全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（12）：2261–2272 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–07–20；修回日期：2011–11–30
基金项目：国家自然科学基金项目（30871690）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：ywteng@zju.edu.cn）
梨属叶绿体非编码区 trnL-trnF 和 accD-psaI 特
征及其在系统发育研究中的应用价值
胡春云，郑小艳，滕元文*
（浙江大学园艺系，农业部园艺植物生长发育与品质调控重点开放实验室，杭州 310058）
摘 要：对梨属 19 个种共 26 个供试样本及两个苹果属外类群样本的叶绿体非编码区 trnL-trnF 和
accD-psaI 进行了序列分析。排列后的序列长度分别为 927 bp 和 944 bp。两个区域组合后共有 36 个核苷
酸替换（substitution）和 11 个插入/缺失（indel）。将所有 indel 处理为一次变异事件并编码为替换，用于
简约法系统树和 NeighborNet 系统发育网络（phylogenetic networks）的构建。研究结果表明：indel 为系
统发育分析提供了可靠的信息；相比 trnL-trnF，accD-psaI 因进化速率较快，更适合应用于种及种以下分
类水平的梨属植物系统关系研究；NeighborNet 系统发育网络表明系统树上部分较低的分支支持率由冲突
的信息引起，其余则由信息位点不足引起。此外结果还揭示了可疑种间杂交种的母系祖先。
关键词：梨属；trnL-trnF；accD-psaI；长度突变；系统关系
中图分类号：S 661.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）12-2261-12

Characterization and Phylogenetic Utility of Non-coding Chloroplast
Regions trnL-trnF and accD-psaI in Pyrus
HU Chun-yun，ZHENG Xiao-yan，and TENG Yuan-wen*
（The State Agricultural Ministry Key Laboratory of Horticultural Plant Growth，Development and Quality Improvement，
Department of Horticulture，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）
Abstract：The two non-coding chloroplast regions，trnL-trnF and accD-psaI of 26 accessions from 19
Pyrus L. species and two outgroup accessions from Malus Mill. were sequenced. Aligned lengths of these
two regions were 927 bp and 944 bp，respectively. A total of 36 substitutions and 11 indels were obtained
in the combined data. All of the indels were treated as single mutation events and coded as substitutions
manually when conducting maximum parsimony and Neighbor Net（NN）analyses. Our results showed that
the indels in these two cpDNA regions were reliable phylogenetic characters and increased phylogenetic
resolution；Compared with trnL-trnF，accD-psaI evolves quicker，providing more information for the
discovery of inter- and intra-specific relationships in Pyrus. The NN split network indicated that the poor
resolution in the phylogenetic tree was partly caused by conflicting signals or by lack of sufficient
informative site. In addition，maternal lineages of putative inter-specific hybrids were revealed.
Key words：Pyrus；trnL-trnF；accD-psaI；indel；phylogenetic relationship

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梨属（Pyrus L.）植物属于蔷薇科（Rosaceae），苹果亚科（Maloideae）或者梨亚科（Pomoideae），
起源于第三纪甚至更早时期，其起源中心可能位于中国西部及西南部山区（Rubtsov，1944）。根据
