全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（6）：891–898
Acta Horticulturae Sinica
甜樱桃果实 NCED基因的克隆及其表达
任 杰，吴洁芳，冷 平*，孙 亮，赵胜利
（中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193）
摘 要：为了进一步研究 ABA在甜樱桃果实成熟过程中的作用，通过 RT-PCR以及 RACE-PCR方法
从甜樱桃果实克隆得到了 ABA合成关键酶 NCED基因片段 PacNCED1及其 3′ 末端序列，从乙烯利处理
果实中克隆得到了乙烯合成关键酶 ACO基因片段 PacACO1。推测的 PacNCED1和 PacACO1氨基酸序列
与其它物种的 NCEDs和 ACOs氨基酸序列具有很高的同源性。通过半定量 RT-PCR及定量 RT-PCR方法
分析了 PacNCED1 和 PacACO1 的表达模式，发现 PacNCED1 在甜樱桃果实发育的整个过程以及不同部
位都有表达，在果肉和种子中的表达不断增加，在果实成熟之前达到最高峰，而在果柄中的表达则在果
实完熟时达到最大。PacNCED1 在未失水的叶片和根中有微弱表达，但在失水叶片中的表达急剧上升，
表现出与失水的相关性。外源 ABA 和乙烯利能促进 PacNCED1 在果实中的表达，而 NDGA 和 IAA 对
PacNCED1在果实中的表达没有显著影响。在甜樱桃果实发育过程中并没有检测到 PacACO1的表达信号，
但是外源乙烯利和 ABA处理能诱导其在果实中的表达。
关键词：甜樱桃；NCED；ACO；ABA；基因；克隆；表达
中图分类号：S 662.5 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）06-0891-08

Cloning and Expression Analysis of NCED Gene from Sweet Cherry Fruit
REN Jie，WU Jie-fang，LENG Ping*，SUN Liang，and ZHAO Sheng-li
（College of Agriculture and Biotechnology，China Agricultural University，Beijing 100193，China）
Abstract: In order to understand the role of abscisic acid（ABA）in sweet cherry fruit maturation, one
cDNA（PacNCED1）encoding 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase（NCED）as a key enzyme in ABA
biosynthesis was cloned from the sweet cherry fruit， and one cDNA（ PacACO1） encoding
1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid（ACC）oxidase involved in ethylene biosynthesis was cloned from
ethephon treated fruits using RT-PCR and RACE-PCR approach. The amino acid sequences of PacNCED1
and PacACO1 showed high homology to those of other NCEDs and ACOs. The expression patterns of
PacNCED1 and PacACO1 were determined using RT-PCR and Real time PCR. The results indicated that
the PacNCED1 was expressed continuously during the whole period of sweet cherry fruit development and
in different tissues. Expression of PacNCED1 gene increased in the flesh and seeds and reached the
maximum before maturation and that in pedicle reached the maximum at full maturity of sweet cherry fruit.
PacNCED1 gene was weakly expressed in control leaves and roots，but sharply increased in water stressed
leaves. Compared to the control，ABA and ethephon treatments could enhance the expression of PacNCED1

收稿日期：2010–03–02；修回日期：2010–05–07
基金项目：北京市科委重大科技项目（D0706002000091）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：leng.p@263.net）
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in fruit，while the NDGA and IAA treatments had no effect. The expression of PacACO1 during sweet
cherry fruit development was not detected，but it could be induced with the ethephon and ABA treatments.
Key words：sweet cherry；NCED；ACO；ABA；gene；clone；expression

