全 文 ：园 艺 学 报 ， （ ）： – 2010 37 4 553 558
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–11–04；修回日期：2010–03–16
基金项目：国家自然科学基金项目(30660113，30860167)
中华猕猴桃矮型性状EST-SSR连锁标记的筛选
徐小彪*，姜春芽，廖 娇，辜青青，刘善军，陈金印
（江西农业大学农学院，南昌 330045）
摘 要：以中华猕猴桃（Actinidia chinensis Planch）矮型种质‘赣猕 5 号’为母本，普通型中华猕猴
桃‘奉雄 2 号’为父本构建F1群体，采用优越而高效的基于表达序列标签（Expressed Sequence Tags，EST）
的简单序列重复（Simple Sequence Repeats，SSR）标记技术，结合群体分离分析法（Bulked Segregant
Analysis，BSA）在荧光DNA测序仪（ABI3130）上进行了‘赣猕 5 号’矮型性状连锁的EST-SSR分子标
记研究。结果表明，通过本实验室开发并设计的 85 对EST-SSR荧光引物的扩增筛选，其中引物EST-Ad042
在亲本及其矮型与普通型DNA 池之间扩增出一条 285 bp 的多态性片段，经对其F1代分离群体部分矮型
与普通型单株的随机验证，该片段稳定出现，在矮型植株中表现为有带，在普通型植株中表现为无带。
遗传连锁分析表明，该标记与矮型基因之间的连锁距离为 8.8 cM。EST-SSR荧光引物能够有效地筛选到中
华猕猴桃的特异标记，可以作为鉴别矮型与普通型植株的标记引物。
关键词：猕猴桃；矮型性状；EST 序列；SSR 标记
中图分类号：S 663.4 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）04-0553-06

Screening of EST-SSR Marker Linked to Dwarf Character in Actinidia
chinensis Planch
XU Xiao-biao*，JIANG Chun-ya，LIAO Jiao，GU Qing-qing，LIU Shan-jun，and CHEN Jin-yin
（College of Agronomy，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）
Abstract: High effective simple sequence repeats（SSR）marker based on expressed sequence tags
（EST）and the method of bulked segregant analysis（BSA）on the automated fluorescent-labeled system
（ABI3130）were employed to screen the molecular marker linked to dwarf gene in kiwifruit （Actinidia
spp.） from the F1 separating progenies obtained from the cross between dwarf cultivar ‘Ganmi 5’（♀）
and normal cultivar‘Fengxiong 2’（♂）of Actinidia chinensis Planch. Eighty-five pairs of fluorescent
primers were designed and screened in the present study. The results showed that a polymorphic band of
285 bp amplified by primer EST-Ad042 was occured both in the dwarf parent and in the dwarf cultivars of
separating DNA pools but not in normal cultivar. Furthermore，the polymorphic band had been approved
by stochastic amplification in the F1 separating progenies including dwarf and normal genotypes，
respectively. The genetic distance between the EST-SSR marker and dwarf gene could be 8.8 cM by
genetic linkage analysis. The specific molecular marker of kiwifruit could be effectively mined by
fluorescent EST-SSR primers，and the fluorescent primer EST-Ad042 could be utilized to

﹡ E-mail: xiaobiaoxu@hotmail.com
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identify its dwarf plant. The screening of molecular markers linked to dwarf gene in Actinidia chinensis Planch
had been provided a basis for the studies of dwarf gene mapping and cloning in kiwifruit breeding program.
Key words：Actinidia；kiwifruit；dwarf character；EST sequence；SSR marker

