全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（5）：997–1002 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–01–24；修回日期：2011–05–06
基金项目：农业部‘948’项目（2006-G26）；农业产业技术体系项目（CARS-30-21）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：haoyan7371@gmail.com）
安全标记基因 pmi 在果树转基因研究中的应用
进展
王 鸿 1,2，郝 燕 1,*
（1 甘肃省农业科学院林果花卉研究所，兰州 730070；2 Departamento de Mejora Vegetal，CEBAS-CSIC，Murcia 30100，
Spain）
摘 要：关于木本植物转基因成功的报道很多，但木本果树的转化效率较低。甘露糖/PMI 筛选体系
以 pmi 为安全标记基因，实现对转化细胞安全、高效地正向选择。从甘露糖/PMI 筛选体系的作用原理，
影响其筛选效率的主要因素，与其它筛选体系的对比优势（高效、安全、易于检测）等几个方面综述了
这一筛选体系在木本果树转基因研究上的应用现状及其发展前景。
关键词：果树；安全标记基因；转基因；甘露糖；正向选择
中图分类号：S 66；Q 81 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）05-0997-06

Application Progress of Safe Marker Gene pmi for Fruit Tree Transformation
WANG Hong1,2 and HAO Yan1,*
（1Institute of Fruit and Floriculture，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730070，China；2Departamento
de Mejora Vegetal，CEBAS-CSIC，Murcia 30100，Spain）
Abstract：Despite the production of fertile transgenic plants through transformation mediated by
Agrobacterium tumefaciens，transformation efficiency is still low in fruit trees. The mannose selection
system employs the phosphomannose isomerase（PMI）gene as selectable gene and the transgenic
PMI-expressing cells have acquired the ability to convert mannose-6-phosphate to fructose-6-phosphate.
Compare to antibiotic selection system，it has advantages such as high selective efficiency，safety for the
environment and easy to test. It is also affected by some important factors. Here we talk about the
application of this system on fruit trees transformation and its perspective based on the existing literature
data. The advantages of this select system，some important factors affecting the transformation efficiency
are discussed as well as the approaches in fruit tree genetic transformation using this PMI/mannose system.
Key words：fruit tree；safe marker gene；transgenic；mannose；positive-selection

植物转基因育种技术已陆续建立了 50 多种转化筛选体系，其中包括许多利用 nptII，hpt，Bar
等为标记基因的抗生素或抗除草剂筛选体系，这些筛选标记基因在转化植株内的存留，引起了人们
对人类健康及自然环境安全等方面的担心。标记剔除（marker free）技术和安全标记（safe marker）


