化密植栽培具有提早结果，方便采摘，提高土地和光能利用效率
等优点（张力思 等，2001；牛爱国 等，2004；陈秋芳 等，2009；和青山和杨亚丽，2010）。如果
将赤霉素信号转导负向调节因子 DELLA 蛋白基因导入甜樱桃品种，通过组织表达特异性启动子控
制该基因在韧皮部的过量表达，干扰 GA 信号转导途径在韧皮部的正常响应过程，使其株高降低，
将有望培育出性状优良并适于矮化密植的接穗新品种，为甜樱桃矮化育种和栽培开辟新途径。
本研究中从甜樱桃‘红灯’嫩叶中克隆得到 DELLA 蛋白编码基因 PaGAI 的 cDNA 全序列，并
构建原核表达载体 pGEX4T-1/PaGAI，将其转化 E. coli BL21，通过诱导蛋白表达验证其生物活性，
并通过半定量 RT-PCR 技术对 PaGAI 在甜樱桃不同组织部位的表达情况进行检测，为进一步研究
DELLA 蛋白功能并利用其进行甜樱桃基因工程矮化育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料及其 RNA 的提取与 cDNA 第 1 条链的合成
甜樱桃‘红灯’（Prunus avium L.‘Hongdeng’）采自北京市农林科学院林业果树研究所。2009
年 4 月下旬采嫩叶后，置于冰盒中立即带回实验室，液氮速冻后存于–80 ℃冰箱备用。
采用 SDS 法（Palmiter，1974）提取嫩叶总 RNA，用 DNaseⅠ（TaKaRa）消化去除 RNA 中的
DNA。参照 Promega 公司 M-MLV 反转录酶（M-MLV Reverse Transcriptase）说明书反转录合成 cDNA
第 1 条链，以此为模板扩增 PaGAI 基因的中间保守片段；参照 Clotech 公司的 SmarterTM RACE cDNA
Amplication Kit 说明书分别反转录合成 cDNA 第 1 条链，以此为模板进行 3′RACE 和 5′RACE 反应。
1.2 PaGAI 基因的中间片段的同源克隆
从 NCBI 上搜索已报道的植物 GAI 同源基因的氨基酸序列和相关的 EST 序列，根据其保守区域
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设计简并引物：LT5′-CAGATGCACTTCTACGAGACCTG-3′，RT 5′-CNATGAGCGGNCGNGTGTGCC
A-3′。利用 RT-PCR 技术扩增 PaGAI 基因的中间片段。PCR 反应程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变
性 30 s，59 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，扩增 35 个循环；72 ℃延伸 10 min。1%琼脂糖凝胶电
泳检测 PCR 产物后，回收目的片段，连接至 pMD18-T 载体，转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，蓝
白斑筛选阳性克隆，菌落 PCR 鉴定后委托上海英骏生物科技公司测序。
1.3 3′RACE 和 5′RACE
根据中间片段的测序结果分别设计 3′端基因特异性引物（3Gsp1、3Gsp2）和 5′端基因特异性引
物（5Gsp1、5Gsp2），其中 3Gsp1：GGAGCAGGAGGCAAACCATAATG；3Gsp2：TCCGAGTCAG
GATTTGGTCATGTC；5Gsp1：GGCTTCATGGCCTTGATTGATGAC；5Gsp2：GACGTGGACTCTAC
TTGCGGTGGCAAAGGCTTCG。通过巢式 PCR 的方法扩增 PaGAI 基因的 3′和 5′末端（Clotech
SmarterTM RACE cDNA Amplication Kit）。
3′末端的扩增：以 3Gsp1、通用引物 UPM 为一对引物进行第 1 轮 PCR，然后将其产物稀释 50
倍后作为模板，以 3Gsp2、巢式引物 NUP 为一对引物进行第 2 轮巢式 PCR。5′末端的扩增：以 5Gsp1、
通用引物 UPM 为一对引物进行第 1 轮 PCR，然后将其产物稀释 50 倍后作为模板，以 5Gsp2、巢式
引物 NUP 为一对引物进行第 2 轮巢式 PCR。PCR 程序为：94 5 min℃ ；94 30 s℃ ，Tm（Tm根据引
物不同在 60 ~ 65 ℃之间变化）30 s，72 2 min℃ ，35 个循环；72 10 min℃ 。所有引物均由上海英
骏生物科技公司合成。PCR 产物经回收、连接、转化、鉴定后委托上海英骏生物科技公司测序。
