全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (1) : 109 - 114
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 08 - 01; 修回日期 : 2008 - 11 - 04
基金项目 : 国家 ‘863’重点项目 (2006AA100107) ; 山东省自然科学基金项目 ( Y2007D24) ; 山东省良种工程项目 (2006LZ012
01) ; 山东省农业科学院青年基金项目 (2006YQN040)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: guangcunl@gmail1com)
二倍体马铃薯高效再生体系的建立
晁祥健 1, 2 , 杨　煜 1 , 金黎平 3 , 张　煜 1 , 刘生祥 2 , 丁汉凤 1 , 屈冬玉 3 ,
李广存 13
(1 山东省农业科学院高新技术研究中心 , 济南 250100; 2 宁夏大学农学院 , 银川 750021; 3 中国农业科学院蔬菜花卉
研究所 , 北京 100081)
摘 　要 : 以二倍体马铃薯抗青枯病基因型 ED13、CE171和感青枯病基因型 ED25的茎段为外植体 , 在
优化植物生长调节剂配比的基础上 , 对不同基因型的组培再生进行了研究。结果表明 : 不同基因型具有不
同生长调节剂配比要求。固体 —液体培养基双层看护培养对于二倍体马铃薯茎段愈伤组织的诱导有效 , 以
固体培养基中 NAA 210 mg·L - 1 ∶62BA 210 mg·L - 1的配比为佳。对于 ED13而言 , 液体培养基中以 2, 42D
215 mg·L - 1 ∶KT 015 mg·L - 1的配比为佳 , 相比之下 CE171则以 2, 42D 115 mg·L - 1 ∶KT 110 mg·L - 1为最
好 , 二者的愈伤诱导率均达 100% ; 对于基因型 ED25, 只有在 NAA 210 mg·L - 1 ∶62BA 110 mg·L - 1和
2, 42D 115 mg·L - 1 ∶KT 110 mg·L - 1时才能形成较好的愈伤。ZT在愈伤组织诱导芽分化过程中具有重要作
用 , 单独使用 ZT浓度为 110 mg·L - 1时 , ED13和 CE171的芽分化率均达 95%以上 ; 而 ED25则只有在 ZT
和 62BA配合使用 , 配比为 ZT 015 mg·L - 1 ∶62BA 215 mg·L - 1时才可获得较高的芽分化率。
关键词 : 马铃薯 ; 二倍体 ; 茎段 ; 愈伤组织 ; 分化 ; 植株再生
中图分类号 : S 532　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0120109206
Con struction of H igh Regenera tion System s for D iplo id Pota to
CHAO Xiang2jian1, 2 , YANG Yu1 , J IN L i2p ing3 , ZHANG Yu1 , L IU Sheng2xiang2 , D ING Han2feng1 ,
QU Dong2yu3 , and L I Guang2cun13
(1 H igh2tech R esearch Cen ter, Shandong A cadem y of A gricultural Sciences, J inan 250100, China; 2A gricu lture College, N ingxia
U niversity, Y inchuan 750021, Ch ina; 3 Institu te of V egetables and Flow ers, Ch inese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, B eijing
100081)
Abstract: H igh regeneration system for dip loid potato was developed using segments as exp lants of in
vitro p lantlets of three genotypes, ED13 ( bacterial wilt resistant) , CE171 ( bacterial wilt resistant) , and
ED25 ( bacterial wilt suscep tible). The role of p lant hormones combinations was studied for callus formation
and shoot differentiation. The result showed that different genotype needed different p lant hormone combination
for its callus formation and shoot differentiation. Solid - liquid nurse medium was helpful for callus induction of
dip loid potato and the best p lant hormone combination in solid medium was NAA 210 mg·L - 1 ∶62BA 210
mg·L - 1. For ED13, the best hormone combination in liquid medium was 2, 42D 215 mg·L - 1 ∶KT 015
mg·L - 1 ; whereas, for CE171, combination of 2, 42D 115 mg·L - 1 ∶KT 110 mg·L - 1 was the best. Both of
these medium combinations gave high callus induction up to 100% 1 But for genotype ED25, only the combi2
nations of NAA 210 mg·L - 1 ∶62BA 110 mg·L - 1 and 2, 42D 115 mg·L - 1 ∶KT 110 mg·L - 1 could give
good callus induction result. ZT p layed an important role in the induction of shoot differentiation. More than
95% exp lants of genotype ED13 and CE171 were differentiated using only ZT 110 mg·L - 1. However, the
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combination of ZT 015 mg·L - 1 ∶62BA 215 mg·L - 1 was needed for high shoot differentiation of ED25.