其原生分布，一般将梨属植物分为东方梨（Oriental pears）和西方梨（Occidental pears）（Bailey，1917；
Rubtsov，1944）。前者分布范围从天山和兴都库什山脉向东延伸到日本；后者主要分布在欧洲、北
非、小亚细亚、伊朗、中亚和阿富汗等地区。
早期的梨属植物分类主要是基于形态特征（Rehder，1915；Bailey，1917；Rubtsov，1944），但
由于种间缺乏足够的形态差异，且广泛的种间杂交产生了大量过渡类型，使得基于形态学指标的种
的界定和系统发育重建较为困难。有学者尝试利用其他特征，如化学成分（Challice & Westwood，
1973）、同工酶（林伯年和沈德绪，1983；Jang et al.，1991）、花粉超微结构（Westwood & Challice，
1978；邹乐敏 等，1986）等来解决梨属植物系统关系。但这些方法特征位点少，多态性差，准确度
不高。因此，梨属植物种间关系至今没有得到很好的解决，栽培系统的起源和演化以及一些可疑的
种间杂种的起源仍不明确（Rubtsov，1944；Iketani et al.，1998；Katayama & Uematsu，2006；
Yamamoto & Chevreau，2009）。如基于形态特征和自然分布的调查，中国分类学家认为褐梨（P. ×
phaeocarpa Yu）、麻梨（P. × serrulata Rehd.）、新疆梨（P. × sinkiangensis Yu）和河北梨（P. × hopeiensis
Yu）均为自然杂交所形成（俞德浚和谷粹芝，1974），但这些种确切的祖先无法通过单一的形态特
征加以明确。
近 10 多年来，以 DNA 为基础的分子标记陆续应用于梨属植物的系统发育研究。RFLP（Iketani
et al.，1998）、RAPD（Teng et al.，2001，2002；Kim et al.，2005）、AFLP（Dolatowski et al.，2004；
Bao et al.，2008）、SSR（Kimura et al.，2002；Bao et al.，2007；Katayama et al.，2007；Wunsch &
Hormaza，2007）等分子标记在解决梨属植物亲缘关系、栽培品种遗传多样性和种质鉴定方面都得
到了很好的应用，但它们在研究种间关系和杂种起源问题上仍存不足。基于 RAPD 的结果表明新疆
梨的起源涉及多个东西方梨种的杂交（Teng et al.，2001），而其它可疑杂种的起源仍待研究。由于
叶绿体 DNA（cpDNA）在大部分被子植物中为母系遗传，所以有助于了解可疑杂种的母系背景。
但其编码区高度保守，仅适合科内、科间乃至整个被子植物的较高分类阶元的系统发育研究，而非
编码区（基因间区和内含子）受功能约束少，适用于种间及种以下水平的植物系统关系重建（Clegg
et al.，1994；Small et al.，1998；Shaw et al.，2007）。目前，叶绿体非编码区在梨属系统关系研究中
得到了初步应用。Kimura 等（2003）测定了 5 个梨属种的 8 个品种的 6 个叶绿体非编码区序列，在
总长 5.7 kb 的序列中共发现了 38 处突变，包括 21 个核苷酸替代及 17 个插入/缺失（indel），其中
trnL-trnF 显示了最高的变异率。而后 Sharifani 等（2008）及郑小艳（2008）应用 trnL-trnF 序列分
别对原产伊朗的梨属植物种和几个主要东亚原产种进行了系统关系研究。Katayama 等（2007）应用
accD-psaI 序列对日本梨品种、部分东方梨和西方梨种进行研究，发现了 219 bp 的 indel。但应用叶
绿体非编码区序列进行系统发育研究时存在一些难题，尤其是对 indel 的处理。不同学者对于是否
可以将 indel 加入到系统发育研究中的观点及处理方式都不尽相同（Barkman & Simpson，2002；
Takayama et al.，2005；Simmons et al.，2007；Sotuyo et al.，2007；Egan & Crandall，2008；Wu et
al.，2010）。前述关于梨属植物的 cpDNA 序列分析的研究中，并没有将 indel 进行任何处理就直接
加入到了系统发育研究中。
基于上述研究背景，本研究中选用东、西方梨的部分代表种样本，对两个已知的长度较长，信
息位点比例较高的叶绿体非编码区 trnL-trnF 及 accD-psaI 进行相关的序列分析。主要研究目的：1）
了解 indel 是否能够提供可靠的系统发育分析信息，比较这两段序列在梨属系统发育研究中的适用
性；2）初步阐明部分东方梨杂种的母系背景。
12 期 胡春云等：梨属叶绿体非编码区 trnL-trnF 和 accD-psaI 特征及其在系统发育研究中的应用价值 2263

1 材料与方法
1.1 材料
供试材料于 2006—2010 年采自各地资源圃（表 1）。选用东方梨和西方梨共 19 个种，26 个样品。
东方梨包含除杏叶梨外的所有 12 个原产中国的种、原产日本的日本青梨（P. hondoensis Nakai et
Kikuchi）和日本豆梨（P. dimorphophylla Makino）。西方梨包含了两个欧洲种[雪梨（P. nivalis Jacq.）
和西洋梨的一个变种（P. communis var. pyraster L.）]，两个西亚种[胡颓子梨（P. elaeagrifolia Pall）
和桃叶梨（P. amygdaliformis Vill.）]，一个北非种（P. cossonii Rehder）。此外还选用了两个苹果属
的丽江山荆子（Malus rockii Schneid.）和‘国光’苹果（Malus. domestica Borkh.）作为外类群。

