全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（10）：1975–1982 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–05–07；修回日期：2012–07–03
基金项目：国家自然科学基金项目（31000920，30900991）；农业部园艺作物遗传改良重点开放实验室项目
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：xuejingqi@gmail.com）
月季 RhRTE1 的克隆及其对乙烯响应特性分析
孙翠慧 1，刘道凤 1，张 帅 1，李 娜 1，马 男 1，薛璟祺 2,*，高俊平 1
（1 中国农业大学观赏园艺与园林系，北京 100193；2中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）
摘 要：利用数据库中已发表的拟南芥 AtRTE1 基因序列，从构建的月季花朵乙烯响应 EST 数据库中
筛选得到一个 RTE1 同源片段，结合 RACE 技术，从月季切花品种‘Samantha’花瓣中克隆得到全长为
1 233 bp 的 RTE1 同源基因。该基因包含一个 732 bp 的开放阅读框、339 bp 的 5′非翻译区和 162 bp 的 3′
非翻译区，编码一个 243 aa 的肽链，其理论分子量为 27.6 kD，等电点为 6.87。该基因推定的氨基酸序列
与拟南芥 AtRTE1 同源性较高，属于 RTE 家族中的第 1 组别基因，命名为 RhRTE1。该基因在月季花朵自
然开放中表达逐步增强，并能够被外源乙烯和切伤处理所显著诱导。将 35S::GFP-RhRTE1 融合蛋白转入
拟南芥，发现 RhRTE1 蛋白主要定位于细胞膜上，并且转化植株降低了对乙烯的敏感性。以上结果说明
RhRTE1 可能参与了乙烯介导的月季花朵开放过程，并可能参与了花朵响应伤害的修复过程。
关键词：月季；花朵开放；乙烯；RTE；基因表达；功能验证
中图分类号：S 685.12 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2012）10-1975-08

Isolation of RhTRE1 and Its Expression in Response to Ethylene During
Flower Opening of Roses
SUN Cui-hui1，LIU Dao-feng1，ZHANG Shuai1，LI Na1，MA Nan1，XUE Jing-qi2,*，and GAO Jun-ping1
（1Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture，China Agricultural University，Beijing 100193，
China；2Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）
Abstract：A homologous fragment with RTE1 was obtained through screening the rose EST
database，then the full length（1 233 bp）of this gene was cloned from rose petals. This gene contained a
732 bp open reading frame，a 339 bp 5′ untranslated region，and a 162 bp 3′ untranslated region. The
predicted protein consisted of 243 amino acids，had a calculated molecular mass of 27.6 kD，and its
isoelectric point is 6.87. This gene shared high identity with AtRTE1 in Arabidopsis，and it belonged to
group one in RTE gene families，so it was named as RhRTE1. The expression of RhRTE1 enhanced
gradually during the flower opening process，and it could also be induced by ethylene and wounding
treatments. Through transferring 35S::GFP-RhRTE1 fusion protein into Arabidopsis，we found that
RhRTE1 was located on the cell membranes，and over expression of RhRTE1 reduced the ethylene
sensitivity of Arabidopsis. The results above indicated that RhRTE1 may be involved in ethylene regulated
flower opening and damage recovery in rose flowers.



1976 园 艺 学 报 39 卷
Key words：rose；Rosa hybrida；flower opening；ethylene；RTE；gene expression；functional
verification