乙烯是人们公认的促进果实后熟衰老的激素，乙烯在跃变型果实成熟过程中的作用已有较多研
究（Jiang & Fu，2000；Stepanova & Ecker，2000），乙烯信号路径是目前植物激素调控途径中研究
最清楚的路径之一，也是控制果实成熟的关键路径之一。但是，除乙烯之外的别的途径也能影响果
实的成熟，如大多数非跃变型果实成熟并不需要乙烯合成高峰的出现。因此调控非跃变型果实成熟
的路径还需要进一步研究。
作者在以前的研究中，已经在生理水平上初步证明了 ABA和乙烯与甜樱桃果实成熟的关系（任
杰和冷平，2010），发现乙烯可能并不参与甜樱桃果实的成熟进程或不起主要作用，而 ABA可能启
动并参与了甜樱桃果实的成熟。现已证明，9–顺环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）是高等植物
ABA生物合成的关键酶之一（Tan et al.，1997；Burbidge et al.，1999；Iuchi et al.，2001）。目前关
于 NCED基因的研究大多集中在其对干旱胁迫的调控方面（Schwartz et al.，2003；Xiong & Zhu，
2003）。超表达 NCED基因能增加植物对干旱的抗性（Iuchi et al.，2001；Qin & Zeevaart，2002；
Thompson et al.，2002）。而 NCED基因在果实中的表达只在鳄梨（Chernys & Zeevaart，2000）和柑
橘（Rodrigo et al.，2006）以及番茄（Zhang et al.，2009a）上有初步研究。
为了深入研究 ABA 和乙烯在甜樱桃果实成熟中的作用，从甜樱桃果实中克隆了一个 NCED 基
因，并通过定量 RT-PCR分析了其在甜樱桃果实成熟过程中及根叶等营养组织中的表达。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于 2008—2009年在中国农业大学果树系采后生理实验室进行。所用材料为 9年生‘红灯’
甜樱桃（Cerasus avium L.‘Hongdeng’），采自北京市农林科学院林业果树研究所。根据甜樱桃发
育规律每间隔 2 ~ 7 d采样 1次，采样时间为上午 9：00—9：30，采后立即带回实验室，用手术刀
片分离果皮和果肉，液氮速冻后–80℃保存备用。总 RNA 的提取采用热硼酸法（Wan & Wilkins，
1994）。
1.2 NCED和ACO基因的克隆及序列分析
采用 PrimeScriptTM RT reagent kit（TaKaRa）将提取的花后 30 d果实总 RNA，按说明书反转录
为 cDNA。
根据 GenBank已发表的相关同源基因的氨基酸保守序列和核苷酸序列设计简并引物。NCED：
forward 5′-TTYGAYGGNGAYGGNATGGTNCA-3′，reverse 5′-TCCCANGCRTTCCANARRTGRAA-
3′；ACO：forward 5′-TYYTNAARCAYYTNCCNGT-3′，reverse 5′-NGGYTCYTTNGCYTGRAA-3′；
β-actin：forward 5′-ATGGTGAGGATATTCAACCC-3′，reverse 5′-CTTCCTGTGGACAATGGATGG-
3′。以第一链 cDNA为模板，利用 RT-PCR技术扩增 NCED，ACO以及 β-actin基因片段。根据克隆
得到的 NCED 中间片段设计特异性引物，利用 RACE-PCR 技术，按照 Invitrogen 公司的 3′ RACE
System for Rapid Amplification of cDNA ends试剂盒说明书，对 NCED基因 3′末端序列进行扩增。引
物序列：outer 5′ -GCACGACTTCGCCATCAC AGA-3′；inner 5′-TGATTCCAGACCGGCAAGTG-3′。
6期 任 杰等：甜樱桃果实 NCED基因的克隆及其表达 893
PCR反应程序：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，52 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，扩增 32个
循环；72 ℃延伸 10 min。
目的片段回收按天根生化科技（北京）公司琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书进行。回收产物连接
到 pMD18-T载体（TaKaRa）上，转化大肠杆菌 DH5α后筛选阳性克隆送上海英骏公司测序。
序列测定后在 NCBI进行序列比对，核苷酸聚类分析由 DNAMAN软件完成。
1.3 PacNCED1和PacACO1表达的半定量RT-PCR以及定量RT-PCR分析
提取甜樱桃果实、叶片和根总 RNA，采用 PrimeScriptTM RT reagent kit（TaKaRa）反转录成单
链 cDNA，用 Corbett Research公司 Rotor-Gene 3000 Two-filter Real-time Cycler对 NCED基因进行
实时荧光定量 PCR。用 β-actin作为内参以校正上样量。所用引物见表 1。
定量 PCR采用 SYBR Premix Ex TaqTM kit（TaKaRa）。反应体系包括：1 µL primer mix（包括 5
µmol · L-1forward和 reverse引物），2 µL cDNA，12.5 µL SYBR Premix Ex TaqTM（2 ×）mix和 9.5 µL
水。反应条件为：95 ℃ 30 s（1个循环）；95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，（40个循环）。
NCED基因的相对表达量通过 Rotor-Gene 6.1.81软件进行计算。
表 1 PacNCED1基因表达半定量 RT-PCR和定量 RT-PCR引物
Table 1 Oligonucleotide primers for the RT-PCR and Real time RT-PCR analysis of PacNCED1
引物
Primer
GenBank 登录号
GenBank accession No.
序列
Sequence
说明
Comment
PacNCED1 F GQ913652 5′-ctccagagttccgtatggttttc-3′ NCED1 Forward primer
PacNCED1 R 5′-tagcttcccacaggtaattgtcc-3′ NCED1 Reverse primer
PacACT1 F FJ560908 5′-ctcctctcaaccctaaggctaacag-3′ ACT Forward primer
PacACT1 R 5′-cagttgtacgaccactggcatacag-3′ ACT Reverse primer
1.4 ABA、乙烯利、NDGA和IAA对PacNCED1在甜樱桃果实中表达的影响
2009年，取 2年生花后 29 d带果实和叶片的结果枝，分别在含有 1 mmol · L-1ABA，1 mmol · L-1
乙烯利，150 µmol · L-1去甲二氢化愈创木酸（Nordihydroguaiaretic acid，NDGA），1 mmol · L-1 IAA
的培养液和对照水中，24 ℃培养 5 d，光照周期 16 h。
1.5 失水对叶片中PacNCED1表达的影响
取甜樱桃成熟叶片，称质量，分成两组，一组利用干热吹风机使其失水 30%，另一组则将叶片
果柄插入水中作为对照。两组同时取样，–80 ℃保存备用。
试验所有数据用 Excel软件进行计算和作图，采用 t-test对试验数据进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 甜樱桃果实NCED基因的克隆
利用 RT-PCR技术和简并引物，从甜樱桃果实中克隆到了一个 740 bp中间片段，所克隆片段与
其它植物 NCED基因具有很高的同源性，命名为 PacNCED1（GenBank登录号：GQ913652）。
利用 RACE-PCR技术克隆到一个 858 bp的 PacNCED1 3′末端序列，PacNCED1全长 1 598 bp，
其中包括 317 bp的 3′末端非翻译区。
BLAST 比对和同源性分析表明甜樱桃 NCED 基因所编码的氨基酸序列与番茄 LeNCED1

