全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（5）：828–836 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–12–24；修回日期：2012–04–28
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-29-14）；国家自然科学基金项目（31101519）；高等学校省级优秀青年人才基
金项目（2012SQRL060ZD）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhuliwu@ahau.edu.cn）
‘砀山酥梨’褐皮芽变木质素含量及相关酶活性
与 CCoAOMT 表达量分析
李晓峰，李 雪，贾 兵，刘 莉，叶振风，衡 伟，朱立武*
（安徽农业大学果树学重点实验室，合肥 230036）
摘 要：为了探讨‘砀山酥梨’芽变品系‘锈酥’果皮褐色形成机理，采用分光光度法测定盛花后
25、50、75、100、125、150 和 175 d 果皮中木质素含量和相关酶活性变化；从构建的‘锈酥’正向 SSH-cDNA
文库中筛选出与木质素生物合成密切相关的 CCoAOMT-EST，通过实时荧光定量 PCR 测定了‘砀山酥梨’
和‘锈酥’果皮中 CCoAOMT 的相对表达量。结果表明：‘锈酥’果皮发育前期木质素增量较大，且木质
素增量累计比‘砀山酥梨’高 12.2%；‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮中 PAL、4CL、CAD 酶活性均在花后
75 d 达到最大值，而 POD 酶活性则在花后 125 d 出现高峰；二者果皮中 4 种酶活性变化趋势基本一致，
但‘锈酥’果皮中均相对较高；‘锈酥’果皮中的 PAL 和 4CL 酶活性与木质素增量变化均呈显著正相关，
而‘砀山酥梨’则未呈现出此规律；在果实生长发育各个时期，‘锈酥’果皮中 CCoAOMT 相对表达量均
高于‘砀山酥梨’。因此推测，‘锈酥’果皮褐色形成与果皮中木质素积累及相关酶活性提高有关，果皮
中 CCoAOMT 的增量表达是‘锈酥’果实褐皮形成的重要原因之一。
关键词：梨；果皮颜色；木质素；酶活性；CCoAOMT；荧光定量 PCR
中图分类号：S 661.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）05-0828-09

Analysis of Enzyme Activity and Lignin Content and Expression of
CCoAOMT Gene in the Pericarp of‘Dangshan Suli’and Its Russet Mutant
LI Xiao-feng，LI Xue，JIA Bing，LIU Li，YE Zhen-feng，HENG Wei，and ZHU Li-wu*
（Key Laboratory of Pomology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）
Abstract：To investigate the mechanism of russet skin formation in‘Xiusu’pear, the sport of Chinese
pear‘Dangshan Suli’（Pyrus bretshneideri Rehd.），the lignin content and activities of Phenylalanine
ammonia-lyase （PAL），4-hydroxycinnamate Co-A ligase（4CL），Cinnamyl alcohol dehydrogenase（CAD）
and Peroxidase（POD）related to lignin biosynthesis, in pericarp of‘Dangshan Suli’and‘Xiusu’pear at
25，50，75，100，125，150 and 175 days after full bloom were tested by spectrophotometry，respectively.
From the positive SSH-cDNA library of‘Xiusu’pear，CCoAOMT-EST was screened out and the relative
quantity of its expression was analysed by Real-time PCR. The results showed that there were three peaks
of lignin increment in the pericarp of‘Dangshan Suli’pear，and lignin accumulation was 12.2% higher in

5 期 李晓峰等：‘砀山酥梨’褐皮芽变木质素含量及相关酶活性与 CCoAOMT 表达量分析 829

‘Xiusu’than that in‘Dangshan Suli’pear when the fruit matured. The activities of PAL，4CL，CAD in
pericarps of‘Xiusu’and‘Dangshan Suli’pear all reached to the maximum at 75 days after full bloom，
which of POD attained the maximum at 125 days after full bloom. Although the trends of the four enzymes
dynamic change in‘Xiusu’were similar as those in‘Dangshan Suli’pear，their activities in the former
were higher than in the later. There was positive significant correlation between PAL or 4CL activities and
lignin increment in‘Xiusu’but not in‘Dangshan Suli’pear. As the fruit developed，the relative quantity
of CCoAOMT expression at each stage in the pericarp of‘Xiusu’was evidently higher than that of
‘Dangshan Suli’pear. It was postulated that the mechanism of russet skin formation in‘Xiusu’pear was
related to lignin accumulation and the relevant enzyme activity enhancement，and the expression increment
of CCoAOMT gene may be a key factor contributed to the russet skin formation of‘Xiusu’pear.
Key words：pear；fruit skin color；lignin；enzyme activity；CCoAOMT gene；Real-time PCR