在月季切花运输及销售过程中，由于乙烯导致的花朵不能正常开放，常造成巨大的经济损失。
研究表明，绝大多数月季品种都对乙烯敏感（高俊平 等，1997），外源乙烯处理能够促进花朵的开
放和衰老（蔡蕾 等，2002；Tan et al.，2006）。在转录水平上，这种调控作用可能主要通过调节乙
烯受体表达实现（Ma et al.，2006；Xue et al.，2008）。
在拟南芥中，经典的乙烯信号转导途径可简述为：乙烯信号最先被乙烯受体 ETR 感受，然后经
CTR1、EIN2、EIN3、ERF1 等一系列转导元件转入核内，最终调控相关蛋白表达（Guo & Ecker，
2004；Chen et al.，2005）。随着研究的深入，新的元件陆续被发现并证明其功能，如 RAN1、ERF
等（Chen et al.，2005），这些内容不断完善着乙烯信号转导的机理研究。
近年来，在乙烯信号转导途径中又发现了一个新的成员，RTE1（REVERSION-TO-ETHYLENE
SENSITIVITY1），该基因处于乙烯受体的上游，是拟南芥乙烯响应的负调控因子，可以在一定程度
上降低植物对乙烯的敏感性（Resnick et al.，2006；Dong et al.，2008）。在此后的研究中，RTE1 同
源基因从不同物种中被克隆出来，如番茄和马铃薯（Barry & Giovannoni，2006）、香石竹（Yu et al.，
2011）等。这些研究为明确乙烯作用机理提供了新的证据。
本研究从笔者构建的月季花朵乙烯响应 EST 数据库中筛选到一个 RET1 同源片段，结合 RACE
技术，从月季花瓣中克隆得到了该基因全长，命名为 RhRTE1，并在转录水平研究了该基因对乙烯
的响应模式。利用重叠延伸 PCR 技术，构建了 35S::GFP-RhRTE1 表达载体，并转入拟南芥，在研
究其亚细胞定位的同时，利用拟南芥的“三重反应”现象验证了 RhRTE1 的功能。这些结果可为进
一步明确乙烯对月季花朵开放的调控机理，进而为提出更好的月季切花采后保鲜方法提供一个新的
途径。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于 2009 年 5 月至 2011 年 10 月在中国农业大学完成。供试材料月季（Rosa hybrida）切花
品种‘Samantha’，采自北京市昌平区野生花卉生产基地。将 1 ~ 6 级开花级数（Ma et al.，2005）
的花材采收后立即插于自来水中，并于 1 h 内运回实验室。将茎杆置于水下按照花枝长 25 cm，留 3
复叶的标准修剪，置于去离子水中复水 1 h。
不同开花级数花材复水后将花瓣取下，立即用液氮冷冻，存于–80 ℃冰箱保存备用。
乙烯处理：所用花材均在 2 级采收，将花枝插于去离子水中，放置于密封箱中用 10 μL · L-1乙
烯分别处理 3、6、12、18 和 24 h。对照组的花枝插入去离子水中，置于相同体积密封箱内，在相
同时间点取样。为防止 CO2 积累，箱内还同时置入 1 mol · L-1 NaOH 溶液。每处理选用 40 枝花材。
切伤处理：所用花材均在 2 级采收，取花朵中层的 5 ~ 6 片花瓣，将其剪碎并放置于培养皿中
湿滤纸上，分别于 3、6、12、18 和 24 h 后取样。对照组是完整的花瓣取下，放置于相同条件培养
皿中，保持花瓣基部与滤纸接触，取样时间点同上。每处理选用 40 枝花材。
乙烯和切伤处理在各处理时间点结束后，立即取样，用液氮冷冻后存于–80 ℃冰箱保存备用。
瓶插室环境条件为：温度 23 ~ 25 ˚C，相对湿度 30% ~ 40%，光强 40 µmol · m-2 · s-1。
10 期 孙翠慧等：月季 RhRTE1 的克隆及其对乙烯响应特性分析 1977

1.2 总 RNA 的提取与 RhRTE1 全长克隆
花瓣内总 RNA 的提取采用本实验室改良的 Hot borate 法（Wan & Wilkins，1994）。提取的总 RNA
按 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）试剂盒说明书，合成 cDNA，利用数据库中
已有的月季 EST 序列设计引物，利用 cDNA 末端快速扩增（RACE）技术对该 cDNA 进行 PCR 扩
增（表 1）。扩增产物插入 pGEM T-Easy 载体（Promega）后，转化大肠杆菌 DH5，鉴定阳性克隆后
送北京三博远志生物技术有限公司测序。测序结果和序列分析等利用 DNAMAN5.2.2（LynnonBiosoft）、
NCBI BLAST（http：// www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST）、MEGA 4.0（Tamura et al.，2007）等软件
进行。序列经分析、拼接后，设计特异引物（表 1）获得 RhRTE1 基因全长。

表 1 GFP-RhRTE1 重叠延伸 PCR 所用引物
Table 1 Primers used for overlap PCR of GFP-RhRTE1
引物名称
Primer
name
引物序列
Primer sequence

