全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（7）：1307–1316 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–04–10；修回日期：2014–06–19
基金项目：国家自然科学基金项目（31272128）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（2011006）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yfcaas@263.net）
基于叶绿体 DNA 分析的辽宁省梨属种质遗传多
样性研究
常耀军 1，曹玉芬 1,*，张金梅 2，田路明 1，董星光 1，张 莹 1，齐 丹 1，
郑迎春 1
（1 中国农业科学院果树研究所，农业部园艺作物种质资源利用重点实验室，辽宁兴城 125100；2 中国农业科学院作
物科学研究所，国家作物种质库，北京 100081）
摘 要：从 32 对叶绿体 DNA 通用引物中筛选出 8 对引物用于评价辽宁省梨属种质的遗传多样性，
其中 4 对引物所扩增的叶绿体 DNA 片段存在突变位点。合并后的叶绿体基因片段（3 688 bp）含有单一
突变位点 9 个、简约信息性位点 3 个以及插入/缺失（INDEL）2 个。在 37 个样品中，trnL-trnF-487 区域、
trnL-trnF-413 区域、rbcL 区域和 trnS-psbC 区域的单倍型分别为 2 个、4 个、2 个和 3 个，合并之后的叶
绿体基因片段的单倍型为 4 个。非编码区 trnL-trnF-413 多态性最高，具有最高的单倍型数、最高的单倍
型（基因）多样性、最高的核苷酸多样性、最高的单倍型多样性方差和最高的单倍型多样性标准差。辽
宁省 37 份梨种质的单倍型（基因）多样性（Hd）、核苷酸多样性（Pi）分别为 0.577、0.00055。Tajima’s D
检验中除了 rbcL 区域的 D 值在 P < 0.05 水平上显著外，其余区域的 D 值未达显著水平，表明自然选择对
rbcL 区域的突变位点产生了作用。秋子梨和白梨种质共有单倍型 HAP_1、HAP_2 和 HAP_3，显示出一定
的亲缘关系；西洋梨则单独共享 HAP_5。运用中介邻接网络（Median-Joining network，MJ）算法绘制的
中介网络图显示 HAP_1 与 HAP_2、HAP_3 的亲缘关系较远，而 HAP_5 则与上述 3 个单倍型的亲缘关系
较远。
关键词：梨；叶绿体 DNA；单倍型；遗传多样性
中图分类号：S 661.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）07-1307-10

Studies on Genetic Diversity of Pear Germplasm Resources in Liaoning
Province of China Based on Chloroplast DNA Analysis
CHANG Yao-jun1，CAO Yu-fen1,*，ZHANG Jin-mei2，TIAN Lu-ming1，DONG Xing-guang1，ZHANG
Ying1，QI Dan1，and ZHENG Ying-chun1
（1Research Institute of Pomology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic
Improvement of Horticultural Crops；Germplasm Resources Utilization，Xingcheng，Liaoning 125100，China；2National
GenBank，Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）
Abstract：Eight chloroplast DNA（cpDNA）primers were selected from 32 universal primer pairs to
assess the genetic diversity of 37 pear accessions in Liaoning Province. Among these primer amplification

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products，four cpDNA fragments possessed variation sites. Nine singleton variable sites，three parsimony
informative sites and two INDELS were obtained from the combined cpDNA fragments（3 688 bp）. Two
trnL-trnF-487 haplotypes，four trnL-trnF-413 haplotypes，two rbcL haplotypes and three trnS-psbC
haplotypes were identified among the 37 pear accessions，respectively，and four haplotypes were identified
based on the combined fragments. Non-coding region trnL-trnF-413 exhibited highest polymorphism with
the most number of haplotypes，the most abundant haplotype（gene）diversity and nucleotide diversity，
the most variant of haplotype diversity and the highest standard deviation of haplotype diversity. Values of
haplotype（gene）diversity（Hd）and nucleotide diversity（Pi）of 37 pear accessions in Liaoning Province
are 0.577 and 0.00055，respectively. Tajima’s test showed all Tajima’s D values are not statistical
significant except for the rbcL fragment in P < 0.05，indicating that natural selection has an effect on
mutations of this fragment. Both P. ussuriensis and P. bretschneideri accessions contained haplotypes
HAP_1，HAP_2 and HAP_3，showing a close relationship between them；While HAP_5 is shared by P.
communis accessions independently. The network constructed with Median-Joining network calculation
exhibited that HAP_1 has a far relationship with HAP_2 and HAP_3，whereas HAP_5 has a far
relationship with those three haplotypes mentioned above.
Key words：Pyrus；chloroplast DNA；haplotype；genetic diversity