猕猴桃搭架栽培是影响其生产效益的主要制约因素。因此，矮型性状是猕猴桃育种者和生产者
关注的重要性状。‘赣猕5号’是中华猕猴桃（Actinidia chinensis Planch）自然实生的矮化突变体，
株形紧凑，节间枝条短缩，冠幅小，矮型性状稳定，是矮化无架密植栽培的优良种质，也是猕猴桃
矮型育种及观赏育种的良好亲本材料（毕诗忠 等，2001）。
近年来，国内外学者在果树矮化性状方面开展了一些研究，利用不同的分子标记手段也标记定
位了一些矮化相关的基因。毕晓颖等（2002）获得了1个与苹果显性矮化主基因Dw连锁距离为0.69 cM
的RAPD标记。Tian等（2005）已用RAPD、SSR及SCAR标记对苹果的Co基因进行了标记及区域作
图。贾彦利等（2007）获得了一个与控制梨树矮化性状基因pcDw连锁距离为8.3 cM、长度为940 bp
的RAPD标记S1172-940，并将其转换成了SCAR 标记，即SCAR-940。田义轲等（2008）对来自西洋
梨的矮化型突变基因pcDw进行了SSR 分子标记研究，获得了一个与pcDw 基因连锁距离为9.3 cM的
SSR标记KA14210，并将该基因定位到了梨品种Barlett遗传图谱的第16连锁群上。目前，新型的
EST-SSR标记已成为重要农艺性状定位、基因作图、遗传多样性、比较基因组学研究的新型重要工
具（Varshney et al.，2005）。据此，本研究中采用高效的基于EST的SSR标记技术，利用BSA法对中
华猕猴桃矮型种质‘赣猕5号’的矮型性状进行鉴定与分析，旨在筛选出与中华猕猴桃矮型性状连锁
的EST-SSR标记，以便为该矮型基因的定位与克隆奠定基础。
1 材料与方法
试验材料为矮型中华猕猴桃‘赣猕 5 号’（母本，F；2n = 2x = 58）、普通型中华猕猴桃‘奉雄 2
号’（父本，M；2n = 2x = 58）及其F1代。2007 年 9 月采集F1代种子。2008 年 2 月播种，共获得F1
代幼苗 171 株。2008 年 11 月，F1幼苗植株生长基本停滞，此时进行F1代单株的矮型性鉴定。以普
通一年生实生苗的平均高度为对照，苗高低于其 1/2 的划分为矮化型。根据F1代不同单株矮化型和
普通型的分离比例，用卡方检验确定矮型基因的遗传方式。分别随机获取F1代普通型分离个体（N）
46 株（编号为PT1 ~ PT46）和矮型分离个体（D） 46 株（编号为AH47 ~ AH92）作为矮型性状特异
EST-SSR标记的验证材料。
采集新鲜嫩叶提取基因组DNA，采用CTAB法（Murry & Thompson，1980）加以改进（徐小彪 等，
2004）在 0.8％琼脂糖凝胶上电泳检测DNA质量，将DNA模板浓度调至 10 ng · μL-1，−20 ℃保存备
用。
PCR反应体系为 15 μL，内含模板DNA 20 ng，10 × buffer 1.5 μL，25 mmol · L-1的MgCl2 1.2 μL，
dNTPs 0.2 μL，上游引物 0.15 μL，下游引物 0.3 μL，M13（序列GTTTTCCCAGTCACGACGTTG）
用量为 0.3 μL，Taq DNA聚合酶 0.2 U。PCR 反应程序为：94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 30 s，58 ℃
退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，经 30 个循环后，94 ℃变性 20 s，53 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 30 s，12 个
循环，最后延伸 20 min，10 ℃保存，试剂为上海博彩公司产品。基因池按照聚丙烯酰胺电泳的基因
池及方法。PCR产物的检测采用荧光标记引物检测，引物合成时采用荧光FAM标记 5 端寡核苷酸。
荧光标记产物在DNA测序仪（ABI3130）上电泳并收集数据。
按照 BSA（Michelmore et al.，1991）分析方法构建两个表型的基因池，矮型基因池（Dwarf
Bulk，D）由 10 株矮化个体的等量 DNA 混合而成，普通型基因池（Normal Bulk，N）由 10 株普通
4 期 徐小彪等：中华猕猴桃矮型性状 EST-SSR 连锁标记的筛选 555
型个体的等量 DNA 混合而成。矮型母本（F）、普通型父本（M）及两个基因池用于筛选与矮型性
状连锁的 EST-SSR 分子标记。
用本实验室开发并设计的85对EST-SSR引物对两个基因池以及亲本进行多态性筛选，两个基因
池之间的多态条带如果在亲本间也同样存在，则表明该多态性片段（条带）可能与目标性状连锁。
为进一步验证其连锁关系，用产生多态性的引物对F1代单株进行验证。采用MAPMAKER/EXE 3.0
软件对F1分离群体中矮型性状和EST-SSR分子标记的分离数据进行连锁分析，并计算遗传图距。
2 结果与分析
2.1 猕猴桃两个基因池和亲本间的多态性分析
以矮型与普通型中华猕猴桃的近等基因池（Bulk）DNA 为模板，利用本实验室开发设计的85
对猕猴桃荧光引物（上海捷瑞合成）在自动荧光DNA测序系统（ABI3130）进行EST-SSR分析。
EST-Ad042的引物序列为：F5-GTTAATTTGATCGGGATGG-3；R5-GAGGAGCTTGAGCTGCTAT-3
（重复基元：CAC）。研究结果表明，引物EST-Ad042在矮型近等基因池中扩增出一条特异谱带，片
段大小为 285 bp（图1，D），而在普通型近等基因池中未发现（图1，N）。进一步经过验证亲本
的研究表明，EST-Ad042在携带矮型基因的母本（赣猕5号）也扩增出位置相同的特异性条带（图1，
F），而父本（奉雄2号）不存在（图1，M）。