998 园 艺 学 报 38 卷
技术在近年来发展迅速。标记剔除技术主要有共转化、转座子、同源重组、位点特异性重组等方法，
同一些标记基因失活或组织特异性表达技术一样，对于木本果树植物来说，效率不高，成功的报道
较少（张余洋 等，2004）。作为安全标记技术之一的正向选择体系，在特定的生长条件下，转化细
胞能够进行正常新陈代谢和生长，未转化细胞不能正常生长，但并不会像在抗生素或除草剂筛选条
件下那样死亡。其中一些应用较广的标记基因有 AtTPS1（Leyman et al.，2006）、galT（Joersbo et al.，
2003）、xylA（Haldrup et al.，1998）、dao1（Alonso et al.，1998）、AtTSB1（Hsiao et al.，2007）以及
6–磷酸甘露糖异构酶基因 pmi。
1996 年，6–磷酸甘露糖异构酶首次在 pZY507/pmi 质粒转化的运动发酵单胞菌（Zymomonas
mobilis）中表达（Weisser et al.，1996）。到目前甘露糖/PMI 筛选体系已成功应用于 30 多种植物上。
木本果树中，在甜橙及枳橙（Boscariol et al.，2003；Ballester et al.，2008）、Swingle 枳柚（Vieira
et al.，2005）、葡萄（Reustle et al.，2003；Kieffer et al.，2004；Vaccari & Martinelli，2009）、木瓜
（Zhu et al.，2005）、扁桃（Ramesh et al.，2006）、苹果（Degenhardt et al.，2006）、李（Mikhailov et
al.，2004）等树种上已有报道。
本文中主要介绍 pmi 基因的作用及原理，影响其筛选效率的因素，在果树转基因研究中的应用
现状、优势及其应用前景。
1 pmi 基因的作用原理
pmi 基因编码 6–磷酸甘露糖异构酶（PMI，EC 5.3.1.8），广泛存在于细菌、酵母、动物及人体，
但在植物中，仅在肉桂和一些豆类中存在。在甘露糖筛选体系中，转化与未转化的植物细胞中的己
糖激酶均能不断地将培养基中的甘露糖转变为甘露糖–6–磷酸，但需要只存在于转化细胞中的 PMI
催化，才能转化为果糖–6–磷酸，然后进入糖酵解途径而被细胞正常利用，因此转化细胞可以利用
甘露糖作为碳源而正常再生和生长，未转化细胞内甘露糖–6–磷酸则大量积累，抑制葡萄糖–6–
磷酸异构酶的活性，同时消耗大量 ATP 和磷酸根离子，从而抑制糖酵解（Privalle et al.，2000；Reed
et al.，2001）、光合作用相关基因的转录及乙醛酸循环（Jang & Sheen，1994；Privalle，2002），最
终导致生长受到抑制，从而达到正向选择转化细胞的目的。
2 影响甘露糖筛选体系转化效率的因素
甘露糖/PMI 正向筛选体系依赖甘露糖–6–磷酸这一不参与代谢且对植物生长有毒害作用的己
糖的积累以及 ATP 和磷酸根离子的无效消耗而实现筛选作用，因而容易受培养基、外植体类型、生
理状态及基因型等多种因素的干扰，导致甘露糖筛选的敏感性降低。
2.1 植物种类及基因型
基因型对转化效率有很大影响。尽管 Joersbo 等（1999）认为已建立的甘露糖筛选体系可适用
于非常广泛的甜菜基因型，但在果树上，根据 Boscariol 等（2003）对不同甜橙品种的试验表明，不
同基因型之间甘露糖的使用浓度应作相应的调整。而在葡萄上的应用难度较大，Vaccari 和 Martinelli
（2009）在利用甘露糖对‘霞多丽’等 3 个不同葡萄品种的转化胚性愈伤组织进行筛选，最终没有
得到转化苗，认为甘露糖筛选体系可能不适合应用于葡萄转化，这一结果与 Kieffer 等（2004）和
Reustle 等（2003）的研究结果一致，作者认为，这也有可能与他们均使用胚性愈伤组织为外植体材
料有关。
5 期 王 鸿等：安全标记基因 pmi 在果树转基因研究中的应用进展 999

2.2 培养基中糖的种类与浓度
在多数情况下，一般需要甘露糖和其它糖类协同作用来筛选转化植株，甘露糖的浓度以及与其
它糖类的不同浓度的组合在不同植物种类和品种中效果差异较大（Boscariol et al.，2003）。苹果品
种‘Holsteiner Cox’叶片对甘露糖极为敏感，在以 30 g · L-1 山梨醇为碳源的培养基上叶片再生率近
100%，但加入 2 g · L-1 的甘露糖，即可基本抑制其再生（再生率 0.3%），而利用这一组合获得的转
化效率最高（Degenhardt et al.，2006）。虽然 Boscariol 等（2003）在仅以甘露糖为碳源的培养基上
获得了甜橙‘Natal’较高的转化率（33.3%），但加入适量蔗糖可提高转化效率到 40%，然而在另外
一个品种‘Valencia’上，则在仅以甘露糖为碳源的培养基上转化效率最高（20.8%）。木瓜胚性愈
伤组织需要甘露糖和蔗糖的组合才能正常生长和再生（Zhu et al.，2005），而扁桃品种‘Ne Plus Ultra’
的叶片则在 2.5 g · L-1 甘露糖和 15 g · L-1 蔗糖为组合的培养基上获得最佳效果（Ramesh et al.，2006）。
由此可见在不同的树种上，需要利用其它糖类缓解甘露糖对生长的抑制并协同达到最佳选择效果。
作者在以李和杏种子下胚轴为材料的试验中发现，单以甘露糖为碳源时外植体不能再生，用 2.0
g · L-1 甘露糖与 10 g · L-1 蔗糖组合可完全抑制其再生，随甘露糖浓度降低，再生率提高。也有比较
特殊的情况，如 Vieira 等（2005）在对 Swingle 枳柚的研究中指出，在仅含有 0.45 g · L-1 甘露糖的
培养基上，未转化上胚轴不能再生，但随着甘露糖浓度增大，再生能力增强，加入蔗糖则可在一定
程度上抑制再生。
合理选择用于转化试验的筛选压，有助于提高转化效率。根据在枳柚（Vieira et al.，2005）和
苹果（Degenhardt et al.，2006）上的研究结果，在木本果树上初期使用的选择压要能保证一定比率
的外植体再生。
3 甘露糖筛选体系在果树植物转基因中的应用优势
3.1 转化效率高
许多研究表明甘露糖/PMI 筛选体系相对于其它抗生素或抗除草剂筛选体系，可以获得更高的转
化效率（表 1）。Boscariol 等（2003）用带有 pmi 基因的农杆菌 EHA101 浸染‘Valencia’、‘Natal’
和‘Pera’3 种甜橙实生苗上胚轴，以不同浓度甘露糖为碳源和筛选剂，分别获得了 23.8%、12.0%
和 7.6%的转化率，3 个品种中均高于抗生素筛选体系的近两倍（表 1），同样，这一筛选体系在苹果
‘Holsteiner Cox’上获得了 24%的转化效率，高于抗生素或抗除草剂筛选体系（Degenhardt et al.，
2006）。Zhu 等（2005）在木瓜上的研究也使得转化效率极大提高，同样在扁桃上，甘露糖体系也将
转化效率从抗生素筛选体系的 5.6%提高到 6.8%（Ramesh et al.，2006）。尽管诸多的研究表明甘露
糖筛选体系更加高效，然而 Vieira 等（2005）在 Swingle 枳柚上利用甘露糖筛选体系得到的转化效
率（11%）与利用抗生素筛选体系并无差异，甚至于在葡萄转化研究中利用这一筛选体系根本得不
到转化苗（Vaccari & Martinelli，2009）。
另外，许多木本果树植物在试管内难以生根，培养基中抗生素或除草剂的应用使得这类材料生
根更加困难（Joersbo et al.，1998；Gadaleta et al.，2006）。而甘露糖筛选对转基因植株生根能力的
抑制要轻得多（Boscariol et al.，2003），苹果转化植株在 15 g · L-1 蔗糖和 2.5 g · L-1 甘露糖的培养基
上生根率可达 58.3%，在甜菜上的研究表明甘露糖体系中的生根率达到 89%，是抗生素筛选体系的
4 倍（Joersbo et al.，1998）。


