全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (7) : 967 - 974
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 01 - 19; 修回日期 : 2009 - 06 - 15
基金项目 : 国家科技支撑计划项目 (2006BAD13B062124) ; 科技部 ‘973’重大基础研究前期研究专项 ( 2005CCA02900; CSTC,
2007BB1343) ; 重庆市自然科学基金项目 ( SCTC2005BA1010)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: citrusgr@ yahoo1com1cn)
‘岩溪晚芦 ’椪柑果皮与果肉差减 cDNA文库的构
建及初步分析
叶庆亮 , 江 东 3 , 彭爱红
(中国农业科学院柑橘研究所 , 重庆 400712)
摘 　要 : 以 ‘岩溪晚芦 ’椪柑 (C itrus reticula ta B lanco) 成熟果实果皮和果肉为材料 , 采用抑制性差减
杂交技术成功构建了果皮 ( tester) 与果肉 ( driver) 的差减 cDNA文库。结果显示 : cDNA克隆外源插入片
段大小介于 100～500 bp之间。成功对 411个克隆进行了测序 , 测序结果经与 NCB I基因库中序列进行比
较 , 377个 EST找到了同源序列 , 它们分属于 126个基因 , 涉及到色素合成、能量代谢、初级代谢、次生
代谢、抗逆防御、蛋白代谢、信号转导、香味形成、果皮软化 (衰老 )、精油合成、抗氧化等代谢途径和
生理生化过程。还有一些基因涉及到三价铁螯合物、反转录转座子 gag蛋白、查尔酮合成、硼离子转运、
儿茶酚氧位甲基转移酶等功能。功能已知且没有重复的 EST共有 63个 , 占总数的 4912%。有 5个基因共
62个克隆虽在 B last搜索时找到了较高的同源性序列 , 但功能目前尚未明确。另有 34个基因未搜索到同源
序列 , 可能为新发现的基因。
关键词 : 柑橘 ; 抑制性差减杂交 ( SSH) ; cDNA文库 ; 表达序列标签 ; 克隆 ; 差异表达基因
中图分类号 : S 666; Q 785　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0720967208
Con struction of a Subtractive cD NA L ibrary Between Fru it Ep icarp and Pulp
of Ponkan M andar in and Pr imary Ana lyses of the Sequences
YE Q ing2liang, J IANG Dong3 , and PENG A i2hong
(C itrus Research Institu te, Ch inese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, Chongqing 400712, Ch ina)
Abstract: A cDNA library was successfully constructed via supp ression subtractive hybridization between
fruit ep icarp ( experimental group, tester) and pulp ( control group, the driver) of Ponkan (C itrus reticu la ta
B lanco). Results showed that most of the clones had inserting fragments which length ranged from 100 bp to
500 bp. Four hundred and eleven ESTswere successfully sequenced and searched againstNCB I GenBank, the
results indicated that 377 ESTs had significant sim ilarities with known genes. A ll the ESTs were divided into
126 genes according to the gene annotation. These ESTs were mainly involved in p igment synthesis, energy
metabolism, p rimary metabolism , secondary metabolism, defense against stresses, signal transduction, tran2
scrip tion, flavor formation, oil synthesis, peel softening, antioxidant metabolism etc. There were 63 uni2ESTs
which accounted for 4912% of the total ESTs and another 34 ESTs had no matching homologous sequences
found.
