全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (10) : 1425 - 1430
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 05 - 25; 修回日期 : 2009 - 07 - 13
基金项目 : 南京林业大学高学历人才基金项目 (163010065)3 共同第一作者3 3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhangzhen_nj@hotmail1com; Tel: 025 - 84395724)
中国李 pgip启动子的克隆及调控元件分析
李广平 13 , 张长青 33 , 章　镇 23 3 , 曹福亮 1
(1 南京林业大学森林资源与环境学院 , 南京 210037; 2 南京农业大学园艺学院 , 南京 210095; 3 金陵科技学院园艺
系 , 南京 210038)
摘 　要 : 在已克隆中国李 pgip序列的基础上 , 通过染色体步行法获得了该基因上游 1 869 bp的启动子
序列 , 联合生物信息学中的进化印记法和启动子扫描法对克隆的启动子序列进行了调控元件识别。结果报
道了 3个调控元件 : 1个 TGA1结合位点 ( TGACG) 和 2个 WRKY结合位点 ( TGAC)。这为全面揭示 pgip
表达的转录调控机制提供了遗传基础。
关键词 : 中国李 ; pg ip启动子 ; 克隆 ; 调控元件分析
中图分类号 : S 66213　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 1021425206
C lon ing of pgip Prom oter from P runus sa lic ina and the Com puta tiona l Iden ti2
f ica tion of Its Regula tory Elem en t
L I Guang2p ing13 , ZHANG Chang2qing33 , ZHANG Zhen23 3 , and CAO Fu2liang 1
(1 College of Forest Resources and Environm ent, N an jing Forestry U niversity, N an jing 210037, China; 2 College of Horticulture,
N anjing A gricu ltura l U niversity, N anjing 210095, Ch ina; 3D epartm ent of Horticulture, J in ling Institu te of Technology, N anjing
210038, China)
Abstract: Based on the gene sequence of pg ip, we have obtained an up stream fragment of 1 869 bp
length by genome walker from P runus sa licina. U sing the bioinformatics methods, including the phylogenetic
footp rinting and the p romoter scanning, we identified three cis2regulatory elements from pg ip p romoter. One is
the TGA1 site and the others are WRKY sites. Our discoveries will be help to understand the transcrip tional
regulatory mechanism on pg ip exp ression.
Key words: P runus sa licina; p romoter of pg ip; clone; regulatory element analysis
多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 (polygalacturonase inhibiting p rotein, PGIP) 存在于多种植物中 , 是
一种富含亮氨酸重复的细胞壁结合蛋白 , 能专一性抑制真菌内切多聚半乳糖醛酸酶活性 , 促进植物体
内寡聚半乳糖醛酸积累 , 有效抑制真菌病害的发生 (DpiOvidio et al. , 2004) , 因此在植物的抗病育种
中得到广泛应用。
目前国内外关于 pg ip克隆的报道很多 (张开春 等 , 2000; L iang et al. , 2005; 李广平 等 ,
2006a, 2006b; 王家福 等 , 2007; 古英洪 , 2008) , 但关于启动子的研究却很少 , 迄今还仅局限于菜
豆 ( Phaseolus vu lgaris) pg ip启动子的长度研究上 (Devoto et al. , 1998)。
本研究中通过对中国李 pg ip启动子的克隆及其顺式元件分析 , 试图为进一步揭示 pg ip的表达调
控机制提供依据。
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1　材料与方法
