全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（9）：1741–1746 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–03–21；修回日期：2011–08–16
基金项目：农业科技成果转化资金项目（04EFN216900382）；云南省科技计划项目（2006YX16）；国家基础条件平台项目子项目
（2005DKA21005-27）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：guolf1207@126.com）
利用 ISSR 分析澳洲坚果的亲缘关系
郭凌飞 1,2，邹明宏 1，杜丽清 1，曾 辉 1，陆超忠 1,*，刘晓静 3
（1 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，广东湛江 524091；2 广西壮族自治区亚热带作物研究所，南宁 530001；
3广西壮族自治区甘蔗研究所，南宁 530007）
摘 要：从 100 条 ISSR 引物中筛选出 19 条重复性好，扩增条带清晰的引物对 17 份澳洲坚果种质进
行亲缘关系分析。19 条引物共扩增出 369 个位点，多态性位点 249 个（67.5%）。利用 UPGMA 法得到的
聚类的结果表明 17 份种质分为 4 个类群，所有夏威夷选育出的品种在最大的一个类群中归于两个亚类，
而在澳大利亚选育出的品种则分别聚为独立的类群，因此推测夏威夷选育出的品种很可能起源于两个遗
传多样性不同的群体；而澳大利亚选育的品种其遗传背景和选育史与夏威夷的品种不同。
关键词：澳洲坚果；亲缘关系；ISSR
中图分类号：S 667.9 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）09-1741-06

Analysis on Genetic Relations of Macadamia by ISSR Markers
GUO Ling-fei1,2，ZOU Ming-hong1，DU Li-qing1，ZENG Hui1，LU Chao-zhong1,* and LIU Xiao-jing3
（1South Subtropical Crops Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences，Zhanjiang，Guangdong，
524091，China；2Guangxi Subtropical Crops Research Institute，Nanning 530001，China；3Guangxi Zhuang Autonomous
Region Sugar Cane Research Institute，Nanning 530007，China）
Abstract：Nineteen primers were used to analysis the genetic relation of 17 macadamia which
screened from 100 primers. A total of 369 bands were amplified，of which 249 bands were polymorphic
bands（the percentage of polymorphic band，PPB = 67.5%）. Examination of multivariate relationships
among accessions using a cluster analysis resulted in the identification of four clusters. All Hawaiian
cultivars were included in two sub-clusters within the largest cluster. The results suggesting that the
Hawaiian cultivars must have originated from at least two genetically diverse ancestral populations；And
the Australian selections，which formed 3 separate clusters，probably represent a different genetic
background and selection history in Australia as compared to Hawaiian selections.
Key words：macadamia；genetic relation；ISSR

澳洲坚果（Macadamia spp.）属山龙眼科（Proteaceae）澳洲坚果属（Macadamia F. Muell），原
产于亚热带地区。以前主要通过形态学和农艺学性状对澳洲坚果种质变异性进行评价，但由于存在
饰变和观察标准的差异，较难准确进行分类。


1742 园 艺 学 报 38 卷
应用同工酶（Vithanage & Winks，1992；Aradhya et al.，1998）、RAPD（Vithanage et al.，1998）、
STMS（Vithanage et al.，1998）、AFLP（Steiger et al.，2003）、RAMiFi（Peace et al.，2004）、RAF
（Peace et al.，2005）等方法可较准确地对澳洲坚果进行遗传多样性分析、遗传图谱构建和品种鉴
定。
本研究中用 ISSR 技术从分子水平对中国热带农业科学院南亚热带作物研究所引入的澳洲坚果
种质进行亲缘关系分析，旨在探索该技术在澳洲坚果种质变异性评价上的效应，以期为澳洲坚果优
良品种的自主选育、品种鉴定、充分挖掘现有品种资源提供理论依据，为合理引进国外品种，避免
盲目和重复引种提供有益的参考。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验于 2007 年下半年开始，17 份澳洲坚果品种（表 1）的叶片均取自中国热带农业科学院
表 1 17 份澳洲坚果品种名称及原产地
Table 1 Accessions of 17 macadamia for ISSR analysis