Key words: citrus; supp ression subtractive hybridization ( SSH ) ; cDNA library; exp ressed sequence
tag; clone; differentially exp ressed genes
‘岩溪晚芦 ’是从福建长泰县普通椪柑 (C itrus reticu la ta B lanco) 中选出的迟熟变异优质品种 ,
在相同的条件下成熟期比普通椪柑迟 40～60 d, 果实品质优良 , 耐寒性较强 , 已在我国柑橘生产和育
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种中得到广泛利用 (钟连生 等 , 1994)。‘岩溪晚芦 ’在果实成熟过程中伴随着果肉品质的逐步改
善 , 果皮颜色由绿转黄 , 由厚变薄且香味增强。通过差减杂交以明确柑橘果肉和果皮品质形成过程中
基因在不同组织中的表达情况 , 克隆并鉴定这些基因 , 对深入了解果实品质形成的分子机理、发育和
代谢的调控网络及途径具有重要意义。
近年来 , 抑制性差减杂交技术已成为分离差异表达基因的重要方法 (D iatchenko et al. , 1996)。
目前柑橘类果树有关差减文库的构建及其分析已多见报道 ( Zhong et al. , 2001; M ichael et al. ,
2003; Takehiko et al. , 2003; Zhang et al. , 2004; Irving et al. , 2007; 高雪 等 , 2007) , 但有关 ‘岩
溪晚芦 ’成熟果皮组织特异表达基因的研究尚未见报道。本研究中以 ‘岩溪晚芦 ’成熟果实外果皮
和果肉为材料 , 利用抑制性差减杂交技术 , 富集其外果皮的差异表达基因 , 成功构建了果皮与果肉的
差减 cDNA文库 , 为今后进一步的基因功能分析、全长基因克隆及基因功能研究等打下基础。
1　材料与方法
111　材料
‘岩溪晚芦 ’成熟果实于 2007年 1月 28日一次性采自国家果树种质重庆柑橘圃 , 于中国农业科
学院柑橘研究所实验室用清水洗净 , 再以灭菌过的 DEPC处理的水反复浸洗 3次 , 擦干后迅速削外果
皮至液氮中 , 然后置 - 80 ℃冰箱中保存 ; 果肉取其汁胞立即以无水酒精脱水 , 然后用液氮迅速冷冻
保存于 - 80 ℃冰箱。
112　方法
11211　总 RNA的提取 　采用经典的 Phenol/SDS/L iCl抽提法 , 参考同类提取方法 ( Tao et al. , 2005;
Valeriano et al. , 2005) , 通过加入适量氯化钙 , 调整并精简步骤等 , 对抽提方法加以改良 (叶庆亮
等 , 2007)。
11212　mRNA的分离和检测 　采用 O ligotex mRNA Purification Kit严格按说明书操作 , 纯化 mRNA。
取 mRNA样品 2μL, 加入 98μL DEPC水 , 混匀后用 B IORAD Smart SpecTM 3000进行扫描 , 波长范围
为 200～300 nm , 记录 A230、A260和 A280 , 并计算 A260 /A280比值。按 Sambrook等 ( 1989) 的方法进行
非变性琼脂糖凝胶电泳 , 凝胶经浓度 112% EB染色后 , 紫外凝胶成像系统下检测照相。
11213　SSH cDNA文库的构建 　采用 PCR2SELECTTM cDNA Subtraction Kit进行文库构建 , 严格按说明
书操作 , 以成熟果皮为 Tester, 以成熟果肉为 D river。将纯化所得 mRNA分别反转录成双链 cDNA , 经
R sa I酶切后 , 把 Tester分成两等份 , 分别连接上不同的接头 , 而 D river则不与接头相连 , 将两等份
Tester分别与 D river混合 , 进行第 2轮差减杂交 , 然后将第 1轮差减杂交的产物在未经变性的情况下
混合 , 进行第 2轮差减杂交。对两轮杂交后所得的差异表达序列进行抑制性 PCR扩增后 , 再以巢式
引物进行第 2轮 PCR扩增 , 所得 PCR产物与 T载体连接 , 再将连接产物电转化至 DH5α感受态细胞
中 , 然后以 LB培养基 37 ℃培养后 , 涂布在含 X2gal和 IPTG的 LB /Amp琼脂培养基平板上 , 37 ℃培
养过夜 , 挑取白色单菌落培养扩增后 , 取部分菌液以终浓度 40%的灭菌甘油保存于 - 80 ℃冰箱 , 从
而构建成果皮与果肉差异表达基因的 cDNA文库。试剂盒中接头和引物的序列如下。Adap tor 1: 5′2
CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT23′; Adap tor 2R: 5′2CTAATACGACT2
CACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT23′; PCR p rimer 1: 5′2CTAATACGACTCACTATAGGGC2
3′; G3PDH 5′p rimer: 5′2ACCACAGTCCATGCCATCAC23′; G3PDH 3′p rimer: 5′2TCCACCACCCTGTT2
GCTGTA23′; Nested PCR p rimer 1: 5′2TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT23′; Nested PCR p rimer 2R: 5′2
AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT23′。
11214　文库片段大小检测与序列分析 　将菌液提取质粒进行 PCR扩增 , 再经凝胶电泳 , 确定插入片
段的长度。随机挑取文库中 500个克隆送到北京三博远志公司进行测序。所得 EST去除载体序列后 ,
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　7期 叶庆亮等 : ‘岩溪晚芦 ’椪柑果皮与果肉差减 cDNA文库的构建及初步分析 　
登录 NCB I网站 , 采用 B lastX程序进行同源性比对分析。选择 NCB I非冗余蛋白质数据库 ( non2redun2
dant p rotein database) , 所有参数设置均使用默认值 , 根据提交序列长度、得分高低、配准百分比 , 判
定 EST是否为已知功能基因。参照拟南芥 (Newman et al. , 1994 ) , 水稻 ( Yamamoto & Sasaki,
1997) 的分析标准 , 得分 ( score) 大于 70且序列一致性 ( indentity) 大于 80%的搜索结果认为功能
已知 , 获取蛋白质功能注释。
2　结果与分析
211　总 RNA和 m RNA的质量
所得总 RNA质量和浓度均较高 , 经凝胶电泳、 EB 染色后在紫外灯下观察 , 28S rRNA 和 18S
rRNA条带清晰且完整 , 无可见拖尾和污染 (图 1) , 比例接近 2 ∶1, A260 /A280均在 118～210之间。所
得 mRNA经电泳后效果也较明显 , 可用于文库构建 (图 2)。
212　cD NA文库构建效果
21211　酶切效果 　取 215μL 消化的 ds cDNA和 5μL R saⅠ消化的 cDNA于 1 ×TAE缓冲液中 , 在
1%琼脂糖上进行电泳。结果表明 , R saⅠ酶切后 , 平均 cDNA大小分布范围明显小于未酶切的 cDNA ,
说明酶切完全 , 符合试验要求。
21212　连接效率 　将连有 Adap tor 1和 Adap tor
2R的两组产物分别用不同引物扩增。对照以
Adap tor 1连接的产物为模板 , 分别以试剂盒中的
G3PDH 3′p rimer 和 PCR p rimer 1、 G3PDH 3′
p rimer和 G3PDH 5′p rimer为引物进行扩增 , 共 35
个循环。从对照的 PCR产物看 , 相应片段间相差
明显小于 4倍 , 连接效率大于 25% (图 3) , 说明
差减效率较高 , 满足试验要求。
21213　第 2次 PCR产物 　将第 2次 PCR 产物进
行凝胶电泳 , 结果表明 , 差减的大小主要介于
011～015 kb 之间 , 明显小于未差减的 (介于
011～110 kb) , 说明两者大部分共有序列已被差
减消除 (图 4) , 背景有效地减少 , 不同表达序列
得到进一步富集。
图 3　连接效率图
1: 对照 ( G3PDH 3′p rimer和 PCR p rimer 12Adap tor 1) ;
2: 对照 ( G3PDH 3′p rimer和 5′p rimer2Adap tor 1) ;
M: DNA分子量标准 DL2000。
F ig. 3　Ana lysis of L iga tion eff ic iency
1: Control ( G3PDH 3′p rimer and PCR p rimer 12Adap tor 1) ;
2: Control ( G3PDH 3′p rimer and 5′p rimer2Adap tor1) ;
M: Marker DL2000.