111　材料
中国李 ( P runus sa licina L indl. ) 的幼叶于 2009年 2月取自南京农业大学李资源圃。
各种限制性内切酶 , HSTaq酶及 DNA纯化回收试剂盒购自大连宝生物工程公司。 PGEM 2T Easy
载体和 T4 DNA ligase购自 Promega公司。
接头序列 1: 5′2GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT23′, 接头序
列 2: 5′2PO4 2ACCAGCCC2NH2 23′; AP1: 5′2GTAATACGACTCACTATAGGG23′, NAP2: 5′2ACTAT2
AGGGCACGCGTGGT23′; GSP1: 5′2GCTTTACAATGGAGGGTTGGATTGGTC23′, NGSP2: 5′2AATATGGT2
GAGGGAGTTGATGCGGTTT23′。
112　pg ip启动子的克隆
对中国李 pg ip启动子的克隆采用连接介导的染色体步行法。
(1) 将接头序列 1和接头序列 2 (各 50μmol·L - 1 ) 在 10 ×PCR buffer (含 Mg2 + ) 中 95 ℃变性
5 m in, 然后转入 70 ℃的水中 , 室温冷却 , 最后在室温下保持 1 h, 转入 4 ℃保持 12 h。
(2) 取 1μg基因组 DNA用 5 U的限制性内切酶 S caⅠ进行酶切 , 直到基因组充分酶解。
(3) 将 2μL酶解过的 DNA片段加到 100μL管中 , 然后加入 214μL接头和 018μL的 10 ×连接
缓冲液 , 接着加入 1μL T4DNA连接酶 (3 U·μL - 1 ) , 用 ddH2 O定容至 8μL, 于 16 ℃过夜连接 , 最
后 , 连接产物放置在 70 ℃水中 5 m in以终止反应 , 并加入 72μL TE缓冲液稀释以形成带接头的核基
因组酶解 DNA片段文库。
(4) 第一轮 PCR扩增 : 所用的引物是接头引物 AP1和基因特异性引物 GSP1, 以 5μL上述文库
作为模板 , 经 94 ℃预变性 5 m in; 94℃变性 2 s, 72℃退火 3 m in, 2个循环 ; 94 ℃变性 2 s, 70 ℃
退火 3 m in, 2个循环 ; 94 ℃变性 2 s, 68 ℃退火 3 m in, 2个循环 ; 94 ℃变性 2 s, 66 ℃退火 3 m in,
32个循环 ; 66 ℃延伸 10 m in。
(5) 第二轮 PCR扩增 : 所用引物是接头引物 AP2和基因特异引物 GSP2, 以 1μL 50倍稀释的第
一轮 PCR产物作为模板 , 将循环数从 32降低到 20, 其它均与步骤 (4) 相同。
(6) 将第二轮 PCR反应的特异 DNA扩增条带通过 DNA 凝胶纯化回收试剂盒回收后 , 连接到
PGEM 2Teasy载体上 , 转化感受态大肠杆菌 DH5α, 最后将 PCR鉴定为阳性的菌液送上海英骏生物技
术有限公司进行测序。
113　启动子顺式作用元件分析
利用斯坦福大学开发的 D IAL IGN基因组比对工具对中国李 pg ip及其启动子区与 NCB I数据库中目
前收录的相应序列进行比对 , 以获取其中的保守序列。利用 PLACE软件对保守区段中潜藏的顺式作
用元件进行识别。
2　结果与分析
211　pg ip启动子的克隆及测序
经过两轮 PCR后 , 从中国李的酶切体系中扩增到一条约 2 500 bp的目的片段 (图 1)。
将扩增到的目的片段回收、克隆并测序 , 结果表明 , 获得的片段实际长度为 2 338 bp (图 2)。
进一步序列分析后发现 , 该片段包含基因区域 469 bp, 所以获取的中国李 pg ip启动子区实际长度为
1 869 bp。
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212　启动子顺式作用元件分析
21211　保守区段识别 　
进化印记识别法 (phylogenetic footp rinting) 是生物信息学中识别转录调控元件的经典方法。基因
组的功能区 (包括外显子区、转录调控元件区等 ) 由于受选择压的影响 , 进化中倾向于保守存在。
因此 , 首先对中国李 pg ip启动子中的保守区段进行了识别 , 其次对保守区段中的调控元件进行了鉴
定。
利用 ‘pgip and p romoter’为关键词检索 NCB I中的核酸序列 , 得到梅 ( P runus m um e)、水稻
(O ryza sa tiva) 和菜豆 ( Phaseolus vu lgaris) 3个物种中的相关序列。分别将中国李 pg ip及其启动子序
列与梅、水稻和菜豆中的对应序列进行比对。结果表明 : 基因的启动子中 , 梅和中国李之间存在大量
的保守区段 (图 3, A ) , 菜豆与中国李之间有 2处保守区段 (图 3, B) , 而水稻与中国李只存在 1处
保守区段 (图 3, C)。
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图 3　中国李 pgip启动子区的印记序列识别
A、B、C分别为中国李 pgip和其启动子序列与梅、菜豆和水稻中对应序列的比对结果。其中 , 红色表示启动子区 , 蓝色表示