1000 园 艺 学 报 38 卷
表 1 甘露糖/PMI 筛选体系在木本果树植物转基因研究中的应用
Table 1 Application of Mannose/PMI selection system in woody fruit plants transgenic research
树种
Species
品种
Cultivar
外植体
Explant
菌株/质粒
Agrobacterium/
plasmid
筛选剂
Selective agent
转化效率/%
Transformation
efficiency
参考文献
Reference
Holsteiner
Cox
叶片
Leaf
EHA105/pNOV2819 甘露糖
Mannose
24 Degenhardt et al.，
2006
苹果
(Malus ×
domestica Borkh.) Holsteiner
Cox
叶片
Leaf
EHA105/ pHKvst 除草剂
Herbicide
0.53 ~ 2.68 Szankowski et al.，
2003
AGL1/ pNOV2819 甘露糖Mannose 6.80 扁桃
(Prunus dulcis
[Miller]D.A.
Webb)
Ne plus ultra 叶片
Leaf EHA105/
pBI121mgfp-5-ER
卡那霉素
Kanamycin
5.60
Ramesh et al.，2006
Valencia 23.80 Boscariol et al.，
2003
Natal 12
Pera
上胚轴
Epicotyl
EHA101/
pNOV2116
甘露糖
Mannose
7.60
Valencia 13.70
Natal 5.60
Pera
上胚轴
Epicotyl
EHA 105/
pCattA 2300
卡那霉素
Kanamycin
3.30
Cardoso et al.，2010
Pineapple 茎段 EHA 105/pNOV2819 甘露糖Mannose 13 Ballester et al.，2008
Stem EHA 105/
p35SGUSINT
无 No selection 4.30
EHA 105/pMATIMH 无激素 Without
growth reguletor
6.70
甜橙
(Citrus sinensis L.
Osb.)
Xuegan 上胚轴
Epicotyl
EHA105/
pCAMBIA1301PMI
甘露糖
Mannose
27.70 Zeng et al.，2009
– 茎段 Stem EHA 105/pNOV2819 甘露糖Mannose 30 Ballester et al.，2008
EHA 105/
p35SGUSINT
无 No selection 4.30
枳橙
(Citrus sinensis L.
Osb. × Poncirus
trifoliata L. Raf.) EHA 105/
pMATIMH
无激素 Without
growth reguletor
7.20
枳柚
(Citrus paradisi
Macf. × Poncirus
trifoliata L. Raf.)
– 上胚轴
Epicotyl
EHA 105/
pNOV2819
甘露糖
Mannose
11 Vieria et al.，2005
葡萄
(Vitis vinifera L.)
Chardonnay
Brachetto
Merlot
Seyval blanc
砧木 110
Richter
V. berlandieri
x riparia
胚性愈伤组织
Somatic
embryogenesis
LBA 4404/
pNOV2819
甘露糖
Mannose
0 Reustle et al.，2003；
Kieffer et al.，2004；
Vaccari & Martinelli
2009
Startovaya 叶片
Leaf
CBE 21/
pNOV35S-GFP
甘露糖
Mannose
– Mikhailov et al.，
2004
Startovaya 叶片
Leaf
CBE 21/
pCamGFP
潮霉素
Hygromycin
2.2 Mikhai & Dolgov，
2005
李
(Prunus
domestica L.)
Startovaya 叶片
Leaf
CBE 21/
pBin-mGFP5-ER
卡那霉素
Kanamycin
0.23
木瓜
(Carica papaya
L.)
Kapoho 胚性愈伤组织
Somatic embryo
genesis
pNOV3610 甘露糖
Mannose
– Zhu et al.，2005
3.2 安全
世界上许多国家和地区都对转基因植物的大田试验有着严格的限制，例如欧盟早在 2004 年起就
禁止了含抗生素或抗除草剂基因的转基因植物的田间试验（Directive 2001/18/EC）。所以，需要发展
可以剔除或替代含抗生素或抗除草剂基因的安全筛选体系。最近通过安全性评估的转基因玉米
MIR604（SYN-IR6 Ø 4-5）正是使用了甘露糖/PMI 筛选体系（EFSA GMO Panel，2009）。欧盟食品
安全局（EFSA）转基因生物（GMO）专家组对转基因玉米 MIR604 中的 6–磷酸甘露糖异构酶进行
了安全性评估，几乎重复验证了 Reed 等（2001）检测的所有内容，结果表明，以 pmi 和 mCry3A 为
5 期 王 鸿等：安全标记基因 pmi 在果树转基因研究中的应用进展 1001