前人对于梨种质资源遗传多样性的研究主要基于不同的 DNA 分子标记，如 RAPD（Teng et al.，
2001，2002）、AFLP（Bao et al.，2008）、RFLP（Iketani et al.，1998）和 SSR（Yamamoto et al.，
2001，2002a，2002b；Bao et al.，2007；Yao et al.，2010）。近 20 年来，DNA 序列分析在植物系
统发育进化研究中得到了很好的应用，但在种质资源遗传多样性研究中的应用较少。叶绿体 DNA
（cpDNA）在大多数被子植物中属母系遗传，且没有或很少经历重组，其中的非编码区具有丰富的
变异，如核苷酸替换、插入/缺失、易位和倒位（Petit et al.，1993），是进行低分类阶元系统发育研
究、杂种亲本鉴定和遗传多样性研究的理想片段（Katayama & Ogihara，1996；Eiadthong et al.，1999；
Kimura et al.，2003）。
目前国内外学者已将 cpDNA 非编码区用于梨属植物遗传多样性、系统发育及品种鉴定研究中，
基于 cpDNA 的系统发育树和网状图（network）可以推断出物种起源和进化历史（Kimura et al.，2003；
胡春云 等，2011）。日本学者最早利用 cpDNA 对梨属植物进行遗传多样性研究和种质资源评价
（Kimura et al.，2003；Katayama et al.，2007），发现梨属植物 cpDNA 非常保守，只有 accD-psaI 和
rps16-trnQ 区属于 cpDNA 的高变区（Katayama et al.，2012）。胡春云等（2011）对梨属 19 个种的
叶绿体非编码区 trnL-trnF 和 accD-psaI 进行序列分析，并通过构建 NeighborNet 系统发育网络揭示
了梨属系统发育关系。Liu 等（2012）在研究浙江省豆梨的遗传多样性和种群结构时，在 77 个个体
中确定了 10 个 accD-psaI 和 2 个 trnL-trnF 的单倍型。Wuyun 等（2013）通过 cpDNA 多变区的单倍
型分析发现总体上野生秋子梨遗传多样性比较低，但其中吉林野生秋子梨的遗传多样性比较高。
辽宁省地处渤海湾，为白梨（P. bretschneideri Rehd.）和秋子梨（P. ussuriensis Maxim.）的主要
产区之一。境内有千山、努鲁尔虎山、大老图山等，分别属于长白山余脉和燕山余脉，境内分布有
多个梨属植物种，原产辽宁的白梨和秋子梨品种数量较为丰富。然而，迄今为止还缺少对辽宁省原
产梨种质遗传多样性的评估。本研究中采用 4 个 cpDNA 片段对 37 个原产辽宁的白梨和秋子梨品种
的遗传多样性进行研究，探讨它们之间的亲缘关系。

7 期 常耀军等：基于叶绿体 DNA 分析的辽宁省梨属种质遗传多样性研究 1309

1 材料与方法
1.1 试材及取样
37 个辽宁省原产的白梨和秋子梨种质来自辽宁兴城中国农业科学院果树研究所“国家果树种质
兴城梨、苹果圃”。此外，还选用了 4 个来自其它地区的砂梨种质，并以 3 个西洋梨为外类群样本，
用于系统发育分析。试验地点为辽宁兴城中国农业科学院果树研究所。2013 年 5 月采集样品嫩叶用
于分析。
1.2 DNA 的提取
DNA 提取采用 Doyle 和 Doyle（1987）的改良 CTAB 法。通过琼脂糖电泳，并对照 λDNA（10
ng · µL-1）将提取基因组 DNA 的浓度调整到 30 ng · µL-1，用于 PCR。
1.3 用于 PCR 扩增的叶绿体 DNA 通用引物的确定与筛选
筛选确定 32 对叶绿体通用引物（表 1，由上海 Sangon 公司合成），随机取 6 个样品进行 PCR
扩增。取 5 µL 扩增产物用 2%琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出条带清晰且有特异性条带的通用引物进
行后续试验。