编号
No.
品种
Accessions
产地及来源
Origins and breeding methods
类型
Type
1 Keauhou（HAES246） 美国夏威夷科纳岛
Selected at the Hawaii Macadamia Nut Co. Orchard at Keauhou，Kona，Hawaii
光壳澳洲坚果
M.integrifolia
2 Ikaika（HAES333） 美国瓦胡岛檀香山的 Nutridge 果园
Selected at the Nutridge Orchard of the Hawaii Macadamia Co.，Honolulu，Oahu
光壳澳洲坚果
M.integrifolia
3 Beaumont（HAES695） 澳大利亚昆士兰州 Highfileds 地区
Selected at the Goswell property at Highfields，Australia
杂交种
Hybrid
4 Kau（HAES344） 美国瓦胡岛檀香山的 Nutridge 果园
Selected at the Nutridge Orchard of the Hawaii Macadamia Co.，Honolulu，Oahu
光壳澳洲坚果
M.integrifolia
5 Mauka（HAES741） 美国考艾岛
Selected at the Deschwanden Orchard，Lawai Valley，Kauai
光壳澳洲坚果
M.integrifolia
6 Hinde（H2） 澳大利亚昆士兰州吉尔斯顿地区
Selected at the Gilston，Qld，Australia
光壳澳洲坚果
M.integrifolia
7 Pahala（HAES788） 美国瓦胡岛，从开放授粉的 Keauhou 的后代中选育出
Selection from open-pollinated progeny of‘Keauhou’，at the Poamoho Expt. station，
Oahu
光壳澳洲坚果
M.integrifolia
8 特殊种 Special 澳大利亚
Australia
光壳澳洲坚果
M.integrifolia
9 Own Choice 澳大利亚昆士兰州比瓦地区野生丛林
Selection from wilding，at the Beerwah Qld，Australia
光壳澳洲坚果
M.integrifolia
10 Keaau（HAES660） 美国考艾岛
Selected at the Deschwanden Orchard，Lawai Valley，Kauai
光壳澳洲坚果
M.integrifolia
11 Makai（HAES800） 美国夏威夷，从开放授粉的 Keauhou 的后代中选育出
Selection from open-pollinated progeny of‘Keauhou’，at the Waiakea Expt. Farm，
Hawaii
光壳澳洲坚果
M.integrifolia
12 桂热一号 Guire 1 广西壮族自治区亚热带作物研究所龙州试验站从引入的杂交实生苗中选出
Selected from seedling， at experimental station of Guangxi Subtropical Crops
Research Institute，China
光壳澳洲坚果
M.integrifolia
13 Kakea（HAES508） 美国瓦胡岛檀香山的 Nutridge 果园
Selected at the Nutridge Orchard of the Hawaii Macadamia Co.，Honolulu，Oahu
光壳澳洲坚果
M.integrifolia
14 Purvis（HAES294） 美国瓦胡岛檀香山的 Nutridge 果园
Selected at the Nutridge Orchard of the Hawaii Macadamia Co.，Honolulu，Oahu
光壳澳洲坚果
M.integrifolia
15 A4（X64） 澳大利亚从 D4 与 Own Choice 的后代中选育出
Selected from open pollinated progeny of‘Renown（D4）’in Australia
杂交种
Hybrid
16 A16（X61） 澳大利亚从 D4 与 Own Choice 的后代中选育出
Selected from open pollinated progeny of‘Renown（D4）’in Australia
杂交种
Hybrid
17 广 9 Guang 9 广西壮族自治区亚热带作物研究所自选优良品系
Selected at Guangxi Subtropical Crops Research Institute，China
光壳澳洲坚果
M.integrifolia
9 期 郭凌飞等：利用 ISSR 分析澳洲坚果的亲缘关系 1743