1.4 PaGAI 基因全长的电子克隆及序列分析
将中间片段、3′末端和 5′末端的测序结果提交 NCBI（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/）后进行
BLASTx 检索，均确认为 GAI 同源序列后，将三者通过重复序列进行拼接得到 PaGAI 基因的电子全
长。采用 BLASTx 和 BLASTn 进行序列相似性分析，用 ORF finder 分析开放阅读框（ORF）。通过
软件 DNAman 和 Bioedit 进行氨基酸序列比对，利用 MEGA 软件进行系统进化树的构建。
1.5 PaGAI 基因原核表达载体的构建及 IPTG 诱导表达
根据 PaGAI 基因全长的 ORF 序列设计引物并引入 pGEX-4T-1 原核表达载体上的酶切位点，PCR
产物目的长度为 1 797 bp。引物 PF1：GGATCCATGAAGAGAGATCACCGCGATACCT（划线部分为
BamHⅠ酶切位点）；PF2：GTCGACCACTGAGTCACTCGGTTCAACT（划线部分为 SalⅠ酶切位点）。
PCR 程序：94 5 min℃ ；94 30 s℃ ，62 40 s℃ ，72 2 min℃ ，35 个循环；72 10 min℃ 。1%琼
脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物后，回收并纯化目的片段，连接至 pMD18-T Simple 载体。以 BamHⅠ
和 SalⅠ分别双酶切表达载体 pGEX-4T-1 和连接 PaGAI 基因全长的 pMD18-T Simple 载体。回收酶
切产物后以 T4 DNA 连接酶连接 24 h 构建重组质粒，将阳性重组质粒转化 E. coli BL21 感受态细胞。
提取质粒进行 BamHⅠ和 SalⅠ双酶切鉴定获得阳性克隆。
挑取阳性单菌落接种于 LB 液体培养基（含 Amp 液体培养基），37 ℃、200 r · min-1 振荡培养至
OD600 = 0.6，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为 0.5 mmol · L-1，28 ℃、180 r · min-1 继
续诱导表达，同时设置未连接 PaGAI 基因的 pGEX-4T-1 空载体为对照，分别在诱导后的 0、2、4、
6、8 和 10 h 取样，10% SDS-PAGE 电泳检测蛋白表达情况。
1.6 PaGAI 基因在甜樱桃中的组织表达分析
通过半定量 RT-PCR 检测 PaGAI 基因在花、果实、叶、韧皮部的表达量与组织特异性。分别提
取各组织部位的 RNA，通过引物 LT、RT 扩增 PaGAI 的特异性片段。同时根据樱桃的 18S RNA 序
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列设计内参引物，正向：ACTCGGGGGCATTCGTATTT；反向：CCCTGGTCGGCATGGTTTAT。PCR
程序为：94 ℃ 5 min；94 30 s℃ ，60 30 s℃ ，72 1 min℃ ，35 个循环；72 10 min℃ 。
2 结果与分析
2.1 甜樱桃‘红灯’嫩叶 DELLA 蛋白基因 PaGAI 的克隆
根据 NCBI 上公布的拟南芥、苹果、葡萄的 DELLA 蛋白的氨基酸序列设计简并引物，以‘红
灯’嫩叶 cDNA 第 1 条链为模板，RT-PCR 扩增得到 1 条 857 bp 的中间片段（图 1，A）。通过 BLASTx
比对确认为 GAI 基因的同源序列，其编码氨基酸与苹果 DELLA 蛋白 RGL2b 同源性最高，达到 93%。
根据中间片段设计 3′RACE 特异性引物 3Gsp1、3Gsp2，巢式 PCR 扩增后得到一条 672 bp 的片
段（图 1，B），与中间片段的重叠区域为 175 bp，3′端非编码区为 497 bp。
根据中间片段设计 5′RACE 特异性引物 5Gsp1、5Gsp2，巢式 PCR 扩增后得到 1 条 1 182 bp 的
片断（图 1，C），与中间片断的重叠区域为 103 bp，5′端非编码区为 200 bp。
将上述 3 段序列根据重叠区域进行拼接得到 PaGAI 基因全长，为 2 310 bp，ORF 为 1 788 bp，
编码 1 条含 595 个氨基酸的多肽链，为 64 kD，等电点 pI 为 4.88。该基因的起始密码子为 ATG，-3
位为 A，符合 KOZAK 规律，终止密码子为 TGA，3′末端含有一连串的 poly A 序列，这些都符合基