表 1 本研究所用的叶绿体 DNA 通用引物
Table 1 Chloroplast DNA universal primer pairs used in this study
编号
Code
扩增区域
Region
正向序列（5′–3′）
Forward sequence（5′–3′）
反向序列（5′–3′）
Reverse sequence（5′–3′）
长度/bp
Size
参考文献
Reference
P01 trnT-trnL CATTACAAATGCGATGCTCT TCTACCGATTTCGCCATATC 1 200 Taberlet et al.，1991
P02 trnL-trnF CGAAATCGGTAGACGCTACG GGGGATAGAGGGACTTGAAC 487 Taberlet et al.，1991
P03 trnL-trnF GGTTCAAGTCCCTCTATCCC ATTTGAACTGGTGACACGAG 413 Taberlet et al.，1991
P04 atpB-rbcL TAAACCCCGGACGAAAGTAGTGG ACTTGCTTTAGTTTCGTTTGTGGTGA 829 Katayama & Uematsu，2003
P05 trnL-trnF GGTTCAAGTCCCTCTATCCC ATTTGAACTGGTGACACGAG 462 Taberlet et al.，1991
P06 rpII6 GCTATGCTTAGTGTGTGACTCGTTG CGTACCCATATTTTTCCACCACGAC 1 200 Kelchner & Clark，1997
p07 cp-trnk GGGTTGCCCGGGACTCGAAC CAACGGTAGAGTACTCGGCTTTTA 2 000 Parducci & Szmidt，1999
P08 trnQ-trnG TCGAACCTCCGAATAACAGG CGCATTCGTTAGCTTGGAAG 3 000 Parducci & Szmidt，1999
P09 trnS-psbC GGTTCGAATCCCTCTCTCTC GGTCGTGACCAAGAAACCAC 1 518 Parducci & Szmidt，1999
P10 psbD-16S CCACAAAAACGAAACGGTCT ACTAACTAATCAGACGCGAGCC 2 000 Parducci & Szmidt，1999
P11 psaA-trnS ACTTCTGGTTCCGGCGAACGAA AACCACTCGGCCATCTCTCCTA 2 000 Demesure et al.，1995
P12 trnD-trnT ACCAATTGAACTACAATCCC CTACCACTGAGTTAAAAGGG 2 200 Demesure et al.，1995
P13 trnH-trnK ACGGGAATTGAACCCGCGCA CCGACTAGTTCCGGGTTCGA 1 700 Demesure et al.，1995
P14 trnL-trnF CGAAATCGGTAGACGCTACG GGGATAGAGGGACTTGAAC 1 600 Taberlet et al.，1991
P15 accD-psaI GGAAGTTTGAGCTTTATGCAAATGG AGAAGCCATTGCAATTGCCGGAAA 700 Small et al.，1998
cp01 trnH-trnK ACGGGAATTGAACCCGCGCA CCGACTAGTTCCGGGTTCGA 1 690 Demesure et al.，1995
cp02 trnS-trnfM GAGAGAGAGGGATTCGAACC CATAACCTTGAGGTCACGGG 1 700 Demesure et al.，1995
cp03 rbcL TGTCACCAAAAACAGAGACT TTCCATACTTCACAAGCAGC 1 270 Parani et al.，2000
cp04 trnk1-trnk2 GGGTTGCCCGGGACTCGAAC CAACGGTAGAGTACTCGGCTTTTA 2 580 Demesure et al.，1995
cp05 trnC-trnD CCAGTTCAAATCTGGGTGTC GGGATTGTAGTTCAATTGGT 3 000 Demesure et al.，1995
cp06 trnD-trnT ACCAATTGAACTACAATCCC CTACCACTGAGTTAAAAGGG 1 800 Demesure et al.，1995
cp07 trnM-rbcL TGCTTTCATACGGCGGGACT GCTTTAGTCTCTGTTTGTGG 2 900 Demesure et al.，1995
cp08 trnF-trnVr CTCGTGTCACCAGTTCAAAT CCGAGAAGGTCTACGGTTC 3 492 Dumolin-Lapegue et al.，1997
cp09 trnS-trnT CGAGGGTTCGAATCCCTCTC AGAGCATCGCATTTGTAATG 1 500 Demesure et al.，1995
cp10 psbC-trnS GGTCGTGACCAAGAAACCAC GGTTCGAATCCCTCTCTCTC 1 680 Demesure et al.，1995
cp11 accD-psaI TTATTCGATCCAATCGTACCAC AGAAGCCATTGCAATTGCCGGAAA 710 Liu et al.，2012
cp12 trnL-trnF GGTTCAAGTCCCTCTATCCC ATTTGAACTGGTGACACGAG 400 Small et al.，1998
cp13 trnL-trnF2 CGAAATCGGTAGACGCTACG ATTTGAACTGGTGACACGAG 1 000 Taberlet et al.，1991
cp14 trnT-trnF3 CATTACAAATGCGATGCTCT ATTTGAACTGGTGACACGAG 1 400 Taberlet et al.，1991
cp15 trnL-trnF3 GGTTCAAGTCCCTCTATCCC ATTTGAACTGGTGACACGAG 400 Taberlet et al.，1991
cp16 trnD-trnT ACCAATTGAACTACAATCCC CTACCACTGAGTTAAAAGGG 900 Demesure et al.，1995
cp17 trnV-rbcLr CGAACCGTAGACCTTCTCGG GCTTTAGTCTCTGTTTGTGG 3 850 Dumolin-Lapegue et al.，1997
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1.4 PCR 扩增和测序
PCR 扩增体系为 40 µL，含 DNA 模板 40 ng，引物 0.4 µmol · L-1，dNTP（北京天根）200 µmol · L-1，
MgCl2 2 mmol · L-1，Taq DNA 聚合酶（北京天根）2 U。扩增程序如下：90 ℃预变性 90 s；90 ℃变
性 30 s，退火温度 52 ℃持续 40 s，72 ℃延伸 90 s，35 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min；10 ℃保温
10 min。对于大于 3 000 bp 的扩增产物，延伸条件则为 72 ℃延伸 2.5 min，其余同上。cp11 引物扩增
的 accD-psaI 区域采用如下扩增程序：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，退火温度 56 ℃持续 40 s，
72 ℃延伸 90 s，35 个循环；最后 72 ℃延伸 6 min；10 ℃保温 10 min。取扩增产物 5 µL 进行 2%琼
脂糖凝胶电泳。
PCR 扩增产物纯化完成后交由上海美吉测序公司（北京）用美国 ABI 公司的 3730XL 测序仪进
行测序。PCR 体系为 20 µL，含 DNA 1 µL，BigDye 8 µL，引物 1 µL，ddH2O 10 µL。采用如下测序
程序：96 ℃预变性 1 min；96 ℃变性 10 s，退火温度 50 ℃持续 5 s，60 ℃延伸 4 min，25 个循环；
最后 60 ℃延伸 30 min；4 ℃保温。每一个片段进行测序时，所用引物的正反向序列见表 1，每一个
样品的每一个 cpDNA 片段均进行正、反向测序，2 次测定，超过 2 000 bp 的测通。
1.5 数据分析
为了便于数据分析，所有的序列在人工校对之后都被保存为 FASTA 和 MEGA 格式。利用 Clustal
X ver 2.1 软件对序列进行比对。使用软件 PAUP beta ver 4.0 将叶绿体 DNA 片段 trnL-trnF、trnL-trnF、
rbcL 和 trnS-psbC 进行合并。
将单个片段和合并之后的片段保存后，运用 DnaSP ver 5.10.01（Librado & Rozas，2009）计算
变异位点（Variable sites，Vs）、单一突变位点（Singleton variable sites，Ss）、简约信息性位点（Parsimony
informative sites，Ps）、核苷酸多样性（nucleotide diversity，Pi）、平均核苷酸差异（average number of
nucleotide differences，k）、单倍型数目（Number of haplotypes，h）、单倍型多样性（Haplotype diversity，
Hd）、单倍型多样性方差（Variance of haplotype diversity，Vh）、单倍型多样性标准差（Standard deviation
of haplotype diversity，Sh）和 Tajima’s D 值（Tajima’s D）。Tajima’s D 检验的目的是鉴定目标 DNA
序列在进化过程中是否遵循中性进化模型。中性进化理论的核心为大部分对种群的遗传结构与进化
有贡献的分子突变在自然选择的意义上都是中性或近中性的，因而自然选择对这些突变并不起作用；
中性突变的进化是随机漂移的过程，或被固定在种群中，或消失。
将 37 个梨属种质的相关数据保存为 Nexus 文件后，运用 NetWork ver 4.6.1.2，采用中介邻接网
络（Median-Joining network，MJ）算法，并用最大简约（Maximum Parsimony calculation，MP）算
法来优化由 MJ 计算得到的结果，构建其叶绿体 DNA 单倍型间的关联图。
2 结果与分析
2.1 引物的 PCR 扩增筛选和突变位点鉴定
用 32 对引物（表 1）对模板 DNA 进行扩增，有 8 对引物能够扩增出单一、清晰、稳定的特异
性条带，它们是 P01、P02、P03、P09、P14、cp03、cp10 和 cp13，其余 24 对引物无扩增条带、或
者扩增出不完全条带、或者扩增出的条带模糊无法辨别。通过分析、确认测序结果，8 对引物中的 4
对引物 P02（trnL-trnF）、P03（trnL-trnF）、P09（trnS-psbC）、cp03（rbcL）扩增的 cpDNA 片段存
在突变位点，其中引物 P02、P03 扩增的是叶绿体基因片段 trnL-trnF 的不同区域，其余 4 对引物扩
增的 cpDNA 片段没有发现突变位点。本研究涉及的 cpDNA 区域为 trnL-trnF（P02 和 P03）、trnS-psbC
7 期 常耀军等：基于叶绿体 DNA 分析的辽宁省梨属种质遗传多样性研究 1311