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（Z97215）氨基酸同源性为 80.93%，与鳄梨 PaNCED1（AF224672）氨基酸同源性为 70.33%，与
PaNCED3（AF224671）同源性为 72.79%，与柑橘果实 CsNCED1（DQ028471）氨基酸同源性为 80.65%，
与 CsNCED2（DQ028472）同源性为 80.23%，此外与桃（PpNCED1，EF625684；PpNCED2，EU912386）
和葡萄（VvNCED1，EF625685）果实 NCED氨基酸片段的同源性都在 80%以上。
利用 RT-PCR 和简并引物，从乙烯利处理甜樱桃果实中克隆到了一个 ACO 基因片段 PacACO1
（GenBank 登录号：GU380294）。甜樱桃果实 ACO 基因片段编码的氨基酸与番茄 LEACO4
（AB013101）氨基酸同源性为 85.59%，与杏 Pa-ACO（AF026793）氨基酸同源性为 87.29%，与柑
橘 CsACO1（AJ297350）氨基酸同源性为 74.81%，与桃果实 PP-ACO1（AB044711）和 PP-ACO2
（AB044712）氨基酸同源性分别为 85.12%和 82.20%。此外，为了进行后续定量 RT-PCR表达分析，
还扩增到了甜樱桃 β-actin 基因片段作为内参。克隆得到的 β-actin 基因片段和其它物种的也具有很
高的同源性，命名为 PacACT1（GenBank登录号：FJ560908）。
2.2 PacNCED1基因在甜樱桃果实成熟过程中的表达模式
从图 1中可以看出，在甜樱桃果实发育的整个过程中 PacNCED1持续表达，而在此过程中却未
检测到 PaACO1的表达。但是乙烯利和 ABA处理能诱导甜樱桃果实 PacACO1基因的表达。这也可
以从分子水平上解释在甜樱桃果实发育过程中并没有检测到内源乙烯的释放以及乙烯利和 ABA 处
理能诱导乙烯的合成（任杰和冷平，2010），也进一步说明了乙烯可能并不参与甜樱桃果实的成熟进
程。
图 1 PacNCED1和 PacACO1在甜樱桃果实成熟过程中的表达以及乙烯利和 ABA处理
对其表达的影响的半定量 RT-PCR分析
Fig. 1 Expression of PacNCED1 and PacACO1 during sweet cherry fruit ripening and effects of ethephon and
ABA on PacNCED1 and PacACO1 transcripts