Key words: potato; dip loid; segment; callus; differentiation; p lant regeneration
二倍体马铃薯 (2n = 2x = 24) 约占马铃薯总资源的 74% (Hawkes, 1990) , 其分布较马铃薯普通
栽培种更为广泛 (H ijman et al. , 2007) , 并含有多种对病、虫和不良环境的抗性基因及优良品质性状
基因 ; 同时二倍体马铃薯染色体数较少 , 遗传简单 , 易于分析和进行遗传操作。发掘二倍体马铃薯资
源优良基因对于解决普通栽培种 (2n = 4x = 48) 遗传背景狭窄、基因库贫乏及有效改良现有普通栽
培种等具有重要意义 (赵明辉 等 , 2004)。马铃薯普通栽培种是同源或部分同源四倍体 , 倍性水平和
胚乳平衡数 ( EBN ) 的差异使其难以与二倍体马铃薯进行有性杂交 , 在一定程度上限制了二倍体种
质资源在作物性状改良上的应用。因此 , 建立高效的二倍体马铃薯组培再生体系对于二倍体马铃薯在
作物改良及植物基因工程中的应用至关重要。本试验中以二倍体马铃薯不同基因型的茎段为外植体 ,
进行了离体培养与植株再生的研究 , 为今后进行功能基因转化和验证奠定基础。
1　材料与方法
111　材料与试剂
二倍体马铃薯抗青枯病基因型 ED13、CE171和感青枯病基因型 ED25的无菌试管苗由中国农业
科学院蔬菜花卉研究所马铃薯课题组提供 , 其遗传背景见文献 (Qu, 1996)。将无菌试管苗的单茎节
切段接种于 MS基本培养基上 , (25 ±1) ℃, 光照强度 2 000～3 000 lx, 16 h /8 h (昼 /夜 ) 光暗交替
条件下培养 25～30 d后备用。试验于 2007年在山东省作物与畜禽品种改良生物技术重点实验室完
成。生化试剂及 ZT, KT, 62BA, NAA , 2, 42D分别购自 Promega公司、TaKaRa公司及北京天为时代
公司。
112　愈伤组织的诱导
以 MS为基本培养基 , 固体诱导培养基附加不同浓度的 NAA和 62BA, pH 518; 液体诱导培养基
附加不同浓度的 KT、2, 42D和 012%的酪蛋白水解物及 3%的蔗糖 , pH 615 (表 1)。无菌条件下 ,
将固体诱导培养基倒入直径 9 cm的高压灭菌培养皿中 , 稍凝固后铺上两层灭菌的滤纸 , 再加入 115
mL液体培养基。取无菌培养 25～30 d的马铃薯试管苗茎段 (不含茎节 ) 置于滤纸上 , 每处理至少接
种 35个茎段 , 3次重复。 (25 ±1) ℃, 光照强度 2 000～3 000 lx, 16 h /8 h昼 /夜光暗交替条件下培
养。7 d后统计愈伤组织诱导率。
113　不定芽分化与根再生
选择培养一周的诱导率较高的培养基上的愈伤茎段 , 转接至附加有不同浓度的 ZT、62BA的 MS
基本培养基 (即芽分化培养基 ) 上 (表 2)。15 d继代一次 , 以补充不定芽正常发生所需营养 , 30 d
后统计不定芽再生率。待不定芽长至 1～2 cm后 , 将分化出的不定芽切下转入不含任何植物生长调节
剂的 MS固体培养基上 , 7 d后观察生根情况。
2　结果与分析
211　不同培养基愈伤组织诱导率比较
本试验中采用固体 —液体培养基双层看护培养法对不同基因型的外植体愈伤组织的形成及胚性愈
伤的发生进行了研究。结果 (表 1) 表明 : 抗病基因型 ED13和 CE171对培养基中的植物生长调节剂
浓度和配比的适应范围较大 , 在不同配比下愈伤诱导率均达到 84%以上 , 尤以固体培养基中 NAA和
62BA的浓度配比 2∶2, 液体培养基中 2, 42D和 KT的浓度配比 215∶015和 115∶110为佳 , 愈伤诱导率
均达 100% (表 1中 B1和 B2培养基 ) , 所形成的愈伤组织呈哑铃形。ED13茎段外植体在 B1培养基
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　1期 晁祥健等 : 二倍体马铃薯高效再生体系的建立 　
上所形成的愈伤组织质地致密 , 颜色鲜绿 , 表面有光泽 , 生长较快 , 且数量也较多 ; 而在其他配比的
培养基上所形成的愈伤组织过于疏松 , 颜色较淡 , 长势较差 , 易生根或生长缓慢 , 数量较少 , 并有逐
渐白化现象。相比之下 , CE171的茎段外植体则在 B2培养基上的生长势更强。感病基因型 ED25对