（P09）和 rbcL（cp03）。
试验获得的单倍型 1、单倍型 2、单倍型 3 和单倍型 4 所包含的梨种质如表 2，上述 4 个区域的
突变位点及单倍型类型的具体信息如表 3 所示。

表 2 供试的梨种质及叶绿体 DNA 单倍型分布
Table 2 Pear accessions used in this study and their cpDNA haplotype distribution
种类
Species
编号
Code
种质名称
Accession name
来源
Origin
单倍型
Haplotypes
秋子梨 01 鞍山 1 号 Anshan 1 辽宁鞍山 Anshan，Liaoning HAP_2
P. ussuriensis Maxim. 02 大香水 Daxiangshui 辽宁鞍山 Anshan，Liaoning HAP_3
03 官红宵 Guanhongxiao 辽宁北镇 Beizhen，Liaoning HAP_2
04 花盖 Huagai 辽宁 Liaoning HAP_1
05 黄金对麻 Huangjin Duima 辽宁北镇 Beizhen，Liaoning HAP_2
06 辉山白 Huishanbai 辽宁沈阳 Shenyang，Liaoning HAP_3
07 尖把梨 Jianbali 辽宁开原 Kaiyuan，Liaoning HAP_2
08 六月鲜 Liuyuexian 辽宁鞍山 Anshan，Liaoning HAP_4
09 满园香 Manyuanxiang 辽宁绥中 Suizhong，Liaoning HAP_2
10 木梨 Muli 辽宁建昌 Jianchang，Liaoning HAP_2
11 南果梨 Nanguoli 辽宁鞍山 Anshan，Liaoning HAP_2
12 平梨 Pingli 辽宁 Liaoning HAP_2
13 青糖 Qingtang 辽宁北镇 Beizhen，Liaoning HAP_2
14 秋子 Qiuzi 辽宁北镇 Beizhen，Liaoning HAP_2
15 热秋子 Reqiuzi 辽宁葫芦岛 Huludao，Liaoning HAP_2
16 砂糖梨 Shatangli 辽宁庄河 Zhuanghe，Liaoning HAP_2
17 甜秋子 Tianqiuzi 辽宁北镇 Beizhen，Liaoning HAP_2
18 小核白 Xiaohebai 辽宁开原 Kaiyuan，Liaoning HAP_3
19 小香水 Xiaoxiangshui 辽宁 Liaoning HAP_1
20 岫岩慈 Xiuyanci 辽宁岫岩 Xiuyan，Liaoning HAP_3
21 羊奶香 Yangnaixiang 辽宁鞍山 Anshan，Liaoning HAP_2
22 早蜜 Zaomi 辽宁建平 Jianping，Liaoning HAP_2

23 自生 17 Zisheng 17 辽宁北镇 Beizhen，Liaoning HAP_1
白梨 24 半斤酥 Banjinsu 辽宁锦州 Jinzhou，Liaoning HAP_3
P. bretschneideri Rehd. 25 大核白 Dahebai 辽宁建昌 Jianchang，Liaoning HAP_2
26 鹅头梨 Etouli 辽宁建昌 Jianchang，Liaoning HAP_2
27 海城茌梨 Haicheng Chili 辽宁海城 Haicheng，Liaoning HAP_3
28 金锤子 Jinchuizi 辽宁庄河 Zhuanghe，Liaoning HAP_3
29 六瓣 Liuban 辽宁建昌 Jianchang，Liaoning HAP_2
30 六棱 Liuleng 辽宁熊岳 Xiongyue，Liaoning HAP_2
31 软把 Ruanba 辽宁金州 Jinzhou，Liaoning HAP_2
32 绥中谢花甜 Suizhong Xiehuatian 辽宁绥中 Suizhong，Liaoning HAP_1
33 洋白小 Yangbaixiao 辽宁海城 Haicheng，Liaoning HAP_2
34 洋红宵 Yanghongxiao 辽宁建昌 Jianchang，Liaoning HAP_3
35 油红宵 Youhongxiao 辽宁建昌 Jianchang，Liaoning HAP_3
36 圆把 Yuanba 辽宁金州 Jinzhou，Liaoning HAP_2