表 1 梨属植物样品及外类群的基本资料
Table 1 Overview of investigated species and cultivars of Pyrus and outgroup samples
编号
Code
样品
Accessions
种名
Species
起源地
Origin
采样地
Leaf source
东方梨 Oriental pears
1 鸭梨 Yali 白梨 P. pyrifolia Chinese white pear group 河北 Heibei，China TU
2 砀山酥梨 Dangshan Suli 白梨 P. pyrifolia Chinese white pear group 安徽 Anhui，China ZZFI
3 库尔勒香梨 Korla Xiangli 新疆梨 P. sinkiangensis 新疆 Xinjiang，China CPGP
4 二十世纪 Nijisseiki 砂梨 P. pyrifolia 日本千叶县 Chiba Pref，Japan TU
5 火把梨 Huobali 砂梨 P. pyrifolia 云南 Yunnan，China CPGR
6 南果梨 Nanguoli 秋子梨 P. ussuriensis 辽宁 Liaoning，China TU
7 满园香 Manyuanxiang 秋子梨 P. ussuriensis 辽宁 Liaoning，China CPGR
8 锦西山梨 1（野生秋子梨）
P. ussuriensis 1
秋子梨 P. ussuriensis 辽宁 Liaoning，China CPGR
9 川梨 1 P. pashia 1 川梨 P. pashia 云南 Yunnan，China HRIYN
10 尼泊尔川梨 P. pashia 2 川梨 P. pashia 尼泊尔 Nepal TU
11 日本豆梨 P. dimorphophylla 日本豆梨 P. dimorphophylla 日本三重县 Mie Pref，Japan TU
12 豆梨 1 P. calleryana 1 豆梨 P. calleryana 中国中南部 Central and Southern China ZJTT
13 豆梨 2 P. calleryana 2 豆梨 P. calleryana 中国中南部 Central and Southern China ZJLA
14 杜梨 1 P. betulaefolia 1 杜梨 P. betulaefolia 甘肃 Gansu，China CPGR
15 杜梨 2 P. betulaefolia 2 杜梨 P. betulaefolia 宁夏 Ningxia，China CPGR
16 麻梨 P. serrulata 麻梨 P. serrulata 河北 Hebei，China CPGR
17 滇梨 P. pseudopashia 滇梨 P. pseudopashia 云南 Yunnan，China HRIYN
18 兰州木梨 P. xerophila 兰州木梨 P. xerophila 甘肃 Gansu，China GPI
19 河北梨 P. hopeiensis 河北梨 P. hopeiensis 河北 Hebei，China HB
20 褐梨 P. phaeocarpa 褐梨 P. phaeocarpa 中国北部 North China CPGR
21 日本青梨 P. hondoensis 日本青梨 P. hondoensis 日本中部 Middle Japan TU
西方梨 Occidental pears
22 雪梨 P. nivalis 雪梨 P. nivalis 欧洲 Europe TU
23 P. cossonii P. cossonii 阿尔及利亚 Algeria TU
24 P. communis var. pyraster P. communis var. pyraster 欧洲 Europe TU
25 桃叶梨 P. amygdaliformis 桃叶梨 P. amygdaliformis 地中海地区，南欧
Mediterranean area，South Europe
TU
26 胡颓子梨 P. elaeagrifolia 胡颓子梨 P. elaeagrifolia 土耳其，克里木半岛，南欧
Turkey，Crimea，South Europe
TU
外类群 Outgroup species
27 国光 Ralls 苹果 Malus domestica 美国 USA GPI
28 丽江山荆子 Malus rockii 丽江山荆子 Malus rockii 云南 Yunnan，China HRIYN
注：TU：日本鸟取大学；CPGR：中国国家梨种质资源圃；ZZFI：中国郑州果树研究所；HRIYN：云南省园艺科学研究所；GPI：甘
肃果树研究所；ZZTT：浙江天台；ZJLA：浙江临安；HB：河北。
Note：TU：Tottori University，Japan；CPGR：China Pear Germplasm Repository；ZZFI：Zhengzhou Fruit Institute，Chinese Academy of
Agriculture Sciences；HRIYN：Horticultural Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences；GPI：Gansu Pomology Institute，
Gansu Academy of Agricultural Science；ZZTT：Tiantai，Zhejiang；ZJLA：Lin’an，Zhejiang；HB：Hebei.