南亚热带作物研究所澳洲坚果种质资源圃，包括世界目前的主栽品种和国内选育出的优良品种和品
系。
1.2 DNA 提取与 PCR 扩增
采用改良 CTAB 法（郭凌飞 等，2008a）提取总 DNA。以 0.6%琼脂糖凝胶检测 DNA 质量，用
核酸蛋白仪（Eppendorf）检测 DNA 浓度及纯度。
PCR 反应在 Mastercycler Gradient PCR 仪上完成（Eppendorf），体系及扩增程序为郭凌飞等
（2008b）所优化的结果。25 μL 的反应体系中包括 1 × PCR buffer，Taq DNA 聚合酶 1 U（TaKaRa），
模板 DNA 20 ng，dNTPs 0.15 mmol · L-1（Sangon），引物 0.25 μmmol · L-1（Sangon），Mg2+ 2.5
mmol · L-1，0.4%甲酰胺。
扩增程序为：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 30 s，复性 1 min，72 ℃延伸 2 min，35 个循环，
72 ℃延伸 7 min。扩增产物加入 4 μL 6 × Loading buffer（0.05%二甲苯菁 FF，0.05% 溴酚蓝，36%
甘油，30 mmol · L-1 EDTA），用 1.6%的琼脂糖凝胶于 0.5 × TBE 中以 < 5 V · cm-1 的电压电泳分离。
1.3 数据分析
于 Gel Doc EQ（Bio-Rad）凝胶成像系统上拍照后进行读带，以 DL2000 为分子标准量，判定同
一引物扩增的电泳迁移率一致的条带为同一位点的产物，具有同源性。有带（显性）记为 1，无带
（隐性）记为 0。
按 Nei 和 Li（1979）相似系数法（又称 Dice 法）计算样品间的相似系数 GSij，得到相似系数矩
阵。按 UPGMA 法（Nei & Kumar，2000）进行 SAHN（Sneath & Sokal，1973）聚类分析。再将聚
类图转换为协表征矩阵（Cophenetic matrix），而后用 Mxcomp 程序对协表征矩阵和相似系数矩阵的
相关性进行 Mantel 测验，计算 r 值，r 值越高表明比较双方的相似度越高。
2 结果与分析
2.1 ISSR 扩增结果
ISSR 引物根据加拿大哥伦比亚大学 UBC 公司公布的第 9 套引物序列，由上海生工生物工程有
限公司合成。利用品种 Keauhou、Ikaika、Own Choice、Keaau 从 100 条引物中筛选出条带清晰，重
复性好的引物共 19 条。
在 19 条不同基序的引物中，以（CT）n 和（TC）n 的引物居多，各有 5 条，表明在澳洲坚果基
因组中存在大量的（TC）和（CT）二核苷酸重复序列。
19 条引物共扩增出 369 条带，扩增条带分子量主要集中于 250 ~ 2 000 bp，其中多态性位点共
计 249 个，占 67.5%。各引物的扩增条带数从 14 到 27 不等，平均扩增带为 21.7 条。扩增带数最多
的为（AG）8 YT，最少的是（TG）8 A 和（ATG）6 ；各引物扩增多态比率最高的为（AC）8 T，达 88.2%，
最低的为 42.9%，说明澳洲坚果 ISSR 扩增的谱带丰富，具有较多的多态位点，可很好地揭示澳洲坚
果品种间的亲缘关系。
2.2 品种鉴别
19 条引物扩增出的 369 条谱带可将 17 个品种完全区分开。大多数位点所表现出的特征为多数
品种所共有，但有个别品种在一些位点表现出独有的特点。由图 1 可见，在 996 bp 处，除 9 号外，
其他品种都有该谱带。
1744 园 艺 学 报 38 卷
图 1 引物 UBC-844[(CT)8RC]的扩增结果
M：DL 2000 1 ~ 17 名称见表 1。
Fig. 1 The amplification result of primer UBC-844
M：DL 2000；No. 1–17 accessions showed in Table 1.

2.3 遗传差异分析
17 份澳洲坚果材料的遗传相似系数为 0.7589 ~ 0.9068。其中 5 号‘Mauka’与 10 号‘Keaau’
的相似系数最大，为 0.9068，表明二者的亲缘关系最近（图 2），而 15 号 A4 与 1 号 Keauhou 的相
似系数最小（GS = 0.7589）。将聚类结果转换为协表征矩阵，对协表征矩阵和相似系数矩阵的相关
性进行 Mantel 测验，其相关系数 r = 0.8816（n = 136），表明两种矩阵相关性显著，说明聚类结果很
好地体现了种质间的遗传关系。
由基于 Dice 相似系数构建出的树状图（图 2）可见，在 0.8240 处，可将 17 个澳洲坚果品种分
为 4 个类群。第Ⅰ类群包括所有夏威夷选育出的品种及广西壮族自治区亚热带作物研究所选育的优

图 2 根据 ISSR 结果构建的 17 份澳洲坚果材料 UPGMA 聚类图
1 ~ 17 名称见表 1。
Fig. 2 The clustering result of 17 accessions calculated by UPGMA were determined from ISSR
No. 1–17 accessions showed in Table 1.
9 期 郭凌飞等：利用 ISSR 分析澳洲坚果的亲缘关系 1745