因全长 cDNA 高效转录和翻译的特征。
图 1 甜樱桃‘红灯’PaGAI 基因中间片段（A）、3′RACE（B）和 5′RACE（C）的 PCR 扩增结果
Fig. 1 Electrophoresis results of PaGAI gene middle fragment（A），3′ end PCR product（B），
5′ end PCR product （C）in Prunus avium L.‘Hongdeng’
M1：DNA markerⅡ；M2：100 bp plus DNA ladder
2.2 PaGAI 基因的序列比对及系统进化树的构建
将 PaGAI 基因在 NCBI 上进行 BLASTx 比对，表明其编码的氨基酸与其它物种的 DELLA 蛋白
相似度较高。其中与苹果 RGL2b（AAY56750）相似性最高，达到 83%，其次为葡萄（CAN59753），
为 76%，与杨树（XP_002302975）、蓖麻（XP_002534030）、棉花（ABG26370）、菜豆（BAF62637）
的相似性分别为 71%、72%、74%和 69%。通过 DNAman 和 Bioedit 软件进行氨基酸同源性比较（图
2），结果表明 PaGAI 蛋白与数据库中不同物种的 DELLA 蛋白具有较高的同源性，都具有 DELLA
蛋白家族所共有的结构域，包含 N 末端的 DELLA 和 VHYNP，中心区的 VHIID、核定位区域（NLS）、
两个亮氨酸拉链区（LZ）和丝氨酸、苏氨酸富集区（Poly S/T），以及 C 末端的 RVER 和 SAW 保守
结构域。其中 DELLA 和 VHYNP 这两个酸性结构域是 GA 的信号感知区；VHVID、Saw 等结构域
作为阻遏区域发挥阻遏作用；NLS 区是转录因子的标志之一，含有 NLS 区的蛋白可以从细胞质定
位到细胞核；LZ 是形成蛋白二聚体的必需元件；Poly S/T 位点是蛋白磷酸化和糖基化的位点（Dill et
al.，2001；Itoh et al.，2002；Liu et al.，2010）。
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图 2 PaGAI 与其它植物 DELLA 蛋白基因的氨基酸序列的同源性比较
箭头部分为保守序列，阴影部分为不变残基。
Fig. 2 Alignment of deduced amino acid sequence of PaGAI with others DELLA protein genes in plants
The conserved regions are marked with arrows，and invariant residues are shaded.
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图 4 PaGAI 基因全长电泳图 图 5 重组质粒 pGEX-4T-1/PaGAI 的酶切鉴定图
Fig. 4 Electrophoresis of full-length PaGAI gene Fig. 5 Identifica tion of recombinant plasmid pGEX-4T-1/PaGAI
M：500 bp DNA ladder. by restriction digestion
M：DNA marker Ⅲ.
图 3 甜樱桃与其它物种 DELLA 蛋白氨基酸序列同源性分析
Fig. 3 Molecular phylogenetic tree analysis of the deduced
amino acid sequences homolog of GAI in Prunus avium
with related other plant species
图 6 重组质粒 pGEX-4T-1/PaGAI 表达产物 SDS-PAGE 分析
Fig. 6 SDS-PAGE analysis for the expression product of
recombinant plasmid pGEX-4T-1/PaGAI
图 7 PaGAI 基因在甜樱桃中的组织表达分析
Fig. 7 Expression analysis of PaGAI in Prunus avium by
semiquantitative RT-PCR with ACTIN as control
从甜樱桃PaGAI蛋白中发现这些保守结构
域，进一步说明 DELLA 蛋白可能作为潜在的
转录因子，并通过蛋白泛素化降解途径来解除
其阻遏作用（Schwechheimer & Willige，2009；