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1.2 基因组 DNA 的提取、叶绿体非编码区扩增和测序
应用改良 CTAB 法提取梨叶片基因组 DNA（Doyle & Doyle，1987），在 1%的琼脂糖上电泳检
测 DNA 浓度和质量，结合分光光度计的 DNA 浓度检测将模板稀释到 10 ~ 30 ng · µL-1，存放于–20 ℃
用于后续研究。
应用 Small 等（1998）设计的引物进行 accD-psaI 基因间区的扩增，得到部分序列后，进一步在
5′端设计新引物 F2（5′CTTATTCGATCCAATCGTACCAC3′），以扩增得到变异率较高的基因区域并
减少该片段的长度。应用 c 和 f 引物（Taberlet et al.，1998）扩增包含 trnL-trnF 和 trnL 内含子的区
域（以下简称 trnL-trnF）。
PCR 扩增反应总体积为 50 μL。其中包含 2.0 mmol · L-1 的 MgCl2，0.2 mmol · L-1 的 dNTP，0.4
μmol · L-1 的上下游引物，20 ~ 50 ng 的基因组 DNA 模板，2 U 的 Taq DNA 聚合酶（TaKaRa
Biotechnology Company Co.，Ltd.，Japan）和 1 × buffer（TaKaRa 提供）。反应程序为 94 ℃预变性 4
min；94 ℃变性 40 s，58 ℃复性 60 s，72 ℃延伸 80 s，35 个循环；最后 72 ℃延伸 7 min。trnL-trnF
扩增中 55 ℃复性 60 s，其余同上。
PCR 产物经纯化后选用上下游引物对两个片段进行直接测序。纯化和测序反应均由上海生工生
物技术服务有限公司进行。经初步的序列分析，对存在单一突变的样本进行重复 PCR 和测序，以减
少因错配得到的核苷酸变异。
1.3 序列分析及系统发育分析
将 trnL-trnF和 accD-psaI两个区域单独或组合后进行下述分析。应用Clustal X（Thompson et al.，
1997）进行序列排列，并进行人工校正。随后通过 BioEdit V 5.0.6（Hall，1999）计算序列长度、G +
C 含量和序列分化度。
本研究将所有 indel 处理为一次突变事件，在 SeqState1.4.1 软件（Muller，2005）的辅助下将其
编码为二元性状 0（缺失）或 1（插入），用 INDEL-1，2，3……表示。进一步将其人工编码为核苷
酸替代（A/T），应用 PAUP4.0b4（Swofford，2003）构建基于最大简约法（Maximum parsimony，
MP）和邻接法（Neighbor joining，NJ）的系统树。进行 MP 分析时，采取无穷式搜索（heuristic search）
法（TBR，Multress，Maxtrees = 100）寻找最优树，为了检测进化支的支持率，进行了 1 000 次自展
重复。NJ 分析选用 K2P 距离法，并进行 2 000 次自展检测支持率。应用 SplitsTree 4（Huson & Bryant，
2006）软件，基于 uncorrected p-distances 的 NeighborNet（NN）法构建 NN split 系统发育网络。
2 结果与分析
2.1 两个区域的序列特征
两个 cpDNA 序列在所有供试样品中顺利得到扩增和测序。trnL-trnF（含 trnL 内含子）区排列
后为 927 bp，发现两个 indel，G + C 含量为 30.5% ~ 30.8%，而 accD-psaI 区排列后为 944 bp，G + C
含量为 24.8% ~ 25.7%（表 2）。两个区域的组合序列排列后总长为 1 871 bp，去掉保守位点后共有
47 个变异位点（图 1）。所有 11 个 indel（9 个来自 accD-psaI 区）同时为两个样本所共有，因此也
为简约信息（Parsimony informative，PI）位点。除 INDEL-1（10 bp）、INDEL-6（1 bp）和 INDEL-7
（229 bp）外，其它 8 个 indel（8 ~ 23 bp）均为邻接区域的简单序列重复（simple sequence repeats，
> 3 nt）。如 INDEL-9 为 22 bp 的序列重复‘TATTTATTGTATTTTATTAATT’，而 INDEL-10 为 20 bp
的序列重复‘ATTTATATATTTATTGTATT’。将所有不同长度的 indel 均处理为一次变异事件，并编