梨属（Pyrus spp.）植物果皮颜色有底色（ground color）和着色（cover color）之分，底色有“黄
色”、“绿色”两种，着色有“褐色”和“红色”两类（曹玉芬，2001）。目前，有关红皮梨的皮色遗
传、皮色形成机制和调控机理研究较多（Fischer et al.，2007；Dondini et al.，2008；Du Preez & Rees，
2008；Volz et al.，2008；Pierantoni et al.，2009；Feng et al.，2010；Zhang et al.，2011），而有关梨
褐色果皮性状的遗传，虽有部分研究报道（沈德绪 等，1979；王宇霖 等，1991；Kim et al.，2005；
宋伟 等，2010），但结果差别较大。
Spencer（1965）研究认为，随着梨果实的成熟，果皮颜色由“绿色”向“黄绿色”变化，是果
皮中叶绿素降解、类胡萝卜素增加所致。张华云等（1996）研究发现，梨果皮褐色形成与木质素合
成关系密切，随着相关酶 PPO 和 POD 活性的降低，木质素合成量减少，果皮褐色明显降低。滕元
文等（2005）、Sugar 和 Basile（2008）研究认为，在一定的外部条件刺激下，果实表皮细胞老化、
坏死，果肉细胞增大不一致，使气孔保卫细胞破裂后形成的空洞内产生次生保护组织，导致细胞壁
增厚，外层细胞破损，进而形成果点，造成果皮木栓化，随着木栓化的积累就形成了果皮褐色。梨
幼果期是褐色形成的关键时期，该时期降雨量直接影响到梨果实表面果锈的覆盖面积（Sugar &
Basile，2008）。目前关于梨果皮褐色形成过程中各种酶活性变化规律以及与果皮中木质素含量之间
相关性的研究较少。
咖啡酰辅酶 A–O–甲基转移酶（Caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase，CCoAOMT）是木质素生
物合成苯丙酸途径中的一种关键酶，对 G 木质素合成特异调控（李潞滨 等，2007）。Meyermans 等
（2000）在抑制 CCoAOMT 表达的转基因杨树中发现木质素的含量降低了 12%，而 Zhong 等（1998）
获得了反义 CCoAOMT 表达的转基因烟草，木质素的含量下降了 36% ~ 37%。研究表明，CCoAOMT
的表达活性与木质素含量密切相关。
在安徽省砀山酥梨自然保护区资源考察中发现一株 50 年生的‘砀山酥梨’芽变，定名为‘锈
酥’。‘砀山酥梨’果皮黄绿，而变异品系‘锈酥’果皮表现褐色，经 AFLP、ISSR 分子标记初步研
究，确定为遗传性变异（Zhu et al.，2009；朱立武 等，2009）。
本试验中以‘砀山酥梨’和‘锈酥’为试材，测定二者不同时期果皮中木质素含量和相关酶活
性，分析酶活性与木质素之间的相关性；选择盛花后 100 d 的果实，切取表面刚刚出现褐色的果皮，
通过抑制性消减杂交（SSH）技术构建‘锈酥’正、反向 SSH-cDNA 文库。在正向 SSH-cDNA 文库
中筛选到木质素生物合成过程中关键酶基因 CCoAOMT，进而克隆其部分核苷酸序列，利用 SYBR
Green 实时荧光定量 PCR 手段研究 CCoAOMT 在‘砀山酥梨’和‘锈酥’不同时期果皮中的表达差
异，进一步探讨果皮褐色形成的机理。
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1 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为‘锈酥’（‘砀山酥梨’的褐皮芽变）不同发育时期的果实，样品取自安徽省砀山县
园艺场。2010 年分别在花后 25、50、75、100、125、150 和 175 d，从‘锈酥’树冠外围东、南、
西、北面及内膛枝条上随机摘取果实各 2 个，置入冰盒带回实验室，切取厚度为 0.5 ~ 1.0 mm 的果
皮，经液氮处理后混合均匀，保存于–80 ℃冰箱中备用。以‘砀山酥梨’为对照，单株小区，4 次
重复。
1.2 果皮木质素含量及其酶活性的测定
木质素测定参照林葵等（1996）的方法进行，通过木质素标准品（Sigma-Aldrich，USA）曲线
查得果皮中木质素含量，结果以鲜样质量百分比表示（%）。应用 SPSS 软件进行差异显著性分析，
并进行相关性分析。
苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性的测定参照薛应龙（1980）的方法，
以每分钟在 290 nm 处吸光度变化 0.01 所需酶量为一个酶活性单位；4–香豆酸辅酶 A 连接酶
（4-hydroxycinnamate co-A ligase，4CL）活性的测定参照毕咏梅和欧阳光察（1990）的方法，以变
化 0.0001 OD 值为一个酶活性单位；肉桂醇脱氢酶（Cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）活性的
测定参照 Goffner 等（1992）的方法进行，以 1 min 变化 0.001 吸光值为一个酶活性单位；过氧化物
酶（Peroxidase，POD）活性的测定采用愈创木酚法（王学奎，2006），以每分钟 A470 变化 0.01 为一
个酶活性单位。
1.3 RNA 提取与 SSH-cDNA 文库构建
采用改良的 CTAB 法提取盛花后 100 d 的‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮总 RNA（张志良和瞿伟
菁，2003），DNAⅠ消化后保存于–80 ℃备用。
采用抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）方法（Liu et al.，2009），构建
正、反向 SSH-cDNA 文库，从中筛选出与木质素生物合成密切相关的表达序列探针（expression
sequence tags，ESTs）。
1. 4 CCoAOMT 3′端序列获得与实时荧光定量 RT-PCR 分析
根据已知的 CCoAOMT 的一段中间序列设计特异引物（表 1）；参照 SMARTerTM RACE cDNA
Amplification Kit User Manual 试剂盒说明书步骤，以 3′-CDS 为接头（表 1），反转录得到 cDNA 后
进行 3′端 PCR 的扩增。反应程序 94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，60 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 3 min，
32 个循环后，将 PCR 产物稀释 10 倍作为第二轮扩增模板，将引物 UPM 换为 NUP，PCR 反应体系
程序同上。将得到的目的片段经回收、连接和阳性克隆筛选，送交上海生工生物技术有限公司测序。
根据 CCoAOMT 基因的 3′端序列，设计荧光引物 ygCCoAOMT-PF 和 yg CCoAOMT-PR（表 1），
GAPDH 作为内参扩增引物，以盛花后 75、100、125、150 和 175 d‘砀山酥梨’和‘锈酥’的果皮
为试样，进行 Real-time PCR 扩增。
反应体系按 TaKaRa SYBR Premix EX Taq 试剂盒步骤进行操作。反应采用两步法，在 AB Step
One 实时荧光 PCR 仪上进行，95 ℃预变性 90 s，95 ℃变性 30 s，60.6 ℃退火和延伸 40 s，40 个
循环，在 60.6 ℃进行荧光信号采集，反应结束后生成融解曲线。样品各设 4 个重复，分别对应一
个内参，以 ROX 作为荧光校正，使用 2-△△CT法进行相对定量的测定。
5 期 李晓峰等：‘砀山酥梨’褐皮芽变木质素含量及相关酶活性与 CCoAOMT 表达量分析 831