21214　插入片段的大小 　随机挑取 100个克隆进行质粒抽提 , 再进行 PCR扩增和凝胶电泳 , 其中 96
个克隆显示存在有效产物。 cDNA克隆外源插入片段的大小绝大部分介于 011～015 bp之间 , 与 SSH
预期插入片段的大小相吻合 (图 5)。
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21215　阳性克隆的蛋白质功能分析 　随机挑选文库中 500个克隆进行测序 , 成功测出 411个序列 ,
其中最长为 868 bp, 最短为 67 bp, 绝大部分则集中于 100～500 bp之间 , 与 PCR检测结果相一致。
经与 NCB I基因库中序列进行比较 , 有 377个 EST序列找到了同源序列 , 它们分属于 126个基因 , 其
中编码一种假想未知蛋白的基因出现频率最高 , 达 31次 , 占总数的 8122% ; 编码一种未命名蛋白的
基因出现频率达 28次 , 占总数的 7143% ; 编码假想叶绿体 RF1的基因出现频率达 25次 , 占总数的
6163% ; 5个基因出现频率在 10～20之间 ; 55个基因出现频率在 2～10之间 , 其中大部分集中在 2～
5之间 ; 功能已知且没有重复的 EST有 63个 , 占总数的 4912%。有 5个基因共 62个克隆虽在 B last
搜索时找到了较高的同源性序列 , 但功能目前尚未明确 , 有待于进一步深入分析。另有 34个基因未
搜索到同源序列 , 可能为新发现的基因。
经初步分析 , 这些具有较高同源性的 EST分别涉及到与色素合成、能量代谢、初级代谢、次生
代谢、抗逆防御、蛋白代谢、信号转导、香味形成、果皮软化、精油合成、抗氧化代谢等代谢途径和
生理生化过程。还有一些基因涉及到反转录转座子 gag蛋白、查尔酮合成、硼离子转运、儿茶酚氧位
甲基转移酶等功能 (表 1)。
表 1　阳性克隆与 GenBank同源序列比较结果
Table 1　The result of the ESTs bla st
样品号
No.
相关蛋白
Related p rotein
一致性 /%
Identity
频率
Frequency
样品号
No.
相关蛋白
Related p rotein
一致性 /%
Identity
频率
Frequency
EA18 Hypothetical p rotein, conserved 87 (72 /82) 3 31 E67 NADP2isocitrate dehydrogenase 81 (79 /98) 1
EA67 Unnamed p rotein p roduct 86 (173 /199) 28 EA192 WUSCHEL2like p rotein 83 (64 /77) 1
E02 Hypothetical chlorop last RF1 93 (82 /88) 25 E0325 Sec7 domain2containing p rotein 100(143/143) 1
E0340 d2limonene synthase 89 (227 /255) 18 EA17 Zeta2carotene desaturase p recursor 85 (145 /170) 1
EA297 NADH2p lastoquinone 98 (123 /125) 15 EA42 UDP2glucose2flavonoid232O2glucosyl 80 (69 /86) 1
oxidoreductase subunit K transferase
EA95 Reverse transcrip tase 84 (174 /207) 12 EA129 Cap santhin /cap sorubin synthase 95(114 /120) 1
EB19 Photosystem II p rotein D1 88 (94 /107) 12 E54 Terpene synthase 87(205 / /236) 1
EA16 Maturase K 86 (81 /94) 11 EB43 Sucrose transporter 2 89 (99 /111) 1
E0332 RNA polymerase beta subunit 100 (121 /121) 9 EA294 Unnamed p rotein p roduct 85 (89 /105) 1
EB31 R ibosomal p rotein S8 100 (78 /78) 7 E0326 Soluble epoxide hydrolase 87 (106 /122) 1
EA7 Sucrose2phosphate synthase 1 85 (97 /114) 5 E0376 Somatic embryogenesis recep tor 100 (67 /67) 1
(UDP2glucos kinase1
EB13 Carotenoid cleavage dioxygenase 4a 97 (100 /103) 5 EA169 WD2repeat p rotein HUSSY207, 94 (222 /237) 1
putative
EA96 Zeaxanthin epoxidase 96 (134 /140) 4 EB21 Fructokinase 97 (223 /229) 1
E0375 PSI reaction center subunit III 88 (226 /257) 4 EA103 DNA repair p rotein RecO 94 (271 /288) 1
E0321 Actin gene 89 (64 /72) 4 EA299 Pyruvate decarboxylase 84 (67 /80) 1
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续表 1
样品号
No.
相关蛋白
Related p rotein
一致性 /%
Identity
频率
Frequency
样品号
No.
