全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（10）：1575–1582
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2010–06–02；修回日期：2010–09–03
基金项目：山东省自然科学基金项目（Y2008D51）；青岛农业大学高层次人才科研基金项目
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yktian123@yahoo.com.cn）
梨贝壳杉烯氧化酶基因 PpKO 的克隆及生物信
息学分析
李节法，田义轲*，王彩虹，田 伟，宋 伟，殷 豪
（青岛农业大学园林园艺学院，山东青岛 266109）
摘 要：以黄金梨（Pyrus pyrifolia Nakai）茎尖为试材，应用同源克隆和 RACE 方法从梨茎尖中克隆
到赤霉素合成代谢的关键酶：内根-贝壳杉烯氧化酶（KO）基因 cDNA 的全长序列，命名为 PpKO，GenBank
登录号为：HM003112，其长度为 1 752 bp。PpKO 的开放阅读框（ORF）编码 515 个氨基酸，相对分子
量为 59.007 kD，等电点为 7.19。氨基酸同源性分析表明，PpKO 与已报道的其它植物的 KO 氨基酸序列
具有 59.4% ~ 95.9%相似性；氨基酸聚类分析表明，梨和苹果首先聚类，其次是草莓；生物信息学分析表
明：PpKO 含有细胞色素 P450 核心功能域 FXXGXRXCXG 和氨基端的跨膜结构域。
关键词：梨；贝壳杉烯氧化酶基因（PpKO）；生物信息学分析
中图分类号：S 661.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）10-1575-08

Cloning and Bioinformatics Analysis of ent-Kaurene Oxidase Gene PpKO
in Pear（Pyrus pyrifolia Nakai）
LI Jie-fa，TIAN Yi-ke*，WANG Cai-hong，TIAN Wei，SONG Wei，and YIN Hao
（College of Landscape and Horticulture，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109，China）
Abstract：Ent-kaurene oxidase（KO）is a critical enzyme in the pathway of gibberellins biosynthesis.
In this research，ent-kaurene oxidase gene in pear，designated as PpKO（GenBank accession number：
HM003112），was isolated from‘Whangkeumbae’（Pyrus pyrifolia Nakai）stem apical tissue by
homologous cloning and RACE technology. The full cDNA was 1 752 bp in length with an open reading
frame（ORF）of 1 548 bp encoding a protein of 515 amino acids. Molecular weight and isoelectric point of
the protein was 59.007 kD and 7.19，respectively. Amino acids homology analysis indicated that the
sequence had 59.4%–95.9% similarity with those of other reported plants. Amino acids cluster analysis
showed that KO from apple was clustered together with PpKO firstly，and followed by that from
strawberry. Bioinformatics analysis exhibited that PpKO contained a core functional domain of
cytochrome P450（FXXGXRXCXG）and transmembrane region near the N-terminus.
Key words：pear；ent-kaurene oxidase gene（PpKO）；bioinformatics analysis