良品系桂热一号（12 号）；第Ⅱ类群包括澳大利亚选育出的品种 Hinde（6 号）、Own Choice（9 号）、
A16（16 号）及特殊种（8 号）；品种 Beaumont（3 号）单独成为第Ⅲ类群；A4（15 号）与广 9（17
号）则聚为第Ⅳ类群。
在 0.8500 处进行第二等级划分，可将第Ⅰ类群细分为 3 个亚类：亚类 A 包括 Keauhou（1 号）、
Ikaika（2 号）、Purvis（14 号）、Kakea（13 号）；亚类 B 包括 Kau（4 号）、Mauka（5 号）、Keaau
（10 号）、Makai（11 号）、Pahala（7 号）；桂热一号（12 号）为亚类 C。而第Ⅱ类群分为由 Hinde
（6 号）和特殊种（8 号）组成的亚类 D 以及由 Own Choice（9 号）与 A16（16 号）组成的亚类
E。
3 讨论
从遗传相似系数和聚类树状图来看，参试的 17 个澳洲坚果品种间的遗传相似系数相对较大。
在阈值 0.8240 处，所有夏威夷选育品种聚为第Ⅰ类，而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ类则包括所有澳大利亚选育的品
种。而在 0.8500 处所有夏威夷品种又分为两个亚类，这意味着夏威夷品种很可能是从至少两个被引
入夏威夷的品种中选育出的，一个是 1882—1885 年间由 Purvis 引入夏威夷 Kukuihaele 地区，另一
个则是 1892 年由 E. W. Jordan 和 R. A. Jordan 引入檀香山（Hamilton & Fukunaga，1959；Shigeura &
Ooka，1984）。而澳大利亚选育的品种从夏威夷的品种中分离出，且聚集为几个类群，表明澳大利
亚选育的品种其遗传背景和选育史可能与夏威夷不同，其遗传背景更为复杂。
在第Ⅰ类群中，虽然 Kau、Ikaika、Purvis、Kakea 选自同一果园，但在生产能力、坚果和果仁
特性以及树种形态的存在较大差异，表现出丰富的多样性，这些品种分别聚集到两个亚类。在 B 类
中，Kau、Keaau、Mauka 聚为一个亚类。
Vithanage 和 Winks（1992）、Aradhya 等（1998）采用同工酶技术对澳洲坚果进行遗传多样性分
析时发现，除 Keauhou 和 Ikaika 外的品种均可被区分开，而在本研究中采用 ISSR 标记可将二者区
分。Keauhou 是夏威夷最早选育出的品种，坚果和果仁特性好，但树形相对开张分散。而 Ikaika 的
坚果和果仁特性较之其他品种差，但其长势旺盛，且抗风性好，因此 Ikaika 仍被选为栽培品种
（Hamilton et al.，1952）。
此外，亲缘关系最为接近的是 Keaau 和 Mauka。Keaau 具有直立生长的习性，果实和果仁的特
性突出；而 Mauka 也具有直立生长的特性。Keaau 和 Mauka 的果实特性和果仁特性相当相似。但是，
在相对海拔为 548.64 ~ 670.56 m 的高海拔区域 Mauka 的表现远好于其它栽培品种（Hamilton & Ito，
1977）。虽然目前没有关于二者亲本树种的记载，但较为接近的遗传距离说明它们的起源可能相
同。
在本研究中也发现表型性状的归类与分子标记的结果有较大差异。如 Makai 虽然是从 Keauhou
通过开放式授粉产生的后代中选育出的，二者在树形、果实特性和潜在产量方面都很相似，但 Makai
的果仁质量和一级果仁率要比 Keauhou 好得多（Hamilton & Ito，1977）。因此，尽管 Makai 是 Keauhou
的直系后代，但二者却处于两个不同的亚类中。
在第Ⅱ类群中Own Choice与A16聚为亚类E，与实际情况相符，因为A16选自D4与Own Choice
的杂交后代；但同样选自 D4 与 Own Choice 的杂交后代的 A4 却从中分离，不与 A16 及 Own Choice
聚集，这与 Vithanage 等（1998）的结果相似。出现这一现象的原因尚不清楚，可能有两方面的原
因：一是可能引入的种质由于栽培环境的变化发生变异；二是杂交后代大多表现为趋母性，但也有
可能表现出极强的趋父性，虽然 A4 与 A16 都是 D4 与 Own Choice 的杂交后代，但所表现出的趋向
并不相同，A16 可能表现为较强的趋父性，而本研究中没有母本 D4，因此无法了解 A4 是否表现为
1746 园 艺 学 报 38 卷
趋母性，有待于进一步研究。
桂热一号是广西壮族自治区亚热带作物研究所试验站从引入的实生苗群体中选出，从聚类图上
看，在 0.8240 处它与夏威夷的栽培品种聚为一类，而在 0.8500 处桂热一号从夏威夷品种中分离出；
从遗传相似系数来看，桂热一号与夏威夷品种间的相似系数较大，与澳大利亚品种 Hinde 的相似系
数最小，GS = 0.7951，由此推测桂热一号的实生母体可能源自夏威夷选育的品种，与夏威夷品种具
有较为相似的遗传背景。

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