植物生长调节剂浓度及配比要求较高 , 只有在培养基 C2中 , 外植体所形成的愈伤组织才呈哑铃形 ,
且质地致密 , 中部和两端膨大均匀 ; 而在其它培养基中形成愈伤时 , 多数出现整体或中部膨大变粗 ,
两端褐化 , 有的有生根现象。
表 1　植物生长调节剂配比对二倍体马铃薯基因型茎段愈伤组织诱导的影响
Table 1　Effect of d ifferen t plan t growth reguta tor com b ina tion s for ca llus induction on d ifferen t d iplo id pota to genotypes
编号
No.
固体培养基 / (mg·L - 1 )
Solid medium
NAA 62BA 液体培养基 / (mg·L - 1 )L iquid medium2, 42D KT 基因型Genotype 外植体数Number of exp lants 愈伤数Number of callus 愈伤率 /%Percentage of callus
A1 310 110 215 015 ED13 115 104 9014
ED25 123 88 7115
CE171 110 101 9118
A2 115 110 ED13 111 97 8714
ED25 119 90 7516
CE171 114 102 8915
A3 110 115 ED13 109 102 9316
ED25 120 93 7715
CE171 110 106 9614
B1 210 210 215 015 ED13 120 120 100
ED25 115 105 9113
CE171 102 102 100
B2 115 110 ED13 126 126 100
ED25 128 120 9318
CE171 110 110 100
B3 110 115 ED13 120 109 9018
ED25 116 98 8415
CE171 109 99 9018
C1 210 110 215 015 ED13 121 109 9011
ED25 106 99 9314
CE171 103 97 9412
C2 115 110 ED13 119 103 8616
ED25 107 107 100
CE171 111 97 8714
C3 110 115 ED13 120 101 8412
ED25 119 92 7713
CE171 107 99 9215
D 310 210 0 0 ED13 102 78 7615
ED25 105 60 5711
CE171 100 66 6610
E 210 310 0 0 ED13 107 55 5114
ED25 103 50 4815
CE171 104 69 6613
212　不同培养基再生芽诱导率比较
在 ZT浓度为 015 mg·L - 1时 , 3种基因型的芽分化率均小于 10% (表 2, 培养基 Ⅰ) ; 当 ZT浓
度提高至 110 mg·L - 1时 , 抗病基因型 ED13和 CE171的芽分化率均达 95%以上 (表 2, 培养基 Ⅱ) ,
且单个外植体产生不定芽的数量较多 (图 1) , 而感病基因型 ED25的芽分化率则没有明显变化 ; 随
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着 ZT浓度的继续升高 , 芽分化率又会逐渐降低 , 且愈伤组织表面出现白霜及白色须状物 , 当升高至
115 mg·L - 1时 , 3种基因型的芽分化率均降为 0 (表 2, 培养基 Ⅲ)。对于感病基因型 ED25, 只有当
ZT和 62BA结合使用时才可有效诱导芽分化 , 如在培养基 V中芽分化率可达 9511% , 并且单个外植
体芽分化数量也增加 (图 2) , 但 62BA的加入却降低了抗病基因型 ED13和 CE171的芽分化率。
表 2　ZT和 62BA组合对二倍体马铃薯基因型芽分化的影响
Table 2　Effect of ZT and 62BA com b ina tion s for shoot d ifferen tia tion on d ifferen t d iplo id pota to genotypes
编号
No1 ZT/(mg·L - 1 ) 62BA /(mg·L - 1 ) 基因型Genotype 外植体数Number of exp lants 分化数Number of differentiation 分化率 /%Percentage of differentiation