5′2UTR区 , 绿色表示基因外显子区 , 粉色表示内含子区 , 单线表示空格区。保守区段用黑线中的峰区表示。
F ig. 3　Phylogene itc footpr in ting of pgip prom oter from P runus sa licina
A, B, C respectively indicates the alignment of pgip with p romoter between Prunus sa licina and Prunus m um e, between P runus sa licina
and Phaseolus vulgaris, between Prunus salicina and O ryza sativa. Red part denotes p romoter region.
B lue part denotes 5′2UTR region. Green part denotes exon region. Pink part denotes intron region.
Single line denotes space area. B lack peaking line denotes conservative region.
由于梅、中国李基因组分离的时间较短 , 存在着大量非进化因素导致的保守序列 , 因此它们的比
对结果不能提供高可靠度的印记保守序列。中国李与菜豆、水稻间的进化印记结果见表 1。
表 1　中国李 pgip启动子中的印记序列及其在菜豆、水稻中的相应序列
Table 1　Phylogene itc footpr in ting of pgip prom oter from P runus sa licina and its correspond ing sequences
from Phaseolus vu lga ris and O ryza sa tiva
序号
No.
位置
Location
中国李
Prunus sa licina
菜豆
Phaseolus vulgaris
水稻
O ryza sativa
1 　 - 71 TCCGTCATCCAAAATCA TCCGTCATCCAAATTCA
2 - 375 ATTTTACTTTTTCCCAAATA ATTTTTCTTTTTGTCAAATA
3 - 1 585 TCATCAATTTCAACT CCACCACGACCAACT
21212　保守序列中的调控元件分析　
利用 PLACE软件对保守序列进行已知顺式作用元件扫描 , 结果表明 : TCCGTCATCCAAAATCA序
列中包含了 1个 TGA1结合位点 ( TGACG) 和 1个 WRKY结合位点 ( TGAC)。ATTTTACTTTTTC2
CCAAATA和 TCATCAATTTCAACT印记序列分析没有发现可靠的已知元件序列。
进一步手工分析 TCCGTCATCCAAAATCA序列中的 TGA1结合位点发现 : 中国李 pg ip启动子中 ,
TGA1结合位点上游还存在另外 1个拷贝 (图 4, A ) , 它们共同构成了 as21元件的经典范式 TGACG
[N7 ] TGACG ( van der Zaal et al. , 1996)。而 WRKY结合位点分析结果表明 , 中国李 pg ip启动子中 ,
该位点除存在 2个拷贝外 , 其中 1个还显示出了抗病基因间的位点偏爱性 : 与欧芹 ( Petroselinum
crispum ) 抗病基因 w rky1和 w rky3的启动子中情形 ( Eulgem et al. , 1999) 相比 , 均倾向于出现在转录
起始位点上游的 - 70 bp附近 (图 4, B )。
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图 4　中国李 pgip启动子区的调控元件
A: 预测位点和 as21元件中的 TGA1结合位点比较 , 带双画线的字符为 pgip启动子中的印记序列 ; B: WRKY位点在抗病基因 pgip、
w rky1、w rky3启动子上的分布 ; 单下划线字符表示梅、中国李两个物种间的印记序列 ; 双下划线字符表示梅、
中国李、水稻 3个物种间的印记序列。
F ig. 4　Characters of regula tory elem en ts in pgip prom oter from P runus sa licina
A: Comparison of TGA1 site between p redictive site and as21 element, double underlining character is the bloting sequence
in pgip p romoter; B: D istribution of WRKY site in p romoter of pgip and w rky1
and w rky3; Single underlining characters denote bloting sequence between Prunus m um e
and P runus sa licina; Double underlining characters denote bloting sequence among Prunus m um e
and Prunus salicina and O ryza sativa.