表 1 PCR 扩增所需要的引物及其序列
Table 1 PCR amplification required primers and sequences
引物名称
Name of primer
引物序列（5′ to 3′）
Sequence of primer
3′-CDS AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30 VN
UPM Long CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
UPM Short CTAATACGACTCACTATAGGGC
NUP AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
CCoAOMT GTCTACACTGGCTACTCCCTCCTT
ygCCoAOMT-PF CAAATGAACCACCAACCCTAATTG
ygCCoAOMT-PR GAACCATCCAAATACAAATACAAAGTAG
2 结果与分析
2.1 ‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮中木质素含量比较
盛花后各个时期，‘锈酥’果皮中木质素含量均显著高于‘砀山酥梨’（图 1，Ⅰ）。以某个时期
木质素含量减去前一时期木质素含量，差值称为木质素增量。随着果实的发育，‘锈酥’果皮木质素
增量在前期逐渐增加，后期回落；而‘砀山酥梨’果皮中木质素增量则交替出现 3 次高峰。花后
75 ~ 125 d 之间，即 6 月中旬到 8 月上旬，是‘锈酥’果皮褐色产生的关键时期，其木质素增量也
均明显高于‘砀山酥梨’（图 1，Ⅱ）。果实整个生长发育过程中，‘锈酥’果皮中的木质素增量累计
比‘砀山酥梨’高 12.2%，这可能是‘锈酥’果皮褐色产生的原因之一。