Ⅰ 015 0 ED13 109 10 912
ED25 105 　1 110
CE171 106 　3 218
Ⅱ 110 0 ED13 116 112 9616
ED25 107 　3 218
CE171 112 107 9515
Ⅲ 115 0 ED13 108 　0 0
ED25 104 　0 0
CE171 110 　0 0
Ⅳ 110 510 ED13 96 　6 613
ED25 69 37 5316
CE171 91 　0 0
Ⅴ 015 215 ED13 103 　6 518
ED25 102 97 9511
CE171 105 　2 119
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3　讨论
311　固体 —液体双层培养基诱导法
固体 —液体双层培养方法最初用于原生质体的培养 (周宇波 等 , 2001)。首先在培养皿底部先铺
一层含植物生长调节剂的固体培养基 , 再在其上加入含有不同植物生长调节剂的液体培养基 , 这样不
仅有利于固体培养基中的营养成分及植物生长调节剂缓慢地向液体培养基中释放 , 以补充液体培养基
中外植体对营养的消耗 , 同时外植体所产生的有害代谢物质也易于扩散进入固体培养基 , 从而加快愈
伤组织形成的速度。本研究中利用该方法进行愈伤组织的诱导 , 相对于单用固体培养基时间缩短了
2～3 d, 并且显著提高了胚性愈伤的发生率。
312　愈伤组织的诱导
近年来国外许多学者已开展了利用二倍体马铃薯不同外植体进行植株再生和遗传转化的研究
( Knapp et al. , 1988; Frey et al. , 1989; V isser et al. , 1989; Chakraborty et al. , 2000; Takuma & Akira,
2005; Nadolska2O rczyk et al. , 2007) , 但这些报道均采用的是固体培养基直接进行愈伤组织诱导。本
试验在进行愈伤诱导的过程中 , 所用植物生长调节剂种类较少且在诱导过程中种类和浓度变化较小 ,
不需要继代 , 操作简单 , 周期较短。
不同的马铃薯基因型在同一种诱导培养基上 , 其愈伤组织的诱导效果存在显著差异。因此 , 愈伤
组织诱导培养基应根据基因型及外植体的不同而异。由于试验材料的不同 , 完全按照前人研究所获得
的培养基配方进行培养 , 诱导产生的愈伤组织易生根、褐化或白化 (李娟 等 , 2004)。本研究中二倍
体马铃薯 ED13、ED25和 CE171的愈伤组织诱导及不定芽分化培养基的要求不完全相同 , 顶端幼嫩
的茎段外植体在诱导过程中易白化 , 诱导出来的愈伤组织随着继代时间的延长容易死亡 ; 基部较老的
茎段外植体易老化 , 继代培养生长缓慢 , 且易褐化 , 因此选用植株中部幼嫩茎段为外植体较好。在愈
伤组织的诱导过程中还发现 , 抗病基因型 ED13和 CE171对植物生长调节剂的浓度和配比适应范围较
大 , 而感病基因型 ED25则较小 , 其原因尚待探讨。
313　愈伤组织的分化
本试验中只用 ZT或 ZT + 62BA, 成功获得了 3种不同基因型的二倍体马铃薯的不定芽 , 且均表现
出了较高的诱导率 , 因此 , ZT可能是诱导马铃薯芽分化的理想植物生长调节剂 , 这与前人 (王萍
等 , 2006) 研究结论一致。在芽诱导过程中 , 对于抗病基因型 ED13和 CE171, 单独使用 ZT即可获
得高达 95%的芽分化率 , 加入 62BA后 , 芽分化率则大大降低 ; 相反对于感病基因型 ED25, 只有二
者有机结合才可获得较好的芽分化效果 , 因此推测 : 在抗病基因型 ED13和 CE171中可能存在调节芽
分化的特异基因 , 并且该基因对 ZT敏感 , 低浓度的 ZT促进其表达 , 过高浓度时则起抑制作用 ; 同
时该基因也受 62BA的抑制。在感病基因型 ED25中 , 因缺乏抗病基因型中所特有的某些基因 , 而使
得只用 ZT不能很好地开启促使芽分化的基因 ; 当加入 62BA后 , 62BA与 ZT共同作用调节芽分化 , 从
而获得较高的芽分化率 , 但究竟原因如何 , 尚需进一步探究。
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