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码为替换用于后续的系统发育分析中。比较特殊的是 INDEL-7，其长度为 229 bp，该片段中包含了
5 个 PI 位点和 5 个单突变（singleton）位点（图 1，第 28 至 37 位点）。为了保留这些变异位点，对
缺失该 229 bp 的序列，以与其关系最近的序列作为参照，进行了严格序列补足。

表 2 梨属及外类群样品 trnL-trnF 和 accD-psaI 序列特征
Table 2 Characteristics of trnL-trnF and accD-psaI in Pyrus and outgroup samples
序列特征
Sequence
characteristics
长度范围/bp
Length
range
排列长/bp
Aligned
length
G + C 含/%
G + C
content
range
替换总数
（PI 位点数）
Total number
of substitution
（PI sites）
插入/缺失总数
（PI 位点数）
Total number
of indels
（PI sites）
树长
Tree
length
一致性
指数
Consisten
cy index
（CI）
维持性
指数
Retention
index
（RI）
trnL-trnF 917 ~ 927 927 30.5 ~ 30.8 13（11） 2（2） 15 1.0000 1.0000
accD-psaI 661 ~ 913 944 24.8 ~ 25.7 23（9） 9（9） 33 0.9697 0.9767
组合序列
Combined
sequence
1 578 ~ 1 840 1 871 27.8 ~ 28.5 36（20） 11（11） 50 0.9400 0.9663


图 1 所有供试样本（含苹果属）在 trnL-trnF、accD-psaI 中的变异位点
上边：47 个位点顺序；1 ~ 7 位点：trnL 内含子；8 ~ 15 位点：trnL-trnF 基因间区；16 ~ 47 位点：accD-psaI 基因间区；
下边：11 个 indel 编号；排列中的 0 和 1 分别表示相应 indel 为缺失或插入。
Fig. 1 The shared variations in trnL intron，trnL-trnF，accD-psaI regions among accessions
Upside：The order of 47 variation sites；Site 1 to 7：trnL intron；Site 8 to 15：trnL-trnF；Site 16 to 47：accD-psaI；
Underside：Numbering of 11 indels；0 and 1 in the alignment indicate deletion and insertion for certain indel，respectively.
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2.2 系统发育分析
以苹果属的两个样品作为外类群，采用最大简约法（MP）和邻接法（NJ）所构建的系统树基
本一致，本研究中只展示最大简约法构建的 50%多数决定原则一致树（图 2）。该系统树一致性指数
（Consistency index，CI）为 0.94，维持性指数（Retention index，RI）为 0.9663。系统树以较高的
支持率将所有样品分为 3 组，东方梨组（Oriental pears）、西方梨组（Occidental pears）及外类群
（Outgroup）。苹果属外类群样品丽江山荆子和‘国光’因其特有的 8 个替换和 3 个 indel（图 1）而
与梨属植物关系较远。


图 2 基于叶绿体非编码区 trnL-trnF 和 accD-psaI 组合序列构建的 50%多数决定原则一致树
支上的数字为 1 000 次自展支持率（%），支上的实心框表示该分支样本共享的 indel。
Fig. 2 50% Majority-rule consensus tree based on the combined sequences of trnL-trnF and accD-psaI
The bootstrap value was shown above the branch where > 50%；
The solid boxes in the branch indicate indels shared by the corresponding accessions.

东方梨和西方梨各自聚合成为支持率很高的两个单系（monophyletic）类群，在西方梨中，P.