标记基因和目的基因的转化植株中检测到了 PMI 蛋白和 mCry3A 蛋白，连续 90 d 亚慢性毒性饲鼠
试验未见异常，肉鸡喂养试验证明转基因玉米与对照的营养功能一致，同时证明 PMI 蛋白易降解，
在高温、pH 7.0 及 65 ℃下 30 min 或离体贮存 15 d 以上等条件下用 ELISA 均未能检到 PMI 蛋白，
其它指标的检测结果基本与 Reed 等（2001）的检测结果一致。以上的试验和安全评估均证明了 PMI
蛋白对人类和自然环境的安全性。另外，甘露糖代谢可使培养基的 pH 值降低，因此可在培养基中
加入 pH 指示剂氯酚红，依据其颜色变化来检测转入了 pmi 基因的甜橙和苹果植株（Boscariol et al.，
2003；Degenhardt et al.，2006）。与 GUS 组织染色相比，转基因植株检测无需昂贵试剂，干扰反应
少，安全可靠。
4 讨论
基于pmi基因的甘露糖/PMI筛选体系为木本果树植物转化提供了不使用除草剂基因或抗生素基
因来安全筛选转化植株的可靠途径，该筛选系统具有对人体和环境安全、不影响转化植株的正常生
长、筛选效率高等特点，其筛选试剂甘露糖及检测试剂氯酚红价格低廉，有望在果树转基因育种中
得到更广泛的应用。
当然，作为一种新的筛选体系，它在木本植物上的应用经验尚十分有限。对于以往研究尚未涉
及过的材料，需先对内源 PMI 活性进行检测。此外 pmi 在葡萄上的应用未能得到转化植株，可能与
所选用的外植体类型有关。总之，这一标记基因在本本果树上的应用，有必要对基因型、外植体类
型、筛选培养基中甘露糖与其他糖以及磷酸根离子浓度、培养条件等因素进行研究。
Song 等（2010）使用一种新的以甘露糖–6–磷酸还原酶基因 M6PR 为基础的双向甘露糖/M6PR
筛选系统，研究发现对不耐甘露糖的拟南芥，M6PR 基因的表达可以提高转化细胞的耐受性，从而
进行“正向选择”；而对耐甘露糖的烟草，此基因的表达则增强转化细胞对甘露糖的敏感性，实行“反
向选择”，使得转化烟草的种子不能在 30 g · L-1 的甘露糖培养基上萌发，而其它对照则可以正常萌
发。似乎这一筛选标记基因的应用前景更为广泛，但在果树上的应用，还需要进一步研究。

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