37 猪嘴 Zhuzui 辽宁金州 Jinzhou，Liaoning HAP_3
砂梨 38 长十郎 Choujuurou 日本 Janpan HAP_3
P. pyrifolia（Burm. f.）Nakai 39 丰水 Housui 日本 Janpan HAP_3
40 江湾糖梨 Jiangwan Tangli 江西婺源 Wuyuan，Jiangxi HAP_3
41 小梅梨 Xiaomeili 浙江新昌 Xinchang，Zhejiang HAP_3
西洋梨（外类群） 42 巴梨 Bartlett 英国 England HAP_5
P. communis L.（Outgroup） 43 康佛伦斯 Conference 英国 England HAP_5
44 茄梨 Clapp`s Favorite 美国 America HAP_5

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表 3 37 个供试样本在 trnS-psbC、rbcL 和 trnL-trnF 中的变异位点
Table 3 The variations in trnS-psbC，rbcL and trnL-trnF regions among 37 accessions
区域
Domain
变异位点
Variation site
单倍型 1
HAP_1
单倍型 2
HAP_2
单倍型 3
HAP_3
单倍型 4
HAP_4
trnS-psbC 1 T A T T
2 G T T T
rbcL 3 G G G T
4 C C C A
5 A A A C
6 C C C A
trnL-trnF-487 7 T T T A
8 C C C A
9 A A A T
trnL-trnF-413 10 C C T C
11 A A A C
12 T T T G
13 1 0 0 1
14 0 1 1 1
注：0 和 1 分别表示相应 INDEL 为缺失或插入。A、T、C、G 为相应的碱基。
Note：0 and 1 indicate deletion and insertion for certain INDEL，respectively. A，T，C and G are bases，respectively.

2.2 叶绿体基因单个片段和合并片段的遗传多样性和单倍型信息
叶绿体通用引物 P02 和 P03 扩增叶绿体基因片段 trnL-trnF 时，该片段分成了两部分。P02
（trnL-trnF）、P03（trnL-trnF）、cp03（rbcL）和 P09（trnS-psbC）在所有样本中的序列长度范围分
别为 480 ~ 487 bp、403 ~ 413 bp、1 255 ~ 1 270 bp 和 1 498 ~ 1 518 bp，将各区域对位排列后，上述
片段的长度分别为 487、413、1 270 和 1 518 bp。非编码区 trnL-trnF-487 含 3 个核苷酸替换；非编
码区 trnL-trnF-413 多态性最高，包括 3 个核苷酸替换和 18 bp 的插入/缺失位点；rbcL 含 4 个核苷酸
替换；非编码区 trnS-psbC 多态性最低，仅有 2 核苷酸替换。4 个叶绿体基因片段合并后，序列长度
范围为 3 636 ~ 3 688 bp，对位排列后的长度为 3 688 bp，含有 9 个单一突变位点，3 个简约信息性
位点，18 bp 的插入/缺失位点。18 bp 的插入/缺失位点同时为多个样本所共有，因此也看作简约信
息性位点，纳入序列分析和单倍型统计。将上述插入/缺失看作是 2 个 INDEL，记为 INDEL-1 和
INDEL-2，分别为 8 bp 和 10 bp，均处理为一次突变事件，并编码为替换用于后续的分析中。
在 37 个样品中，非编码区 trnL-trnF-487、trnL-trnF-413 的变异位点分别是 7 ~ 9 位点、10 ~ 14
位点，单倍型分别为 2 个、4 个；rbcL 区域的变异位点为 3 ~ 6 位点，单倍型有 2 个；trnS-psbC 区
域的变异位点为 1、2 位点，单倍型有 3 个。
如表 4 和表 5 所示，平均核苷酸差异（k）最小和最大的区域分别为 trnL-trnF-487（k = 0.16216）
和 trnL-trnF-413（k = 0.95195）。叶绿体基因片段 trnL-trnF-413 除了有最多的单倍型（h = 4）外，还
有最高的核苷酸多样性（Pi = 0.00240）、最高的单倍型（基因）多样性（Hd = 0.577）、最高的单倍型
多样性方差（Vh = 0.00442）和最高的单倍型多样性标准差（Sh = 0.066）。而单倍型数（h = 2）最少
的叶绿体基因片段 rbcL，具有最低的核苷酸多样性（Pi = 0.00017）。trnL-trnF-487 和 rbcL 片段有最
低且相同的单倍型（基因）多样性（Hd = 0.054）、单倍型多样性方差（Vh = 0.00255）和单倍型多样
性标准差（Sh = 0.050）。合并之后的叶绿体基因片段，共有单倍型 4 个，核苷酸多样性（Pi）、平均
核苷酸差异（k）、单倍型（基因）多样性（Hd）、单倍型多样性方差（Vh）和单倍型多样性标准差（Sh）
分别为 0.00055、2.02402、0.577、0.00442 和 0.066。


7 期 常耀军等：基于叶绿体 DNA 分析的辽宁省梨属种质遗传多样性研究 1313

表 4 通过 DnaSP 软件获得的 37 个供试梨种质的 cpDNA 片段多态性信息
Table 4 The polymorphic information of cpDNA fragments of 37 pear accessions in this study by using DnaSP software
叶绿体 DNA 片段
cpDNA fragments
长度/
bp
Length
Vs
变异（多态性）位点
Variable
（polymorphic）sites
Ss
单一突变位点
Singleton
variable sites
Ps
简约信息性位点
Parsimony
informative sites
Is
插入/缺失位点
Insertion/
deletion gaps
Pi
核苷酸多样性
Nucleotide
diversity
k
平均核苷酸差异
Average number of
nucleotide differences
trnL-trnF-487 487 3（0.6%） 3（0.6%） 0 0 0.00033 0.16216
trnL-trnF-413 413 3（0.7%） 2（0.5%） 1（0.2%） 18（4.4%） 0.00240 0.95195
rbcL 1 270 4（0.3%） 4（0.3%） 0 0 0.00017 0.21622
trnS-psbC 1 518 2（0.1%） 0 2（0.1%） 0 0.00046 0.69369
合并 Combined 3 688 12（0.3%） 9（0.2%） 3（0.1%） 18（0.5%） 0.00055 2.02402
注：括号中数据表示变异位点或者插入/缺失位点数在总位点数中所占的比例。
Note：Data in the bracket indicate the proportions of the number of variable sites or insertion/deletion gaps to the number of all sites.