引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence
5′-RACE
inner
5′-TCAAGACAGACATGGCATCAAC-3′ RhRTE1 up 5′-ATGCATCATAGTAGACTTCCTG-3′
5′-RACE
outer
5′-CCGTAGCATATCCGATTCAGAAAG-3′ RhRTE1 down 5′-CCAACATTGCAGCAGGAACT-3′
3′-RACE
inner
5′-CACCTGGGATGATGCCTTGC-3′ GFP（overlap）
up
5′-TCATCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGAG-3′
3′-RACE
outer
5′-TGAGCACAAGACCTACAACCT-3′ GFP（overlap）
down
5′-ACTATGATGCATCTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′
RhRTE1
FL up
5′-TCCTCACAATTAAGTACCGACCT-3′ RhRTE1（overlap）
up
5′-GAGCTGTACAAGATGCATCATAGTAGACTTCCTG-3′
RhRTE1
FL down
5′-GAATCCAACATTGCAGCAGG-3′ RhRTE1（overlap）
down
5′-GTGAGCTCCCAACATTGCAGCAGGAACT-3′
GFP up 5′-ATGGTGAGCAAGGGCGAG-3′
GFP down 5′-CTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′

1.3 RT-PCR 分析
不同花瓣样品总 RNA 提取后，利用 Powerscript reverse transcriptase（Clontech）反转录成 cDNA，
再根据 RhRTE1 基因全长序列，选取非保守区设计特异引物，用于半定量 RT-PCR 分析。PCR 引物
序列为 Up：5′-TGGTTGGCACCTTTCATTG-3′；Down：5′-AGAGGAGGGAAGAGAAGCAG-3′，扩
增条件：94 ℃预变性 5 min，然后 94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，28 个循环，最
后 72 ℃延伸 8 min。同时选取 Actin5 作为 RT-PCR 内标，Up：5′-CCATGAGACCACATACAATTCG-3′；
Down：5′-CAGCAGTAAGCCTACAAGGTCATA-3′，扩增条件：94 ℃预变性 5 min，然后 94 ℃变性
30 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，27 个循环，最后 72 ℃延伸 8 min。PCR 产物经 1.2%的琼脂
糖凝胶进行分离后用 GoldViewTM 染料染色观察，同时条带用 AlphaEaseFCTM 2200（Alpha Innotech，
Version 3.2.1）软件量化。每个时间点样本均设 3 次生物学重复。
1.4 RhRTE1 过表达载体的构建与拟南芥转化
用重叠延伸 PCR（Ho et al.，1989）的方法，获得 N 端连接 GFP 的 RhRTE1 融合片段，片段两
端分别加入 XbaⅠ和 SacⅠ酶切位点（表 1）。将回收后的融合片段与过表达载体 pCAMBIA super 1300
分别进行 XbaⅠ和 SacⅠ双酶切，片段回收，连接。将连接产物热击转化大肠杆菌 DH5α，PCR 鉴定
和双酶切鉴定后，将阳性重组质粒转化农杆菌 GV3101，最后用携带有 RhRTE1-Super 1300 质粒的农
1978 园 艺 学 报 39 卷
杆菌菌液对拟南芥 Col-0 进行花序侵染（Clough & Bent，1998）。
1.5 RhRTE1 转基因拟南芥的筛选与表型分析
收获转化植株的 T0 代种子，消毒后播种于含有 30 μg · mL-1 潮霉素的 MS 培养基上进行筛选，2
周后将阳性植株移入营养土中生长，野生型植株的播种时期及生长条件与转化植株一致。待收获种
子后按照相同的方法再次筛选，得到 T1 代转基因拟南芥种子。将 T1 代种子播种在培养皿上，待长
出 2 片真叶时在荧光显微镜下检测，筛选 GFP 表达量高的植株移栽到营养土中进行后续试验。
将野生型和 T1 代转基因拟南芥种子播于含有（或不含）100 μmol · L-1 ACC 的 MS 固体培养基
中，于 4 ℃春化处理 3 d。然后将平板直立于 22 ℃黑暗条件下的恒温培养箱中，处理 3 d 后每处理
随机选择 10 株测定下胚轴长度。
1.6 RhRTE1 的细胞定位
将上述 T1 代拟南芥种子播种于含有 30 μg · mL-1 潮霉素的 MS 培养基上正常生长。待长出 2 片
真叶后，将拟南芥从培养基中轻轻移出，选择其根部在 OLYMPUS 荧光显微镜下观察荧光信号。
2 结果与分析
2.1 RhRTE1 的克隆与序列分析
通过拟南芥 AtRTE1 序列以及笔者先前构建的月季 EST 序列，利用 RACE 的方法，在月季花瓣
中克隆得到了一个 AtRTE1 同源基因。该基因全长为 1 233 bp，包含一个 732 bp 的开放阅读框、339
bp 的 5′非翻译区和 162 bp 的 3′非翻译区。编码一个 243 aa 的肽链，其理论分子量为 27.6 kD，等电
点为 6.87。通过同源性比较，发现该基因编码的蛋白与香石竹中 DcRTE1 以及拟南芥中 AtRTE1 同
源性分别达到了 63.9%和 63.0%（图 1）。因此，该基因命名为 RhRTE1。
