相关蛋白
Related p rotein
一致性 /%
Identity
频率
Frequency
EA9 Phosphoenolpyruvate carboxylase 89 (188 /211) 4 EA125 Basic cellulase 92 (100 /109) 1
E0371 Malate dehydrogenase 92 (255 /278) 4 EA154 Putative thioredoxin H p rotein 89 (77 /87) 1
EE12 Gamma2terp inene synthase 84 (55 /65) 4 EA296 Putative thermostable pectinesterase 83 (57 /68) 1
EB12 Cinnamate 42hydroxylase CYP73 81 (117 /144) 4 E0316 Putative sterol esterification p rotein 87 (149 /171) 1
EB22 Acetyl2CoA carboxylase 100 4 EB3 Putative myb fam ily 84 (58 /69) 1
carboxyltransferaseβ subunit (312 /312) transcrip tion factor
EA177 A ttachment p rotein recep tor, mRNA 84 (318 /380) 3 EA14 PRED ICTED: sim ilar to surface 100 (102 /102) 1
antigen
EA160 M iraculin2like p rotein 3 86 (115 /134) 3 EE1 Putative 40S ribosomal p rotein S7 100 (212 /212) 1
EB32 Fe ( III) 2chelate reductase 82 (147 /179) 3 E225 Phytoene desaturase 87 (78 /90) 1
E0311 Cytochrome P450 88 (273 /310) 3 E0304 Plastidic ATP /ADP transporter 89 (98 /102) 1
EB42 Conserved hypothetical p rotein; 94 (138 /146) 3 EA158 U racil phosphoribosyl transferase 100 (278 /278) 1
putative. like p rotein
EB7 ADH trascrip tion factor 81 (96 /119) 3 EB5 Phenylalanine2ammonia lyase. 85 (210 /247) 1
EA6 92cis2epoxycarotenoid dioxygenase 3 83 (74 /89) 3 EA266 Pentatricopep tide ( PPR) repeat2 100 (98 /98) 1
containing p rotein
E132 A lanyl2tRNA synthetase 86 (45 /52) 3 EA198 Non2phototrop ic hypocotyl 3 100 (152 /152) 1
E0369 MYC2 86 (337 /392) 3 EA40 NHX1 86 (147 / /171) 1
EB18 Vacuolar2p rocessing enzyme 84 (127 /151) 2 EB44 PRED ICTED: sim ilar to 93 (88 /95) 1
p recursor. KIAA0550 p rotein
EA202 Sucrose synthase 87 (99 /113) 2 EA295 NADH dehydrogenase subunit 9 100 (77 /77) 1
EA102 RNA2directed DNA polymerase 98 (68 /69) 2 EA132 Monoterpene synthase 96 (258 /269) 1
E190 Retrotransposon gag p rotein 100 (212 /212) 2 EA151 L ip id2transfer p rotein 86 (311 /366) 1
EA213 Putative senescence2associated p rotein100 (98 /98) 2 E0302 Maltose /maltodextrin transport system 99 (266 /267) 1
E68 Putative reverse transcrip tase 100 (116 /116) 2 EA245 L igA 89 (100 /112) 1
E0305 ATP synthase CF1 beta subunit 100 (86 /86) 2 EA304 LEAFY 88 (141 /160) 1
EA90 Putative gag2pol polyp rotein 93 (65 /70) 2 EA204 Isoflavone reductase2like p rotein 80 (100 /125) 1
EA69 Acetyl2CoA carboxylase 95 (247 /261) 2 EA165 HECT domain and RCC12like 95 (138 /145) 1
carboxyltransferase domain p rotein
EA269 Polyp rotein 1 100 (98 /98) 2 E07 Integrase 100 (58 /58) 1
E0345 Polygalacturonase2inhibiting p rotein 83 (44 /53) 2 EB39 Guanylyl cyclase. 96 (126 /131) 1