cossonii，P. communis var. pyraster 和雪梨因共享 INDEL-8 以 64%的支持率聚合，显示了较近的亲缘
关系。东方梨样本以较高的支持率（95%）形成两大支。支 A 中锦西山梨 1（野生秋子梨）、日本
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豆梨、河北梨和褐梨在 INDEL-1 处为缺失，区别于其它东方梨。此外，这 4 个样本在 INDEL-2 处为
插入，同西方梨和外类群显示了较近的关系，这些互相冲突的信息使得支 A 所获得的支持率较低
（62%）。其余东方梨均在另一大支中：‘鸭梨’、‘砀山酥梨’、‘二十世纪’和尼泊尔川梨因在
（INDEL-7）处共同表现为 229 bp 的缺失而聚合成为支 B1；麻梨及杜梨 1 和上述 4 个样本共享第
15 位点替换（图 1）而与支 B1 关系较近，但支持率较低，暗示了其它冲突信息位点的存在。支 B2
中‘库尔勒香梨’、‘火把梨’、‘南果梨’、‘满园香’、日本青梨及川梨 1 因共享 INDEL-9 而聚合，
其中川梨 1 同时包含特有替换，因此支 B2 获得的支持率也较低。而两个豆梨样本、杜梨 2、滇梨和
兰州木梨因缺乏 PI 位点，其系统位置及与其它样本间的关系并不明确。
基于 MP 构建的系统树并没有理想解决种间系统关系，且一些冲突的 PI 位点可能使得分支支持
率较低。为了更清楚地揭示梨属种间系统关系，并进一步明确低支持率的原因是由于信息位点的冲
突或不足，构建了 NN split 网络。如图 3 所示，NN split 网络所展示的结构大多呈树状分支，并与
MP 系统树结构相一致。但发现了少量因冲突信息位点产生的分裂（split）而引起的矩形结构：杜梨
1 和 P. cossonii 因 INDEL-5 连接成一个分裂，成为连接东西方梨的桥梁。麻梨和杜梨 1 因共享第 13
位点的替换而连接成为另一个分裂。上述序列进化信息在基于分支系统学的系统树上无法形象地呈
现，而只是表现为相应分支支持率的降低。同时也明确了其余支持率较低的分支和没有解决的系统
关系原因是由于系统发育信息位点的缺乏。

图 3 基于 uncorrected p-distances 的 NeighborNet 法构建的 NN split 系统发育网络
红边表示由 INDEL-5 产生的连接杜梨 1 和 P. cossonii 的一个分裂。
Fig. 3 The NeighborNet split network based on uncorrected p-distances
The edge in red indicates the split produced by INDEL-5 and connecting P. betulaefolia 1 and P. cossonii.
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3 讨论
3.1 梨属 trnL-trnF 和 accD-psaI 中 indel 的特征和处理方式
indel 会造成 DNA 序列排序后的空位（gap），在系统发育分析中，对于 indel 是否可用存在争
议。近年来的研究表明叶绿体非编码区中的 indel 大多是可靠的，一些研究者认为 indel 的异源同型
（homoplasy）水平比替换低，即在同样位置发生同一 indel 事件的序列具有共同的起源祖先。在一
些研究中发现 indel 相比替换能提供更多的变异信息（Egan & Crandall，2008）。
本研究中，两个叶绿体非编码区包含了 36 个替换，其中 20 个为 PI 位点（56%），而 11 个 indel
全部为 PI 位点（表 2），这些 indel 无疑为阐明梨属植物种间关系提供了重要信息来源。如 INDEL-9
和 INDEL-10 均为简单序列重复，是发生在同一祖先序列上的两次单独的突变事件。这两个 indel 发
生在相邻的位置，因此应用 Clustal 较难排序，不容易分辨真正的 indel 事件。有学者认为简单序列
重复是由 DNA 复制过程中滑移错配（Slipped-strand misparing）形成的（Levinson & Gutman，1987；
Kelchner，2000），其它学者推测有其它的机制并认为简单序列重复（nt > 3）有很强的插入偏好
（insertion bias），一旦获得该重复之后将很难丢失，因此认为具有相同 indel 的序列起源于共同的祖
先（Borsch & Quandt，2009）。
从系统树（图 2）的拓扑结构可以推测这两个独立的 indel 分别发生在东方梨和西方梨分化过程
中，为系统发育分析提供了有效的信息位点。