图 1 月季 RhRTE1 与其他植物 RTE 蛋白序列比对
双向箭头标示了预测的 RhRTE1 的 3 个跨膜区域。
10 期 孙翠慧等：月季 RhRTE1 的克隆及其对乙烯响应特性分析 1979

Fig. 1 Comparison of amino acid sequences between RhRTE1 and other plant RTE proteins
The two-way arrows indicate three predicated transmembrane domains of RhRTE1.
通过 TMpred（Hofmann & Stoffel，1993）软件分析，发现 RhRTE1 编码蛋白存在 3 个可能的跨
膜结构，其中 1 个靠近 N 端，另外 2 个靠近 C 端（图 1）。利用系统进化树进一步分析发现，该编
码蛋白属于 RTE 家族中第一组别（Group 1）基因（图 2）。














图 2 月季 RhRTE1 与其他同源蛋白系统发育树分析
Fig. 2 Phylogenetic tree of RhRTE1 and other RTEs

2.2 RhRTE1 在月季花朵自然开放过程中的表达
为了明确月季花朵自然开放与 RhRTE1 表达的关系，本研究中测定了 1 ~ 6 级开放状态下花瓣
中 RhRTE1 的表达量。结果表明，在从花苞到初开阶段（1 ~ 3 级），花瓣中 RhRTE1 仅有较低水平
的表达，在接近完全开放时（4 级）至完全开放状态中（5 ~ 6 级）表达量增强，在开花级数为 5 级
时表达量达到到了初始时的 1.52 倍（图 3）。








图 3 RhRTE1 在月季切花不同开花级数花瓣中的表达（左）及相对表达量（右）
Fig. 3 Expression（left）and normalization（right）of RhRTE1 in rose petals with different flower opening stage

2.3 RhRTE1 对乙烯处理及伤处理的响应
施用外源乙烯或切伤处理均可诱导月季切花花瓣中内源乙烯的生物合成（Ma et al.，2005；Xue
et al.，2008）。鉴于此，对月季切花进行了 10 μL · L-1 的乙烯处理，明确 RhRET1 对外源乙烯的响应
1980 园 艺 学 报 39 卷
模式。结果如图 4 所示，在自然瓶插条件下，RhRTE1 表达总体较低；乙烯处理诱导了 RhRTE1 的
表达，处理 3 h 就表现出明显的诱导现象，并随处理时间持续增强；12 h 达到峰值，为对照相应时
间点的 1.93 倍。之后略有降低，但仍为对照的 1.5 倍左右。
切伤处理月季花瓣，12 h 内 RhRTE1 表达未出现明显变化，然后表达量明显增强，到 24 h 时为
对照相应时间点的 1.85 倍（图 5）。


图 4 乙烯处理对月季花瓣中 RhRTE1 表达的影响
Fig. 4 Effect of ethylene treatment on the expression of RhRTE1 in rose petals


图 5 切伤处理对月季花瓣中 RhRTE1 表达的影响
Fig. 5 Effect of wounding on the expression of RhRTE1 in rose petals

2.4 RhRTE1 在拟南芥中的细胞定位
为了明确 RhRTE1 的细胞定位，本研究中构建了 35S::GFP-RhRTE1 表达载体，并将该载体转入
拟南芥中，同时以野生型和仅含有 35S::GFP 序列的转基因拟南芥作为对照。利用荧光显微镜，在
野生型拟南芥根中未检测到任何荧光信号（图 6，A），转 35S::GFP 植株在整个根部均有较强的荧
光信号（图 6，B），而转入 35S::GFP-RhRTE1 的拟南芥植株则主要在细胞膜上检测到了荧光信号（图
6，C、D）。这些结果说明 RhRTE1 定位于细胞膜上。
2.5 RhRTE1 在拟南芥中的表型分析
利用上述拟南芥植株，本研究中测定了不同转基因株系幼苗乙烯“三重反应”（即抑制茎的伸
长、促进茎或根的增粗、使茎横向生长）表型变化。结果表明，在正常暗处理条件下，3 个株系的
拟南芥幼苗均表现出黄化苗的状态，不同株系之间无显著差异；当在培养基中施用 100 μmol · L-1
ACC 时，野生型拟南芥和转 35S::GFP 拟南芥株系均表现出明显的“三重反应”现象，转 35S::GFP-
RhRTE1 株系也表现出一定的“三重反应”现象，但其下胚轴缩短的程度与前两个株系之间存在显
著差异，表明 RhRTE1 可以有效降低拟南芥对乙烯的敏感性（图 7）。以上这些结果证明 RhRTE1 具
10 期 孙翠慧等：月季 RhRTE1 的克隆及其对乙烯响应特性分析 1981