通过定量 RT-PCR研究了甜樱桃果实发育过程中 PacNCED1在果肉、种子和果柄不同部位的表
达。结果（图 2）显示 PacNCED1果实果肉中的表达表现出先上升后下降的趋势，在盛花后 36 d左
右达到高峰，与果肉中 ABA 的变化趋势（任杰和冷平，2010）基本一致。显示出与果实成熟的密
切相关性。PacNCED1在种子中的表达模式与果肉中基本一致，但其在果实成熟之前的上升速度和
程度（从盛花后 29 d到盛花后 36 d上升了 54倍）均显著高于果肉（从盛花后 29 d到盛花后 36 d
上升了 7.3倍）。果柄中 PacNCED1的表达总体上表现出逐渐上升的趋势，在果实完熟阶段达到最高，
与果柄中 ABA的变化（任杰和冷平，2010）一致。
甜樱桃果实 PacNCED1 的表达与 ABA 变化的一致性说明 PacNCED1 可能调控了甜樱桃果实
ABA的合成。
6期 任 杰等：甜樱桃果实 NCED基因的克隆及其表达 895
图 2 PacNCED1基因在甜樱桃果实成熟过程中表达的定量 RT-PCR分析
Fig. 2 Real time RT-PCR analysis of expression of PacNCED1 during the sweet cherry fruit ripening
2.3 PacNCED1在营养组织中的表达
为了研究环境胁迫能否诱导甜樱桃营养组织中 PacNCED1的表达，研究了甜樱桃失水叶片以及
根中 PacNCED1的表达模式。结果显示，PacNCED1在叶片和根中都有表达，当叶片失水 30%时，
PacNCED1的表达急剧上升。定量 RT-PCR显示，PacNCED1在失水 30%的叶片中的相对表达量比
未失水叶片中上升了约 20倍，表现出与失水胁迫的相关性（图 3）。
图 3 PacNCED1基因在甜樱桃叶片和根中表达的 RT-PCR分析（左）以及定量 RT-PCR分析（右）
Fig. 3 RT-PCR（left）and Real time RT-PCR（right）analysis of expression of PacNCED1 in leaves and roots