如前所述，本研究中发现的大多数 indel 为简单序列重复，因此当 Clustal 等软件无法对类似序
列进行合理排序时，有必要进行人工排序，以辨别真正的 indel 事件。完成正确排序后，如何处理
gap 也各不相同。
主要的处理方法有以下几种：1）将空位区片段直接去除，2）将空位处理为缺失（missing data）；
3）将空位作为第 5 性状（the fifth character）；4）对空位进行单独编码（Barkman & Simpson，2002；
Takayama et al.，2005；Simmons et al.，2007；Sotuyo et al.，2007；Egan & Crandall，2008；Wu et
al.，2010）。
不同的处理方式会对系统发育分析造成不同的影响。若将 indel 直接去除或处理为缺失，不仅忽
略了 indel 本身所带的进化信息，有时还会将包含在 indel 内的核苷酸替换信息完全忽略，如 229 bp
长的 INDEL-7 中的 5 个 PI 位点和 5 个 singleton 位点。如果对空位不进行任何处理，并在 PAUP 的
MP 分析中将其处理为第 5 性状时，indel 序列越长，其产生的信息性状越多，这无疑大大增加了其
权重（Simmons & Ochoterena，2000；Young & Healy，2003）。目前，学者们已经认同无论 indel
有多长，均应将其处理为一次突变事件的观点，并借助如 SeqState 的软件进行编码才能用于系统发
育分析中（Simmons & Ochoterena，2000；Young & Healy，2003）。
本研究结合 Clustal 和人工排序正确地判断了 indel 事件，将所有 indel 处理为一次变异事件并编
码为替换（Caicedo & Schaal，2004；Wang et al.，2010）用于系统发育分析中，比较科学合理。
INDEL-7 为 229 bp 的大片段突变，在 5 个东方梨中表现为缺失（图 1），且该 indel 与 10 bp 长
的重复单元插入（INDEL-8）紧邻。在 Katayama 等（2007）的研究中仅发现了 219 bp 的 indel，可
以推测在其研究中由于排序不当，并没有正确识别独立起源的 indel 事件。
本研究中首先将该 indel 处理为一次突变事件，然后通过人工补充严格序列保留了其中的 11 个
替换，因此相比以往的研究（Kimura et al.，2003；Katayama et al.，2007；Sharifani et al.，2008）更
合理。
12 期 胡春云等：梨属叶绿体非编码区 trnL-trnF 和 accD-psaI 特征及其在系统发育研究中的应用价值 2269

3.2 梨属系统发育及可疑杂种的母系祖先
基于叶绿体非编码区 trnL-trnF 和 accD-psaI 组合序列的系统发育树进一步从母系进化背景上证
实了东方梨和西方梨独立进化的观点（Rubtsov，1944；Challice & Westwood，1973；Iketani et al.，
1998；Teng et al.，2002；Bao et al.，2007；Zheng et al.，2008）。
从图 1 可知，西方梨比东方梨多保留了一个苹果属特有的序列信息位点，而苹果属被认为是较
梨属原始的一个近缘属（Rubtsov，1944），因此推测西方梨起源的时间比东方梨稍早，或者西方梨
种分化过程中经历了不同的进化模式，使其 DNA 水平的变异速率较慢。但这一推论仍需要基于核
基因序列及其它古生物学资料进一步探讨和论证。
Challice & Westwood（1973）认为，杜梨和 P. cordata Desv.可能是梨原种的后代，这两个物种
在后来的东、西方梨的各自分化中扮演了重要角色。P. cossonii 被认为与 P. cordata 是同物异名
（Aldasoro et al.，1996）。本研究的 NN split 网络分析也支持了杜梨和 P. cossonii 是连接东方梨和西
方梨的过渡种观点。
两个白梨样品‘砀山酥梨’和‘鸭梨’和砂梨品种‘二十世纪’的两个 cpDNA 区序列完全一
致，均在 INDEL-7 处表现为 229 bp 的缺失，显示了白梨和砂梨之间密切的关系，这和基于 RAPD、
SSR 和 AFLP 等 DNA 分子标记所得出的结论相同（Teng et al.，2002；Bao et al.，2007）。
在 Katayama 等（2007）的研究中也发现绝大多数日本梨品种如‘长十郎’（‘Chojuro’）、‘二十
世纪’（‘Nijisseiki’）、‘晚三吉’（‘Okusankichi’）、‘丰水’（‘Housui’）等和‘鸭梨’都表现为缺失，