图 6 RhRTE1 在转基因拟南芥中的细胞定位
A. 野生型；B. 转入 35S::GFP 表达载体；C、D. 转入
35S::GFP-RhRTE1 表达载体。
Fig. 6 Cellular localization of RhRTE1 in transgenic Arabidopsis
A. WT；B. Transgenic lines with 35S::GFP；C，D. Transgenic lines
with 35S::GFP-RhRTE1.
图 7 拟南芥转基因幼苗对乙烯响应的表型观察
Fig. 7 phenotypic observation of various transgenic Arabidopsis
seedlings responded to ethylene
有“逆转”乙烯作用的功能。


3 讨论
在拟南芥中，etr1 和 rte1 的双缺失型突变体与 etr1 和 rte1 的单突变表形完全一致，说明这两个
基因处于同一乙烯调控途径上。进一步的研究发现，rte1 不能有效抑制功能获得型突变体 etr1-1 的
效果，表明 RTE1 可能在 ETR1 的上游起作用。乙烯处理可以增强 RTE1 的表达，而 RTE1 的过量表
达也可以导致植株乙烯不敏感表型的出现（Resnick et al.，2006）。在番茄中也获得了一个 RTE1 同
源基因GR（GREEN-RIPE），GR的过量表达导致了果实不能正常成熟以及其他乙烯不敏感表型（Barry
& Giovannoni，2006）。目前发现的 RTE1 同源基因家族成员较少。在拟南芥中，仅包括 2 个成员，
即 AtRTE1 和 AtRTH，分属于第 1 组和第 2 组（Group 1 & 2）（Resnick et al.，2006；Rivarola et al.，
2009）；在番茄中，目前也仅发现一个同源基因，即 GR（Barry & Giovannoni，2006）。在观赏植
物方面，从香石竹中分离得到了两个 RTE1 同源基因，分别对应拟南芥中的 2 个组别，自然衰老和
乙烯处理均可增强这两个基因的表达（Yu et al.，2011）。在月季切花中，已有报道发现一个属于
Group 2 的同源基因 RhRTH1，该基因在正常衰老及乙烯处理 24 h 后可被诱导表达，切伤处理也在
一定程度上诱导了该基因的表达（Yu et al.，2010）。
在本研究中，分离得到的 RhRTE1 基因属于 Group 1 类基因。RhRTE1 和 RhRTH1 两者基因表达
模式相近，可能协同调节了月季切花对乙烯的敏感性。所不同的是，RhRTE1 在乙烯诱导前期表达
上升，而 RhRTH1 在后期上升，表明两者在响应乙烯方面存在时间上的分工和协同（图 4；Yu et al.，
2010）。在拟南芥中，与 AtRTH 相比，AtRTE1 在乙烯信号转导途径中起更为关键的作用（Rivarola
et al.，2009）。因此，本研究中的 RhRTE1 在乙烯信号转导途径中可能起到更为先导的作用。该基
1982 园 艺 学 报 39 卷
因在拟南芥中的过表达，减低了植株对乙烯的敏感性，就是一个重要的遗传学证据（图 7）。有关
RhRTE1 和 RhRTH1 在响应乙烯影响花朵开放中的协同与区别，还需后续试验进一步研究明确。
总之，乙烯是造成月季切花流通损耗的最重要原因之一，如何降低或抵消其对乙烯的敏感性一
直是月季切花保鲜工作最重要的一个方面。在本研究中，在拟南芥中过量表达 RhRTE1 起到了降低
乙烯敏感性的作用（图 7），这一结果为月季切花采后保鲜提供了一个全新的理论依据。基于上述
分析，在月季切花中，通过调控 RhRTE1 等基因的表达可能更为直接和有效地提高月季切花品质，
本研究的结果可为利用新的技术手段开发月季切花高效保鲜措施提供理论参考。

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