Gallego-Bartolome et al.，2010）。
分子系统进化树分析表明，甜樱桃 PaGAI
与苹果、葡萄、蓖麻和豌豆聚为一类。其中与
苹果的 DELLA 蛋白亲缘关系最近，其次是
葡萄，而与拟南芥、水稻的亲缘关系较远（图
3）。
2.3 PaGAI 基因的原核表达
根据 PaGAI 基因的 ORF 设计全长引物（引入 BamHⅠ、SalⅠ酶切位点），PCR 扩增到 1 条 1 791
bp 的 cDNA 片段（图 4）。测序后显示此序列与拼接结果一致。对重组质粒 pGEX-4T-1/PaGAI 进行
BamHⅠ和 SalⅠ双酶切鉴定（图 5）并测序，表明 PaGAI 基因已成功连接至原核表达载体 pGEX-4T-1
中。将 pGEX-4T-1/PaGAI 转化 E. coli BL21 感受态细胞后表达一条 91 kD 的特异性蛋白条带（融合
了 pGEX-4T-1 载体上 27 kD 的 GST 蛋白标签，图 6），且随诱导时间延长表达量增大。在 0 h 取样
的未诱导样品无此条带，pGEX-4T-1 空载体诱导后也无此条带，而表达出 27 kD 的 GST 蛋白标签。
表明经 IPTG 诱导后 PaGAI 表达出预期分子量大小并具有活性的蛋白，可进一步制备多克隆抗体。

1 期 钟 翡等：甜樱桃 DELLA 蛋白基因 PaGAI 的克隆与表达分析 149

2.4 PaGAI 的半定量 RT-PCR 分析
分析结果（图 7）显示，PaGAI 在花、果实、叶片、韧皮部中均有表达，在花与韧皮部中的表
达远远强于果实和叶片，其中在花中的表达最强，其次为韧皮部、叶片，而在果实中的表达最弱。
3 讨论
目前已从拟南芥（Peng et al.，1999）、水稻（Ikeda et al.，2001）、葡萄（Paul & Mark，2002）、
苹果（梁美霞 等，2011）等多个物种中克隆得到 DELLA 蛋白基因，其功能也得以进一步研究。Foster
等（2007）将苹果 DELLA 蛋白基因 MdRGL2a 转入拟南芥进行过表达，转基因植株表现出叶片紧缩、
茎杆变短、花期延长、对外源 GA3 敏感度降低，类似于拟南芥 gai 矮化突变体的表型特征（Peng et al.，
1997）。在酿酒葡萄 l1 突变体中，DELLA 区域突变成了 DELHA，导致植株矮化（Paul & Mark，2002）。
表明 DELLA 蛋白功能较为保守，可引起植物的矮化。本研究中首次从甜樱桃‘红灯’中获得 DELLA
蛋白基因 PaGAI，且甜樱桃 PaGAI 与苹果、葡萄的相似性非常高，为将 PaGAI 转入甜樱桃获得转
基因矮化株系提供了良好的基因资源。
目前，赤霉素的信号转导模式的建立主要通过拟南芥和水稻等模式植物中有关 GAI/RGA 蛋白
的研究及其与上下游作用因子的蛋白互作。Feng 等（2008）研究发现了 DELLA 蛋白的一个下游作
用因子——PIF3（光敏色素色素因子），当缺乏 GA 时，DELLA 蛋白大量积累，并与 PIF3 结合，阻
止 PIF3 与下游基因的启动子的结合和表达，从而抑制下胚轴的伸长。目前研究显示 GA 信号转导途
径是一个复杂的调控网络，除了光信号外，DELLA 蛋白还受到 ABA、生长素（O’Neill et al.，2010）
以及环境（Achard et al.，2006）等的共同影响。DELLA 蛋白功能并未完全研究清楚，其泛素化降
解途径也有待于进一步研究（Sun，2010）。本研究中成功构建原核表达载体 pGEX-4T-1/PaGAI，通
过 IPTG 诱导获得 91 kD 的蛋白条带，为下一步制备多克隆抗体，进行免疫组织化学、蛋白印迹杂
交及免疫共沉淀等试验奠定基础，为进一步阐明 GA 信号转导模式提供试验支持。
半定量 RT-PCR 分析表明，DELLA 蛋白基因 PaGAI 在樱桃的花、果实、叶子、韧皮部中普遍
表达，且在韧皮部中表达量很高，而 DELLA 蛋白作为 GA 信号转导过程中的关键调控因子
（Ubeda-Tomas et al.，2008；Sun，2010），该结果进一步证明了 GA 与植物的株高关系密切，并暗
示 DELLA 蛋白基因可能作为一个分子开关，其表达情况对株高起着重要的调节作用。因此，如果
将韧皮部特异性表达的启动子与 DELLA 蛋白基因 PaGAI 连接，并通过过表达载体转入甜樱桃中，
控制 DELLA 蛋白基因在甜樱桃韧皮部位的过量表达，既可使达到矮化目的，又不影响花、果实、
叶片的正常生长，这将为利用 DELLA 蛋白基因进行甜樱桃的矮化育种提供一条全新的思路。

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