EA229 Pectinesterase 98 (123 /124) 2 EA80 Gag2pol polyp rotein, putative 100 (134 /134) 1
EA274 O2methyltransferase 81 (100 /123) 2 EA59 Ethylene2induced esterase 80 (88 /110) 1
EA88 NAC domain p rotein 86 (116 /135) 2 E0372 Cytosolic phosphoglucomutase 81 (98 /121) 1
EB46 MYB602like p rotein 86 (67 /78) 2 EB40 Cytochrome b6 82 (108 /125) 1
EA46 M itogen2activated p rotein kinase 88 (85 /96) 2 EA199 Cinnamyl alcohol dehydrogenase 98 (265 /267) 1
EA189 Majorfacilitator superfam ily (MFS_1) 99 (258 /261) 2 EA243 Twin2arginine translocation 96 (154 /160) 1
transporter pathway signal
EA138 MADS2box p rotein 86 (340 /388) 2 EA8 Calcium2dependent p rotein kinase 96 (98 /102) 1
EA48 Lycopene ep silon2cyclase 86 (121 /140) 2 EA254 B inding 100 (86 /86) 1
EA271 L ipoxygenase 80 (67 /84) 2 EA128 Beta2fructofuranosidase 92 (129 /140) 1
EA86 Flavonol synthase / flavanone 32 97 (99 /102) 2 EA51 Pyrophosphate2dependent 82 (89 /108) 1
hydroxylase. phosphofructokinase al
EA215 Flavonoid 122 rhamnosyltransferase 100 (88 /88) 2 EA210 AML1 89 (256 /288) 1
EB48 Extensin2like p rotein 87 (79 /91) 2 E0314 AF426451_1 cytochrome P450 86 (137 /159) 1
EB47 Expansin 89 (58 /63) 2 EA66 AF369930_2 pol polyp rotein 80 (55 /69) 1
EB35 Envelope membrane p rotein 100 (145 /145) 2 EA89 Acidic class II chitinase 88 (356 /405) 1
EA43 Dehydrin 91 (146 /157) 2 EA164 ACC oxidase 90 (213 /235) 1
EB34 Cytochrome c heme attachment 90 (178 /190) 2 EA247 NADH2p lastoquinone oxidoreductase 97 (386 /399) 1
p rotein subunit 4L.
EA206 Citrus sucrose transporter 1 90 (90 /100) 2 E0310 Putative reverse transcrip tase 100 (256 /256) 1
EA250 Cell wall invertase 87 (84 /97) 2 E0319 Putative gag2pol polyp rotein 89 (59 /66) 1
EA31 Boron transporter 88 (45 /51) 2 EA171 Phenylalanine2ammonia lyase 87 (87 /100) 1
EA30 ATP synthase CF0 subunit I 89 (116 /130) 2 E63 Vacuolar citrate /H + symporter 87 (188 / /216) 1
EA53 A lpha2glucan water dikinase, 85 (78 /91) 2 E0373 Conserved hypothetical p rotein; 100 (138 /138) 1
chlorop last putative.
EB37 A llene oxide synthase 85 (55 /65) 2 E04 Hypothetical p rotein MAL7P1. 142 100 (66 /66) 1
EB15 Acidic cellulase 92 (324 /357) 2 E0312 Boron transporter 86 (76 /88) 1
　　3 括号内 : 相同序列长度 /序列总长度。3 The content within the brackets is: The length of sim ilar sequences/Total sequence length.
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3　讨论
本试验中发现差减效率的高低直接关系到能否得到差异表达基因 , 其中最关键的是 Tester cDNA
与人工接头连接 , 其效率高低直接影响差减杂交的成败 , 这与 D iatchenko等 (1996) 的报道相一致。