图 1 ‘砀山酥梨’与其芽变品系‘锈酥’果皮中木质素含量（Ⅰ）及其增量（Ⅱ）
不同小写字母表示差异达到显著水平（P ≤ 0.05）；不同大写字母表示差异达到极显著水平（P ≤ 0.01）。下同。
Fig. 1 Lignin content in the pericarp of‘Dangshansuli’and its russet mutant‘Xiusu’
Different lower case letter indicates significant difference at P ≤ 0.05 level；Different capital letter indicates extremely
significant difference at P ≤ 0.01. The same below.
2.2 ‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮中酶活性比较
2.2.1 果皮中 PAL酶活性的变化
‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮中 PAL 酶活性均呈先平稳上升，后急剧下降的趋势。除盛花后
150 d 之外，‘锈酥’的 PAL 酶活性都高于‘砀山酥梨’（图 2）。
2.2.2 果皮中 4CL酶活性的变化
在花后 25 ~ 75 d，‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮中 4CL 酶活性上升趋势明显，花后 75 d 达到最
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图 2 ‘砀山酥梨’与其芽变品系‘锈酥’果皮中 PAL 酶活性
Fig. 2 PAL enzyme activity in the pericarp of
‘Dangshan Suli’and its russet mutant‘Xiusu’
图 3 ‘砀山酥梨’与其芽变品系‘锈酥’果皮中 4CL 酶活性
Fig. 3 4CL enzyme activity in the pericarp of
‘Dangshan Suli’and its russet mutant‘Xiusu’
图 4 ‘砀山酥梨’其芽变品系‘锈酥’果皮中 CAD 酶活性
Fig. 4 CAD enzyme activity in the pericarp of
‘Dangshan Suli’and its russet mutant‘Xiusu’
图 5 ‘砀山酥梨’与其芽变品系‘锈酥’果皮中 POD 酶活性
Fig. 5 POD enzyme activity in the pericarp of
‘Dangshan Suli’and its russet mutant‘Xiusu’
大值，随后急剧下降。在盛花后 50 ~ 100 d，‘锈酥’果皮中 4CL 酶活性高于‘砀山酥梨’（图 3）。


2.2.3 果皮中 CAD酶活性的变化
随着幼果的生长发育，‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮中 CAD 酶活性急剧升高，在花后 75 d 达到
最大值，随后逐渐下降，两者变化趋势几乎一致。除花后 25 和 125 d 外，‘锈酥’果皮中 CAD 酶活
性均高于‘砀山酥梨’（图 4）。
2.2.4 果皮中 POD酶活性的变化
‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮中 POD 酶活性，在花后 25 ~ 125 d 处于较高水平后，急剧下降。
在花后 50 ~ 125 d，‘锈酥’果皮中 POD 酶活性明显高于‘砀山酥梨’（图 5）。



2.3 木质素增量与不同酶活性之间相关性分析
相关分析结果显示，‘锈酥’果皮木质素增量分别与 PAL 酶、4CL 酶活性呈显著正相关；且
PAL 与 4CL 酶活性呈显著正相关，4CL 酶活性与 CAD 酶活性呈极显著正相关。‘砀山酥梨’果皮
5 期 李晓峰等：‘砀山酥梨’褐皮芽变木质素含量及相关酶活性与 CCoAOMT 表达量分析 833

中除 4CL 酶和 CAD 酶活性呈极显著正相关外，其余各性状之间相关性均未达到显著水平（表 2）。

表 2 ‘砀山酥梨’和‘锈酥’果皮中木质素增量与酶活性相关性分析
Table 2 The correlation analysis between enzyme activities and increment of lignin in the
pericarp of‘Dangshan Suli’and‘Xiusu’
指标
Item
木质素
Lignin
苯丙氨酸解氨酶
PAL
4–香豆酸辅酶 A 连接酶
4CL
肉桂醇脱氢酶
CAD
过氧化物酶
POD
木质素 Lignin 0.1816 0.2544 0.2178 0.2507
苯丙氨酸解氨酶 PAL 0.7961* 0.7198 0.7514 0.1818
4–香豆酸辅酶 A 连接酶 4CL 0.7622* 0.7995* 0.9144** 0.1032
肉桂醇脱氢酶 CAD 0.7047 0.6957 0.9771** 0.4478
过氧化物酶 POD 0.3129 0.2918 0.3903 0.3924
注：**表示极显著相关；*表示显著相关。对角线右上角数据为‘砀山酥梨’；左下角数据为‘锈酥’。
Note：** mean extremely significant differences at 1% level；* mean extremely significant differences at 5% level. The data of‘Dangshan Suli’
is in the upper right of the diagonal line，and that of‘Xiusu’is in the lower left of the diagonal line.