2.4 ABA、乙烯利、IAA和NDGA处理对PacNCED1在果实中表达的影响
从图 4中可以看出，外源 ABA和乙烯利能增强 PacNCED1在果实中表达，但 ABA处理效果显
著高于乙烯利处理，这与外源 ABA和乙烯利处理能提高甜樱桃果实的内源 ABA含量（任杰和冷平，
2010）相一致。与对照相比，用 NDGA抑制 NCED酶的活性，并不影响 PacNCED1在果实中的表
达。IAA对于果实中 PacNCED1的表达也没有显著影响。
图 4 ABA、乙烯利、IAA和 NDGA处理对 PacNCED1基因在甜樱桃果实中表达的影响的定量 RT-PCR分析
Fig. 4 Real time RT-PCR analysis of effects of ABA，ethephon，IAA and NDGA on the expression of PacNCED1 in sweet cherry fruit

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3 讨论
现在已经证明由 9′–顺–环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）催化的顺–环氧类胡萝卜素向黄
氧素的转化是高等植物中 ABA合成的限速步骤（Tan et al.，1997；Burbidge et al.，1999；Iuchi et al.，
2001）。同样也已经证明由 ACC 氧化酶（ACO）催化的 ACC 向乙烯的转化是乙烯合成的限速步骤
（Barry et al.，1996；Nakatsuka et al.，1998）。本研究从甜樱桃果实中克隆了一个编码 NCED的 cDNA
中间片段及其 3′末端序列，命名为 PacNCED1。同时克隆了一个编码 ACO 的 cDNA 片段，命名为
PacACO1。推测的 PacNCED1和 PacACO1氨基酸序列与其它物种 NCEDs和 ACOs具有很高的同源
性。
在甜樱桃果实成熟的所有阶段均未检测到乙烯的产生（任杰和冷平，2010），本研究中，在甜
樱桃果实成熟的所有阶段也均未检测到 PacACO1 的表达，这与甜樱桃果实发育过程中乙烯的缺乏
是相一致的，也可以在分子水平上解释甜樱桃果实成熟过程中乙烯的缺乏。外源乙烯利和 ABA 处
理能诱导 PacACO1的表达，这与外源乙烯利和 ABA处理能诱导甜樱桃果实乙烯的产生也是相一致
的（任杰和冷平，2010）。甜樱桃果实成熟过程中 PacACO1的不表达进一步从分子水平上证明了乙
烯可能并不参与甜樱桃果实的成熟进程。
ABA 存在于甜樱桃果实发育的所有时期以及不同部位，因此 PacNCED1 在甜樱桃果实发育的
所有时期和不同部位也持续表达，但在不同成熟期的相对表达量不同，在果实成熟之前果肉和种子
中 PacNCED1 的表达达到高峰，与 ABA 的变化一致。表现出与果实成熟的相关性。在果柄中
PacNCED1 的表达逐渐上升，至完熟期达到最高，和果柄中 ABA 的变化相一致，而果实完熟时果
柄中高 ABA含量能够导致果实的脱落（Sagee et al.，1980；Aneja et al.，1999）。因此果柄中 PacNCED1
的表达的持续上升可能与果实完熟后的脱落有关。此外，外源 ABA 处理促进了甜樱桃果实中
PacNCED1基因的表达和内源 ABA的合成（任杰和冷平，2010）。这些结果说明 PacNCED1可能调
控了甜樱桃果实中 ABA 的合成。PacNCED1 在果肉中的表达趋势在 2008 年和 2009 年基本一致，
这说明在果肉中 PacNCED1是发育调控的。
迄今为止，有关 NCED基因在果实中的表达在鳄梨（Chernys & Zeevaart，2000）、柑橘（Rodrigo
et al.，2006）、葡萄（Wheeler et al.，2009；Zhang et al.，2009b）和番茄（Zhang et al.，2009a）上已
有报道，在鳄梨中 PaNCED1、PaNCED3 在果实成熟过程中表达，与果实成熟相关。在柑橘中
CsNCED1在果实成熟过程中表达，表现出与果实成熟的相关性。但是只有 PaNCED1和 CsNCED1
在干旱胁迫叶片中表达。同样失水胁迫也能强烈诱导 PacNCED1 在甜樱桃叶片中的表达。这说明
PacNCED1的表达不仅是发育调控的，也是环境调控的。在番茄中，LeNCED1只在破色期表达，与
ABA 合成高峰的时期一致。在番茄果肉和种子中 LeNCED1 的起始表达的时期早于 ACC 合成酶
LeACS2、LeACS4以及 ACC氧化酶 LeACO1。
此外，外源 ABA 能促进番茄果实 LeACS2、LeACS4 和 LeACO1 提前表达和表达量的上升，而
抑制番茄果实内源 ABA 的合成则会导致番茄果实 LeACS2、LeACS4 和 LeACO1 表达量的下降。这
说明在番茄果实成熟过程中，ABA 较乙烯可能具有更重要的功能，ABA 可能触发了番茄果实乙烯
的合成（Zhang et al.，2009a）。
甜樱桃作为一种非跃变型果实，其在成熟过程中并没有检测到乙烯的产生，但是外源 ABA 处
理同外源乙烯利处理一样能够诱导甜樱桃果实中 PacACO1 的表达和乙烯的产生（任杰和冷平，
2010）。同样，外源 ABA处理也能促进 PacNCED1的表达和甜樱桃果实内源 ABA含量的增加（任
杰和冷平，2010），由此可以看出，ABA 不仅在非跃变型果实的成熟过程中发挥重要作用，在跃变
6期 任 杰等：甜樱桃果实 NCED基因的克隆及其表达 897
型果实的成熟过程中同样发挥重要作用。作者所在实验室已经构建了番茄果实特异性 NCED RNAi
干扰载体，并且获得了转化植株（王玲 等，2009），以期利用转基因手段进一步证明 ABA 在果实
成熟过程中的作用。
用 NDGA 抑制 NCED 酶的活性并不影响 PacNCED1 在果实中的表达。IAA 对于果实中
PacNCED1的表达也没有显著影响。但是对猪殃殃（Galium aparine）的研究表明 IAA是 NCED基
因表达的最初扳机，IAA以及生长素类除草剂能够促进茎段组织 GaNCED1基因的表达（Kraft et al.，
2007）。这可能是因为 NCED 基因在果实和茎段组织等营养器官中具有不同的表达调控机制，也可
能与 IAA浓度差异有关。