‘岩溪晚芦 ’果皮果胶含量高 , 常规方法无法提取到满意的总 RNA, 在加入提取液后再加入适量
氯化钙可除去果胶 , 获得了高纯度的 RNA。
本研究中 , 酶切后的产物核苷酸片段明显减小 , 得到了与预期大小相符的产物 , 加上连接效果
好 , 最终获得了大量的重组子 , 经检测 , cDNA插入大小介于 100～500 bp之间 , 符合预期要求。文
库构建过程中 , 由于经过了酶切 , 易造成同一基因发生频率 (丰度或表达水平 ) 高估的假象 , 并且
一些高丰度表达的基因也会在文库中出现很多拷贝 , 须进行 reverse northern验证。
本研究中 , 利用岩溪晚芦外果皮为 Tester, 岩溪晚芦果肉为 D river, 差减结果富集的是外果皮中
的特异表达基因 , 即可能是与外果皮组织发育相关的基因。对 411个克隆成功进行了测序 , 结果经与
NCB I基因库中序列进行比较 , 有 377个 EST序列找到了同源序列 , 分属 126个基因 , 涉及众多重要
功能。
根据同源性分析结果发现 , 有两个基因高频率 (31次和 28次 ) 出现 , 说明其在成熟的外果皮组
织中的表达水平明显高于果肉组织中 , 可能具有某种重要的生物学功能。
一般在柑橘果实外果皮表皮细胞中富含叶绿体 , 本研究中差减杂交获得的几个高丰度表达的基
因 , 均与叶绿体编码的基因有关。其中编码假想叶绿体 RF1因子的基因出现频率达 25次 , 在外果皮
组织中的表达水平较高 , RF1是叶绿体形成的必需因子 , 促进叶绿素合成 (Reiko et al. , 2007)。编
码 NADH -质体醌氧化还原酶亚基 K (NADH2p lastoquinone oxidoreductase subunit K) 的基因出现频率
为 15次 , NADH和质体醌在叶绿体光合电子传递链中起传递电子和质子的作用 , 为光合作用所必需 ;
编码光合系统 Ⅱ蛋白 (photosystem Ⅱ p rotein) 的基因出现 12次 , 叶绿体光系统 PS Ⅱ起裂解水释放
氧和传递电子的作用 , 是光合作用必不可少的 (潘瑞炽 等 , 2004) ; 另外 , 编码成熟酶 K (maturase
K) 的基因出现频率达 11次 , 成熟酶 K基因位于叶绿体 trnK基因的内含子中 , 编码一种成熟酶 , 此
酶参与剪切 RNA转录体中Ⅱ型内含子 ( Soltis et al. , 1996)。此外 , 定位于叶绿体细胞器中的基因还
有编码细胞色素 P450 ( cytochrome P450)、光合系统 I反应中心亚基 Ⅲ ( PSI reaction center subunit
Ⅲ) , 光合系统 Ⅱ蛋白 D1 (photosystem Ⅱ p rotein D1)、蔗糖磷酸化合成酶 1 ( Sucrose2phosphate syn2
thase 1) (姜东 等 , 2000) , 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (phosphoenolpyruvate carboxylase) ( Peter &
Udo, 2004)、乙酰辅酶 A 羧化酶羧基转移酶 β亚基 ( acetyl2CoA carboxylase carboxyltransferase beta
subunit) ( Thelen & Ohlrogge, 2002; Ken2ichi et al. , 2004) 等基因。上述基因的高丰度表达均清楚地
显示这些基因与叶绿体光合途径的基因有关。通过差减杂交富集到的这些高丰度表达的基因或可间接
证实叶绿体在外果皮细胞中分布更多 , 而在果肉汁胞中则缺乏 , 也说明本试验差减效率比较高。
另外 , 与柑橘果皮油胞中柠烯合成途径有关的基因 , 如编码右旋柠烯 (D2limonene) 合成酶基因
也得到高丰度表达 , 在总测序结果中出现频率达 18次。右旋柠烯为单萜烯 , 大量存在于柑橘精油中 ,
尤其在橘皮的油胞中广泛存在 , 是重要的次生代谢物质 , 也是成熟柑橘果皮中香味的重要组分 (汤
建国 等 , 2004)。右旋柠烯合成酶基因在温州蜜柑果皮早期发育阶段起着重要的调控作用 ( Shimada
et al. , 2004, 2005)。本结果表明 , 在柑橘成熟的外果皮中该基因仍然高丰度表达 , 而在果肉则不存
在 , 这可能与果皮香味产生的有着重要联系 ( Endo et al. , 2008)。
本差减杂交还高效富集了一些与色素有关的基因 , 如编码类胡萝卜素双加氧裂解酶 4a ( carote2
noid cleavage dioxygenase 4a) (由淑贞和杨洪强 , 2008)、玉米黄质环氧化酶 ( zeaxanthin epoxidase)
(冯娟 等 , 2005)、9 -顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶 3 (92cis2epoxycarotenoid dioxygenase 3) (杨锦芬
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　7期 叶庆亮等 : ‘岩溪晚芦 ’椪柑果皮与果肉差减 cDNA文库的构建及初步分析 　
等 , 2007)、转录激活因子 (MYC2) (刘仕芸 , 2007) 等基因 , 也在柑橘外果皮中高丰度表达。
本试验通过差减杂交法筛选出了岩溪晚芦外果皮特异表达基因 , 深入研究这些基因对于了解果皮
在成熟时期的生理生化变化具有重要意义。下一步将对筛选出的差异表达基因 , 如与色素相关的基因
和柠烯代谢有关的基因 , 采用实时定量 PCR和 Northern法进一步验证 , 并进行全长基因的克隆及其
表达和功能分析。
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