而西洋梨、秋子梨（P. ussuriensis）、豆梨及胡颓子梨中则表现为插入，本研究结果与之相一致。
但由于本研究中涉及的品种较少，并不能代表其广泛的地理分布特性，且由于缺乏野生砂梨的样本，
因此，白梨和砂梨品种间的关系仍需要进一步通过广泛取样来阐释。
叶绿体序列在梨属中均为母系遗传，反映了母系进化的历史，因此可以推测可疑杂交种的母系
祖先。‘库尔勒香梨’是新疆梨的著名代表品种。俞德浚和关克俭（1963）认为，新疆梨是西洋梨和
白梨的杂种；基于 RAPD 标记的结果表明新疆梨为东、西方梨的复杂杂交种，可能同时有西洋梨、
杏叶梨（P. armeniacaefolia Yu）、中国白梨或砂梨的血统（Teng et al.，2001）。
本研究中，‘库尔勒香梨’位于支 B，与‘火把梨’的序列完全一致，并和秋子梨、日本青梨等
以 64%的支持率聚合，推测其母本应该为东方梨中的砂梨，而其父本应该为西方梨。基于形态学的
过渡特征，麻梨被认为豆梨和砂梨的杂种，本研究中麻梨单独成支，但因缺失 229 bp 与支 A 中白梨
和砂梨品种的样本亲缘关系较近，因此可以明确的是，如果豆梨参与了麻梨的起源，则扮演的是父
本祖先。麻梨属于自然野生种，分布较广泛，其母系祖先应该为野生型砂梨，但由于本研究中没有
加入野生砂梨样本。因此为了进一步明确麻梨杂交起源，需要采集具有广泛代表性的麻梨、砂梨和
豆梨样本。
同样，褐梨被认为是杜梨和秋子梨的杂种，而河北梨又是褐梨和秋子梨的杂种（俞德浚和关克
俭，1963；Challice & Westwood，1973；俞德浚和谷粹芝，1974）。基于 RAPD 的研究中发现河北梨
和褐梨享有杜梨和秋子梨一些谱带（Teng et al.，2002）。Zheng 等（2008）应用 ITS 序列也发现秋子
梨和河北梨之间存在较近的亲缘关系。
本研究中河北梨、褐梨和野生秋子梨样本（锦西山梨 1）均位于支 A 中，表明它们有共同的母
系祖先。但支 A 中并没有杜梨，可能是杜梨样本不够有代表性，也有可能是杜梨在褐梨和河北梨形
成中充当了父本的角色。上述可疑杂种的确切双亲祖先仍需选用大量的候选样本并结合双亲遗传核
基因的序列分析进行推测。
本研究结合了两个叶绿体非编码区序列，将所有 indel 处理为一次事件并经编码后加入系统发
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育分析中。结果表明 indel 为梨属系统发育关系研究提供了可靠的信息位点。其中 accD-psaI 相比
trnL-F 表现出更好的系统发育应用潜力，可以为阐明梨属种间关系、揭示可疑杂交种的母系进化背
景及野生梨种群结构研究提供重要的数据来源。系统发育网络结构表明在系统树上较低的分支支持
率由冲突的信息或缺乏足够的信息位点所致。
为了能更好地解决梨属种间关系，揭示杂种起源和探讨东、西方梨的进化模式，需要选用更为
广泛的东、西方梨代表种和品种，并同时结合双亲遗传的核基因片段（特别是低拷贝核基因内含子）
进行分析。

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关于召开 2012 年园艺植物染色体倍性操作与
遗传改良学术研讨会的预备通知
自 2008 年 11 月在中国农业科学院郑州果树研究所成功召开园艺植物染色体倍性操作与遗传改良研讨会以来，
我国科研人员在该领域的研究取得了可喜的成绩。为进一步总结近几年来在该领域的研究进展，促进园艺植物倍性
育种研究，同时为该领域的专家、学者和同仁们提供良好的交流平台。中国园艺学会定于 2012 年 4 月中旬在重庆召
开园艺植物染色体倍性操作与遗传改良学术研讨会。欢迎从事该研究领域及相关研究工作人员参加。
大会主题为染色体倍性操作与遗传改良基础、应用研究，分子生物学研究技术在染色体倍性与遗传改良上的应
用等。会议将邀请国内生物学研究领域的院士和知名专家作特邀报告。
会议拟定于 2012 年 4 月中旬召开，会期 3 天，参会代表 200 人左右。
本次研讨会就会议主题广泛征集会议论文（全文或摘要），会议将编印论文集（非正式出版物），论文格式请
按照《园艺学报》的要求撰写，文责自负。论文通过电子邮件形式提交，邮件主题请用“第一作者姓名 + 单位名称”
格式，会务组 E-mail：fruitlab@126.com。
会议论文征集截止时间：2012 年 3 月 16 日，请将参会回执于 2012 年 3 月 30 日发会务组 E-mail：fruitlab@126.com
联系人：何桥（13594231482），汪卫星（13883716907）
其它相关事项将在会议正式通知及中国园艺学会网站中更新。如您有任何问题，请随时与会务组联系：
fruitlab@126.com。

中国园艺学会
西南大学园艺园林学院
2011 年 12 月 1 日