图1 引物EST-Ad042在对比基因池与亲本自动荧光测序系统中的扩增结果
D. 矮型基因池；N. 普通型基因池；F. 母本；M. 父本。
Fig. 1 Amplification in bulks and parents for primer EST-Ad042 on the automated fluorescent-labeled system
D. Dwarf bulk；N. Normal bulk；F. Female parents；M. Male parents.
2.2 猕猴桃EST-SSR标记引物的F1代单株验证
在杂种F1代群体中，分别随机获取矮型和普通型猕猴桃单株进行EST-SSR标记引物的验证，发现
引物EST-Ad042 在矮型单株AH53、AH54、AH58、AH59、AH88、AH89 中均扩增出片段大小为 285
bp的一条特异谱带（图 2），而普通型单株中未出现该特异条带（图 3）。图 3 是引物EST-Ad042
在杂种F1代普通型单株PT9、PT11、PT13、PT24、PT25、PT33 自动荧光测序仪中的扩增图谱，结
果表明在 285 bp处未出现特异谱带。由此认为，EST-Ad042 为矮型单株的特异性EST-SSR标记，它
与中华猕猴桃矮型性状紧密连锁，可将该引物作为鉴别矮型和普通型植株的标记引物。

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图2 引物EST-Ad042在部分矮型单株自动荧光测序仪中的扩增图谱
AH53、AH54、AH58、AH76、AH59、AH88、AH89 为F1代矮型单株。
Fig. 2 Amplification of six F1 dwarf plants for primer EST-Ad042 on the automated fluorescent-labeled system
AH53，AH54，AH58，AH76，AH59，AH88，AH89 indicated dwarf individuals of F1 progenies.

图 3 引物EST-Ad042 对部分F1普通型单株自动荧光测序仪中的扩增图谱
PT9、PT11、PT13、PT24、PT25、PT33 为F1代普通型单株。
Fig. 3 Amplification of six F1 normal plants for primer EST-Ad042 on the automated fluorescent-labeled system
PT9，PT11，PT13，PT24，PT25，PT33 indicated normal individuals of F1 progenies.
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2.3 遗传连锁分析
将具有 285 bp片段大小的个体与母本一起记为 1，而不具有这个片段个体及父本记为 2，矮型
基因为理论值，即所有矮型都记为 1，所有普通型都记为 2。利用MAPMAKER/EXE 3.0 软件对F1
分离群体中株高性状和分子标记的分离数据进行连锁分析。经卡方检验，F1代群体的矮化型单株和
普通型单株符合 1:1 分离比例。
对符合 1:1 分离的拟测标记位点，选用回交分析模型进行分析，用“group”命令推测可能的连
锁群（LOD≥3.0），“order”命令排序，其它的标记用“try”命令进行追加，“compare”排序，最后
将所有的位点标记一起进行连锁分析，选用F1自交分析模型进行分析。然后，利用Kosamli函数将重
组值转化为遗传图距，构建出目标基因的局部遗传连锁图，结果表明EST-SSR标记与矮型基因的遗
传距离为 8.8 cM。
3 讨论
目前，应用EST-SSR技术在寻找果树特异性状分子标记方面的研究尚未见报道，但在柑橘（Chen
et al.，2006）、葡萄（Scott et al.，2000）、扁桃（Xie et al.，2006）、猕猴桃（Fraser et al.，2004）
遗传多样性检测、黑杨（张亚东 等，2009）品种鉴别以及苹果（Silfverberg et al.，2006）、草莓（Sargent
et al.，2006）遗传图谱构建等方面有相关研究。本研究中采用优越而高效的基于EST的SSR标记技
术，结合BSA法在荧光DNA测序仪上检测中华猕猴桃矮型与普通型DNA池的多态性，筛选出与矮型
性状连锁的特异标记。由于BSA分析要求将相同表型或基因型的个体混合，这样才能将该表型或基
因型有关的差异检测出来，从而大大提高了筛选出与目标基因连锁的分子标记的可能性。通过本实
验室开发并设计的EST-SSR荧光引物的扩增筛选，从矮型与普通型对比DNA 池中获得多态性引物
EST-Ad042，经多次重复PCR扩增，并对亲本和F1分离个体进行验证，结果表明这个多态性特异片
段均稳定存在。
本试验检测中华猕猴桃矮型与普通型DNA池的多态性时，发现引物EST-Ad042在矮型植株中表
现为有带，而在普通型植株中表现为无带，这种现象在苹果矮化基因的RAPD标记（毕晓颖 等，2002；
Tian et al.，2005）和梨矮化基因的SSR标记（田义轲 等，2008）中也出现了相似的结果。本研究采
用基于EST的SSR标记技术，结合BSA法该标记筛选出了与猕猴桃矮型性状连锁的特异标记。
EST-SSR标记来源于相对保守的转录区域，较基因组SSR标记具有更高的通用性和保守性。EST-SSR
标记是基于表达序列标签数据信息，并结合SSR 标记特点开发出的一种新型分子标记，通过EST数
据库的发掘能够有效地筛选到基因水平的SSR标记（Jiang et al.，2006）。EST-SSR标记具有开发简
便及成本低廉等优点，具有快速构建遗传连锁图谱的巨大潜力，可为功能基因研究奠定重要基础。
本研究结果也证实EST-SSR引物能够有效地筛选到猕猴桃的特异标记，可以作为鉴别矮型与普通型
猕猴桃植株的标记引物。EST-SSR 标记作为一种新型的分子标记完全可以应用于猕猴桃分子生物学
与功能基因组研究。

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