2.4 CCoAOMT 基因 3′端克隆及其 Real-time PCR 检测
在‘锈酥’正向 SSH-cDNA 文库中筛选出了 CCoAOMT-EST。通过 3′-RACE 进一步获取其基因
3′端核苷酸序列，长度为 746 bp。经过 NCBI Blast 比对，确定为 CCoAOMT 基因 3′端核苷酸序列（图
6）。


图 6 ‘锈酥’CCoAOMT基因3′端核苷酸序列
Fig. 6 The 3-end sequences of CCoAOMT gene in‘Xiusu’pear
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在果实生长发育各个时期，‘锈酥’、‘砀山酥梨’果皮中 CCoAOMT 基因均有表达，‘锈酥’相
对表达量均高于‘砀山酥梨’（图 7），说明该基因的增量表达是‘锈酥’褐皮形成的重要因子之一。

图 7 ‘砀山酥梨’与其芽变品系‘锈酥’果皮CCoAOMT基因相对表达量
Fig. 7 CCoAOMT relative expression quantity in the pericarp of‘Dangshan Suli’and
its russet mutant‘Xiusu’
3 讨论
3.1 木质素与相关酶在‘锈酥’果皮褐色形成中的作用
在果实生长发育过程中，除个别时期外，‘锈酥’果皮中 PAL、4CL、CAD 以及 POD 酶活性均
高于‘砀山酥梨’。说明无论在木质素合成特异途径，还是木质素单体合成阶段，‘锈酥’果皮中酶
催化木质素相关反应的能力总体高于‘砀山酥梨’；‘锈酥’果皮中的木质素增量累计，也比‘砀山
酥梨’提高 12.2%。但相关分析结果显示，‘锈酥’果皮木质素增量仅分别与 PAL 酶、4CL 酶活性
呈显著正相关；而‘砀山酥梨’果皮中相关酶活性与木质素增量变化的相关性并未达到显著水平。
虽然梨果褐皮形成与木质素合成有关，但木质素合成关键酶 PAL、4CL、CAD、POD 的活性与木质
素增量的相关关系分析，并未在‘砀山酥梨’、‘锈酥’中表现出相应一致的规律性，说明‘锈酥’
果实褐皮形成机制较复杂。由于木质素生物合成过程步骤繁多、影响因素复杂，故‘砀山酥梨’木
质素的增量变化趋势与‘锈酥’不同，同时也不能将‘砀山酥梨’、‘锈酥’果皮中木质素含量与酶
活性变化归纳为简单的线性关系，其中是否存在其他酶类或者非酶类物质的参与和调节，需要进一
步研究。
在‘锈酥’果皮褐色形成的关键时期，除了果皮木质素含量增加，其表皮层虽没有形成木栓层，
但细胞木栓化程度较高（衡伟 等，2011）。因此，木质素积累可能只是影响‘锈酥’果皮褐色产生
的诸多原因之一。
3.2 CCoAOMT 基因表达与木质素生物合成关系
植物中木质素主要有 3 种单体合成，其结构差异主要在于甲基化程度，而 CCoAOMT 催化咖啡
酰辅酶 A 进行甲基化反应（Meyermans et al.，2000）。抑制 CCoAOMT 表达，会使植物中木质素含
量普遍降低，并伴随组分的改变（Li et al.，2000）。虽然‘锈酥’各个时期果皮中 CCoAOMT 基因
的相对表达量均显著高于‘砀山酥梨’，但在花后 50 和 150 d，‘砀山酥梨’果皮中木质素增量却显
著高于‘锈酥’，两者变化并不一致，表明‘砀山酥梨’果皮中木质素生物合成过程中还存在其它阶
5 期 李晓峰等：‘砀山酥梨’褐皮芽变木质素含量及相关酶活性与 CCoAOMT 表达量分析 835

段性促进因子，均有待于进一步验证。
许多研究表明，基因及其表达的中间产物 mRNA 水平，并不能代表蛋白质（基因表达产物）水
平的研究，虽然 mRNA 与表达的蛋白质存在相关性，但其相关程度并不高，相关系数常低于 0.5
（Anderson & Seilhamer，1997；Gygi et al.，1999）。对‘砀山酥梨’和‘锈酥’正、反向 SSH-cDNA
文库 ESTs 初步分析发现，‘锈酥’果皮褐色产生还与几丁质、阿拉伯多糖、果胶等物质有关。‘锈
酥’果皮褐色的形成机制，尚需从蛋白质组学、代谢组学角度继续深入研究。

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