3　讨论
研究基因表达的调控机制是全面揭示基因功能的重要内容。启动子的克隆和顺式作用元件分析是
进行基因表达调控研究的前提。顺式作用元件识别时 , 笔者采用了生物信息学中的进化印记法。该方
法在哺乳动物上的应用结果表明 , 分离时间在 70 MY以上时得到的结果具有很强的说服力 (W asser2
man & Sandelin, 2004)。因此 , 我们重点研究了中国李和菜豆、水稻之间的印记序列。这种做法可能
会丢失对 pg ip启动子中部分调控元件尤其是特异性元件的报道 , 但它却提高了识别结果的可靠度和
重要性。
中国李和水稻之间的分离时间至少为 300 MY (用单子叶植物和双子叶植物间的分化时间估算 ) ,
因此 , 保留在它们基因组间的印记序列应该具有更重要的功能。二者的 pg ip比较发现 , 基因区的保
守序列完全处于编码区之中 , 而内含子区却没有一条印记序列。这反映了功能性区域倾向于保守的基
本特征 , 同时证实了进化印记识别法在该基因上应用的可行性。
对中国李 pg ip启动子中的印记序列分析发现 , 其中存在着已知的调控元件序列 TGACG和 TGAC。
其中 TGACG最早被发现于抗病基因 PR 21a的启动子中 , 它能与 TGA1a结合 , 使外源 GUS基因在 A sA
诱导下得以表达 ( Strompen et al. , 1998) ; 而 TGAC (WRKY结合位点 , W 2box) 存在于许多植物的
抗病、损伤、衰老相关基因启动子中 , 它通过与 WRKY蛋白专一性结合调节基因转录 (高国庆 等 ,
2005)。因此推测 , 该印记序列承担着 pg ip响应病原、损伤、衰老等信号刺激的功能 , 它为研究中国
李 pg ip的抗病机制提供了遗传基础。
目前关于 pg ip表达调控的研究已有一些报道。研究表明 , 植物体内 PGIPs的含量和分布在时间、
空间、品种和组织细胞中存在较大差异 ( de Lorenzo et al. , 2001; DpiOvidio et al. , 2004)。在健康组织
细胞壁中 , PGIPs是以低水平存在的 ( Salvi et al. , 1990) , 但当细胞壁遇到致病性真菌侵染、胁迫、
创伤、真菌的葡聚糖、寡聚半乳糖醛酸苷以及水杨酸、吲哚乙酸等处理时 , 都会诱导 pg ip基因的表
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达 (Cervone et al. , 1989; de Lorenzo et al. , 2001)。不同的 pg ip基因对诱导条件有差异 , 但控制 pg ip
表达的特异性机制却并不清楚 , 因此人们目前还无法系统地揭示 pg ip的功能 , 并有效地指导 pg ip在
抗性育种上的应用。菜豆中虽然报道了 pg ip启动子的范围 (Devoto et al. , 1998) , 但却未能报道其中
的顺式作用元件。本研究发现的 pg ip启动子印记序列及其存在的已知调控元件为开展植物 pg ip的转
录调控机制实验研究提供了参考 , 为揭示 pg ip响应抗病相关信号的分子机制提供了遗传基础。
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