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“中国园艺学会石榴分会成立大会暨首届全国石榴生产与
科研学术研讨会”征文通知

“中国园艺学会石榴分会成立大会暨首届全国石榴生产与科研学术研讨会”拟于 2010年 9月召开（具体时间、
地点另行通知），现征集会议论文。征文范围：（1）石榴资源收集、鉴定与利用；（2）石榴新品种；（3）石榴生物技
术；（4）石榴栽培生理及技术研究；（5）石榴品种比较与试验总结；（6）石榴遗传育种、栽培技术研究等专题综述；
（7）石榴产业发展论坛；（8）石榴加工贮藏；（9）石榴营销；（10）石榴专业合作社；（11）石榴机械；（12）石榴
安全生产；（13）石榴生物农药、生防产品；（14）石榴标准园建设；（15）石榴有机产品认证及生产规程等。
截止日期：2010年 9月 1日（以收到日为准）。每篇限 4 000 ~ 5 000字，格式参照《果树学报》。需同时交电子
版和文字稿，电子版以 word格式发到下列邮箱，入选论文将编入会议论文集。

地 址：河南省郑州市航海东路南中国农业科学院郑州果树研究所
邮 编：450009
收件人：中国园艺学会石榴分会秘书处
E-mail：liuliclass7@163.com；zgggyj@163.com；s.y.cao@163.com
联系人：刘 丽；郭俊英；曹尚银
电 话：0371-65330990；0371-65330963；13526652449；13783622357

中国农业科学院郑州果树研究所（代章）
2010–05–18