表 5 通过 DnaSP 软件获得的叶绿体 DNA 单倍型数和多样性数值
Table 5 Chloroplast DNA haploypes and the diversity by using DnaSP
扩增区域
Region
h
单倍型数
Number of
haplotypes
Hd
单倍型（基因）多样性
Haplotype（gene）
diversity
Vh
单倍型多样性方差
Variance of haplotype
diversity
Sh
单倍型多样性标准差
Standard deviation of
haplotype diversity
中性检验
Tajima’s D
test
trnL-trnF-487 2 0.054 0.00255 0.050 –1.72176
trnL-trnF-413 4 0.577 0.00442 0.066 –0.53169
rbcL 2 0.054 0.00255 0.050 –1.88391*
trnS-psbC 3 0.562 0.00373 0.061 0.86380
合并 Combined 4 0.577 0.00442 0.066 –1.26941
注：* 表示在 P < 0.05 水平上差异显著。
Note：* indicates statistical significance in P < 0.05.

2.3 Tajima’s D 检验
如表 5 所示，Tajima’s D 值只有在 trnS-psbC 片段中为正值（Tajima’s D = 0.86380），在其余片段
中均为负值。在所有为负值的叶绿体基因片段中，最低的 D 值（Tajima’s D =–1.88391）出现在 rbcL
中。就数据的显著性而言，除了 rbcL 区域的 D 值在 P < 0.05 水平上显著外，其余区域的 D 值均不
显著，说明除 rbcL 区域外，其余区域均遵循中性进化模型。
合并后的片段，Tajima’s D 值为–1.26941，在 P > 0.10 水平上不显著，说明合并后的片段遵循
中性进化模型。
2.4 基于 4 个叶绿体基因片段合并数据的单倍型间的中介网络图的构建
运用中介邻接网络（Median-Joining network，MJ）算法和最大简约（Maximum Parsimony
calculation，MP）算法分别计算和优化结果，构建辽宁省梨属种质 cpDNA 单倍型间的关联图（图 1）。
秋子梨小香水、自生 17、花盖和白梨绥中谢花甜的单倍型类型为 HAP_1；22 份种质的单倍型类型
为 HAP_2，其中秋子梨 15 份，白梨 7 份；14 份种质的单倍型类型为 HAP_3，包括 4 份秋子梨、6
份白梨以及来自其它地方的 4 份东方梨即小梅梨、江湾糖梨、丰水和长十郎；HAP_4 仅存在于六月
鲜中；外类群中的 3 份西洋梨共享 HAP_5 单倍型。
单倍型和中介矢量载体的名称分别表示为 HAP 和 mv。从图 1 中可以发现，HAP_4 和 HAP_5
位于中介网络图的躯干（torso）上，HAP_1 和 HAP_5、HAP_2 和 HAP_5 分别由 HAP_4 和 mv1 连
接。在变异位点上HAP_2 和 HAP_3 仅有两个差异，图 1 中显示 HAP_2 包含 HAP_3，HAP_1与 HAP_2
和 HAP_3 亲缘关系较远，HAP_5 与 HAP_1、HAP_2、HAP_3 的亲缘关系也较远。
1314 园 艺 学 报 41 卷

图 1 基于 4 个叶绿体基因片段合并数据分析的单倍型间的中介邻接网络图（Median-Joining network，MJ）
Fig. 1 Median-Joining network for cpDNA haplotypes in 44 pear accessions based on
four combined chloroplast DNA fragments
3 讨论
本研究中涉及的 cpDNA 区域有 trnL-trnF-487、trnL-trnF-413、trnS-psbC 和 rbcL。曾有研究表
明，梨的基因间隔区 accD-psaⅠ和 trnL-trnF 多态性最高（Kimura et al.，2003）。本研究中，非编码
区 trnL-trnF-413 也是 4 个叶绿体基因区域中最具多态性的区域，与前人的研究结果一致。
cpDNA 遗传属于母系遗传，没有或很少经历重组。叶绿体基因相当保守，突变类型主要表现
为点突变、碱基插入或缺失，进化速率平均每年每个位点约为 0.2 × 10-9 ~ 1.0 × 10-9，仅为核基因的
1/3（Badenes & Parfitt，1995；Demesure et al.，1996）。本研究中所采用的 cpDNA 片段，除了 rbcL
外，其余片段都符合中性进化模型（表 5），适合于遗传多样性研究。研究表明，梨的 cpDNA 的遗
传多样性比较低（Katayama & Uematsu，2003；Katayama et al.，2012）。与来自浙江省的豆梨（Hd =
0.719，Pi = 0.00105）的遗传多样性（Liu et al.，2012）相比，本研究所得到的辽宁省梨种质的遗传
多样性更低（Hd = 0.577，Pi = 0.00055）。究其原因，可能是 Liu 等（2012）采用了比 trnL-trnF 进
化更快的 accD-pasI 区域之故，而本研究中采用的片段中没有包含 accD-pasI。当然，野生种的遗传
多样性一般高于栽培类型。研究表明 accD-psaI 片段比 trnL-trnF 具有更快的进化速率，更适合应用
于种及种以下分类水平的梨属植物系统关系研究（胡春云 等，2011；Katayama et al.，2012）。
秋子梨和白梨品种均包含 HAP_1、HAP_2 和 HAP_3 单倍型，揭示了秋子梨和白梨在单倍型上
具有的多样性，暗示秋子梨和白梨品种演化中可能存在相互的基因渐渗。利用 DNA 标记，采用
UPGMA 法构建的梨种质系统发育树中一些秋子梨和白梨并没有独自形成各自的组（Teng et al.，
2002；Bao et al.，2007；曹玉芬 等，2007；张妤艳 等，2008；Bassil & Postman，2010），间接说明
了秋子梨和白梨具有一定的亲缘关系。
菊池秋雄（1946）认为中国白梨可能起源于秋子梨和砂梨的杂交，并将中国白梨命名在秋子梨
P. ussuriensis var. sinensis（Lindley）Kikuchi 名下。本研究中发现中国辽宁省的白梨、秋子梨共享
HAP_1、HAP_2 和 HAP_3，同时与中国浙江省和江西省的砂梨、以及日本梨共享单倍型 HAP_3，
反映了中国白梨、秋子梨和砂梨（日本梨）之间错综复杂的亲缘关系。Teng 等（2002）采用 RAPD
标记分析发现中国白梨与砂梨、日本梨与中国砂梨尤其是来自中国福建省和浙江省的中国砂梨遗传
背景相似，并且认为中国白梨、中国砂梨和日本梨系统可能起源于同一个祖先，即中国长江流域及
其以南野生的 P. pyrifolia。路娟等（2011）的研究也表明日本梨和中国砂梨表现出了高度的亲缘关
系。作为外类群的西洋梨单倍型为 HAP_5，与其他的东方梨种质的 cpDNA 序列均有较大差异，说
7 期 常耀军等：基于叶绿体 DNA 分析的辽宁省梨属种质遗传多样性研究 1315

明西洋梨和东方梨沿着两条不同的路线进化，亲缘关系较远。
综上所述，非编码区 trnL-trnF-413 是本研究中采用的 4 个叶绿体基因区域中最具多态性的区域；
4 个 cpDNA 片段和合并片段中，除 rbcL 区域外，其余区域均遵循中性模型；辽宁省梨种质的遗传
多样性较低，其白梨和秋子梨共享 cpDNA 单倍型，显示出一定的亲缘关系。

References
Badenes M L，Parfitt D E. 1995. Phylogenetic relationships of the cultivated Prunus species from an analysis of chloroplast DNA varation.
Theoretical and Applied Genetics，90：1035–1041.
Bao L，Chen K S，Zhang D，Cao Y F，Yamamoto T，Teng Y W. 2007. Genetic diversity and similarity of pear cultivars native to East Asia revealed
by SSR（simple sequence repeat）markers. Genetic Resources and Crop Evolution，54：959–971.
Bao L，Chen K S，Zhang D，Li X G，Teng Y W. 2008. An assessment of genetic variability and relationships within Asian pears based on AFLP
（Amplified Fragment Length Polymorphism）markers. Genetic Resources and Crop Evolution，116：374–380.
Bassil N，Postman J D. 2010. Identification of European and Asian pears using EST-SSRs from Pyrus. Genetic Resources and Crop Evolution，57：
357–370.
Cao Yu-fen，Liu Feng-zhi，Gao Yuan，Jiang Li-jie，Wang Kun，Ma Zhi-yong，Zhang Kai-chun. 2007. SSR analysis of genetic diversity of pear
cultivars. Acta Horticulturae Sinica，34 (2)：305–310. (in Chinese)
曹玉芬，刘凤之，高 源，姜立杰，王 昆，马智勇，张开春. 2007. 梨栽培品种 SSR 鉴定及遗传多样性. 园艺学报，34 (2)：305–310.
Demesure B，Comps B，Petit R J. 1996. Chloroplast DNA phylogeograph of the common beech（Fagus sylvatica L.）in Europe. Evolution，50：
2515–2520.
Demesure B，Sodzi N，Petit R J. 1995. A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and
chloroplast DNA in plants. Molecular Ecology，4：129–134.
Doyle J J，Doyle J L. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin，19：11–15.
Dumolin-Lapegue S，Pemonge M H，Petit R J. 1997. An enlarged set of consensus primers for the study of organelle DNA in plants. Molecular
Ecology，6：393–397.
Eiadthong W，Yonemori K，Sugiura A，Utsunomiya N，Subhadrabandhu S. 1999. Analysis of phylogenetic relationships in Mangifera by restriction
site analysis of an amplified region of cpDNA. Scientia Horticulturae，80：145–150.
Hu Chun-yun，Zheng Xiao-yan，Teng Yuan-wen. 2011. Characterization and phylogenetic utility of non-coding chloroplast regions trnL-trnF and
accD-psaI in Pyrus. Acta Horticulturae Sinica，38 (12)：2261–2272. (in Chinese)
胡春云，郑小艳，滕元文. 2011. 梨属叶绿体非编码区 trnL-trnF 和 accD-psaI 特征及其在系统发育研究中的应用价值. 园艺学报，38 (12)：
2261–2272.
Iketani H，Manabe T，Matsuta N，Akihama T，Hayashi Y. 1998. Incongruence between RFLPs of chloroplast DNA and morphological classification
in east Asian pear（Pyrus spp）. Genetic Resources and Crop Evolution，45：533–539.
Katayama H，Adachi S，Yamamoto T，Uematsu C. 2007. A wide range of genetic diversity in pear（Pyrus ussuriensis var. aromatica）genetic
resources from Iwate，Japan revealed by SSR and chloroplast DNA markers. Genetic Resources and Crop Evolution，54：1573–1585.
Katayama H，Ogihara Y. 1996. Phylogenetic affinities of the grasses to other monocots as revealed by molecular analysis of chloroplast DNA.
Current Genetics，20：527–581.
Katayama H，Tachibana M，Iketani H，Zhang S L，Uematsu C. 2012. Phylogenetic utility of structural alterations found in the chloroplast genome
of pear：Hypervariable regions in a highly conserved genome. Tree Genetics and Genomes，8：313–326.
Katayama H，Uematsu C. 2003. Comparative analysis of chloroplast DNA in Pyrus species：Physical map and gene localization. Theoretical and
Applied Genetics，106：303–310.
Kelchner S A，Clark L G. 1997. Molecular evolution and phylogenetic utility of the chloroplast rpl16 intron in Chusquea and the Bambusoideae
（Poaceae）. Molecular Phylogenetics and Evolution，8：385–397.
Kikuchi A. 1946. Assesment for Chinese pear species and cultivars. Collected Records for Horticultural Research，3：1–11. (in Japanese)
菊池秋雄. 1946. 支那梨の系統と品種の類別. 園研集錄，3：1–11.
1316 园 艺 学 报 41 卷
Kimura T，Iketani H，Kotobuki K，Matsuta N，Ban Y，Hayashi T，Yamamoto T. 2003. Genetic characterization of pear varieties revealed by
chloroplast DNA sequences. Journal of Horticultural Science and Biotechnology，78：241–247.
Librado P，Rozas J. 2009. DnaSP v5：A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics，25：1451–1452.
Liu J，Zheng X Y，Daniel P，Hu C Y，Teng Y. W 2012. Genetic diversity and population structure of Pyrus Calleryana（Rosaceae）in Zhejiang
Province，China. Biochemical Systematics and Ecology，45：69–78.
Lu Juan，Wu Jun，Zhang Shao-ling，Wu Hua-qing，Zhang Yu-yan. 2011. Genetic diversity and polygentic relationship among pears revealed by SSR
analysis. Journal of Nanjing Agricultural University，34 (2)：38–46. (in Chinese)　　
路 娟，吴 俊，张绍铃，吴华清，张妤艳. 2011. 不同系统梨种质遗传多样性与分类关系的 SSR 分析. 南京农业大学学报，34 (2)：
38–46.　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
Parani M，Lakshmi M，Ziegenhagen B，Fladung M，Senthilkumar P，Parida A. 2000. Molecular phylogeny of mangroves VII PCR-RFLP of
trnS-psbC and rbcL gene regions in 24 mangrove and mangrove-associate species. Theoretical and Applied Genetics，100：454–460.
Parducci L，Szmidt A E. 1999. PCR-RFLP analysis of cpDNA in the genus Abies. Theoretical and Applied Genetics，98：802–808.
Petit R，Kremar A，Wagner D. 1993. Geographic structure of chloroplast DNA polymorphisms in European oaks. Theoretical and Applied Genetics，
87：122–128.
Small R L，Ryburn J A，Cronn R C，Seelanan T，Wendel J F. 1998. The tortoise and the hare：Choosing between non-coding plastome and nuclear
ADH sequences for phylogeny reconstruction in recently diverged plant group. American Journal of Botany，85：1301–1345.
Taberlet P，Gielly L，Pauton G，Bouvet J. 1991. Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular
Biology，17：1105–1109.
Teng Y W，Tanabe K，Tamura F，Itai A. 2001. Genetic relationships of pear cultivars in Xinjiang，China as measublack by RAPD markers. Journal
of Horticultural Science and Biotechnology，76：771–779.
Teng Y W，Tanabe K，Tamura F，Itai A. 2002. Genetic relationships of Pyrus species and cultivars native to East Asia revealed by randomly amplified
polymorphic DNA markers. Journal of The American Society for Horticultural Science，127：262–270.
Wuyun T，Ma T，Uematsu C，Katayama H. 2013. A phylogenetic network of wild Ussurian pears（Pyrus ussuriensis Maxim.）in China revealed by
hypervariable regions of chloroplast DNA. Tree Genetics & Genomes，9：167–177.
Yamamoto T，Kimura T，Sawamura Y，Kotobuki K，Ban Y，Hayashi T，Matsuta N. 2001. SSRs isolated from apple can identify polymorphism
and genetic diversity in pear. Theoretical and Applied Genetics，102：865–870.
Yamamoto T，Kimura T，Sawamura Y，Manabe T，Kotobuki K，Hayashi T，Ban Y，Matsuta N. 2002a. Simple sequence repeats for genetic analysis
in pear. Euphytica，124：129–137.
Yamamoto T，Kimura T，Sawamura Y，Manabe T，Kotobuki K，Hayashi T，Ban Y，Matsuta N. 2002b. Genetic linkage maps constructed by using
an interspecific cross between Japanese and European pears. Theoretical and Applied Genetics，106：9–18.
Yao L H，Zheng X Y，Cai D Y，Gao Y，Wang K，Cao Y F，Teng Y W. 2010. Exploitation of Malus EST-NSSRs and the utility in evaluation of genetic
diversity in Malus and Pyrus. Genetic Resources and Crop Evolution，57：841–851.
Zhang Yu-yan，Wu Jun，Zhang Shao-ling. 2008. Genetic diversity of germplasm resources of Pyrus based on SSR marker. Journal of Agricultural
Biotechnology，16 (6)：983–989. (in Chinese)
张妤艳，吴 俊，张绍铃. 2008. 基于 SSR 标记的梨资源遗传多样性分析. 农业生物技术学报，16 (6)：983–989.