果树的矮化性状是一个非常重要的农艺性状，在提高产量、改进品质和变革果树种植模式上发

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挥着巨大作用。但由于对其矮化机制缺乏深入研究，限制了矮化育种的进展。Faust（1992）研究认
为果树树型的改变是以赤霉素（GAs）为中心的激素代谢不平衡造成的。朱海涛等（2008）也认为
GAs 是控制树体大小的最重要激素。GAs 生物合成过程中的关键酶主要有柯巴焦磷酸合成酶（CPS）、
内根–贝壳杉烯合成酶（KS）、内根–贝壳杉烯氧化酶（KO）、内根–贝壳杉烯酸氧化酶（KAO）、
GA20–氧化酶、GA3β–羟基化酶等。其中 KO 是位于内质网且与膜结合的依赖细胞色素 P450
（CYP450）和 NADPH 的单加氧酶，其通过一系列羟基化作用，将内根贝壳杉烯的 C-19 甲基氧化，
分别形成内根–贝壳杉烯醇、内根-贝壳杉烯醛和内根–贝壳杉烯酸（Helliwell et al.，1999），该过
程导致 6 碳的 B 环转化为 5 碳的 C 环而形成赤霉素的母环结构（Lange，1998）。拟南芥的 GA3
（Helliwell et al.，1998）和豌豆的 LH（Davidson et al.，2004）分别编码 KO。拟南芥的 ga3 突变体
是因 KO 的功能欠缺，导致植株矮化。豌豆的 lh 突变体是因内根–贝壳杉烯氧化被阻断最终导致植
株矮化。自然突变获得的半矮化水稻 Tan-Ginbozu（d35Tan-ginbozu）是 GAs 缺陷型突变体，其 GAs
合成过程中，由于 KO 催化的步骤受阻，从而影响了 GAs 的合成，结果导致植株矮化（Itoh et al.，
2004）。目前编码 KO 的基因在拟南芥（Helliwell et al.，1998）、豌豆（Davidson et al.，2004）、水
稻（Itoh et al.，2004）、南瓜（Helliwell et al.，2000）、甜叶菊（Humphrey et al.，2006）、玉米（Alexandrov
et al.，2009）等草本植物上相继得到克隆，但在多年生果树上只报道了草莓（石琰璟 等，2006）、
桃（石琰璟，2002）和苹果（田义轲，2004）的部分 cDNA 片段。果树与一年生作物在许多方面有
较大差异，其适合研究的突变体也十分难得，因此相关的研究也就显得非常薄弱。
本研究中以梨为试材，克隆 KO 基因（PpKO），并对所获得的基因进行生物信息学分析，以期
探讨 GAs 在合成的上游部分调控梨生长发育的机制。本研究不仅在探索果树的矮化机理方面有重要
价值，同时也可为利用基因调控技术改良果树树型提供分子依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料
2009 年 4 月中旬在青岛农业大学莱阳果树实验站采集黄金梨（Pyrus pyrifolia Nakai）快速生长
的茎尖组织约 2 g，置于盛有液氮的冰壶内带回室内，投入超低温冰箱保存。
1.2 PpKO cDNA 全长序列克隆
梨茎尖 RNA 提取采用 Ksenija 等（2004）改良的 CTAB-LiCl 法。3′RACE cDNA 第 1 条链合成
参照 TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver 3.0 使用说明进行操作；5′RACE cDNA 第 1 条链合成参照
SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 使用说明进行操作。
根据已报道或登录 GenBank 的其他植物 KO 氨基酸序列[苹果（Malus × domestica，AA68017）、
草莓（Fragaria grandiflora，AAR18407）、南瓜（Cucurbita maxima，AAG41776）、豌豆（Pisum sativum，
AAP69988）等]设计兼并引物 FA、RA 和 FD（表 1），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
以 3′RACE 反转录获得的 cDNA 第 1 条链为模板，用兼并引物 FA/RA 进行中间片段的扩增。PCR
程序为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环；72 ℃
终延伸 10 min。
采用巢式 PCR，以 3′RACE 反转录获得的 cDNA 第 1 条链为模板，在获得中间片段的基础上设
计引物 FB 和 FC（表 1），并与 3′RACE 通用引物 M13 配对进行 3′cDNA 末端扩增。PCR 程序为：94
℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环；72 ℃终延伸 10 min。
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本试验将 5′端分两部分进行扩增。首先以 5′RACE 反转录获得的 cDNA 第 1 条链为模板，在获
得 3′端序列的基础上设计引物 RB（表 1），用引物 FD/RB 进行 PCR 扩增。PCR 程序为：94 ℃预变
性 3 min；94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环；72 ℃终延伸 10 min。其
次采用巢式 PCR，以 5′RACE 反转录获得的 cDNA 第 1 条链为模板，在获得靠近 5′端中间片段的基
础上设计引物 RC、RD（表 1），利用 UPM/RC、NUP/RD 进行 5′端扩增。PCR 扩增采用 Touchdown
PCR 程序：94 ℃预变性 3 min；94 ℃ 变性 30 s，65 ~ 55 ℃退火（每个循环降 0.5 ℃）35 s，72 ℃
延伸 3 min，15 个循环；94 ℃变性 30 s，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸 90 s，20 个循环；72 ℃终延
伸 10 min。从 1.2%的琼脂糖凝胶中切胶回收扩增特异性片段，与 pGEM○R -T Easy vector 相连并转化
E.coli DH5α，提取阳性克隆质粒酶切鉴定后，由大连 TaKaRa 生物公司测序。
表 1 梨 PpKO 基因克隆所用引物
Table 1 The PpKO gene cloning primers in this test
引物名称
Name of primers
编号
Serial No.
序列
Primer sequences（5′–3′）
FA（上游引物 Forward primer sequence） GAYTGGCGNGAYTTYCTNCCN 兼并引物
Degenerated primers RA（下游引物 Reverse primer sequence） NAGYTCRTACATNGCCCAYTCNGT
FB（上游引物 Forward primer sequence） TTGGCGTGATTTTCTTCCTT
FC（上游引物 Reverse primer sequence） AGCCATGTTGATTTGGGAAAC
M13 GTTTTCCCTGTCCTACGAGTTG
FD（上游引物 Forward primer sequence） TSAARGAGAAGAARCCKYAC
3′ RACE 引物
3′ RACE primers
RB（下游引物 Reverse primer sequence） AGACATTCATTACTGCTATCCTGCGGCG
5′ RACE 引物 UPM（上游引物 Forward primer sequence） CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTAT
5′ RACE primers CAACGCAGAGTCTAATACGACTCACTATAGGGC
NUP（上游引物） AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
RC（下游引物 Reverse primer sequence） GAGCATGCAATCGGCTAGCAACA
RD（下游引物 Reverse primer sequence） TCTGGTCACCATGGCCTCTCTGGCA
1.3 生物信息学分析
利用美国国立生物技术信息中心（NCBI）网站中的 BLAST 对获得的核苷酸和推导的氨基酸序
列进行同源性比对及保守结构域分析（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），由 ORF Finder（http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析开放阅读框；使用 DNAMAN6.0 软件进行序列拼接及绘制
系统进化树；使用 ProtParam tool（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）分析氨基酸基本成分；
运用PBIL LYON-GERLAND对PpKO进行二级结构预测（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.
pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html）；用 TMHMM Server v. 2.0 程序（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMH
MM/）进行蛋白序列跨膜区分析；用在线软件 PSORT（http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html）进行
亚细胞定位。蛋白质立体结构预测和观看采用 SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/work
space/index.php?func=modelling_simple1）和 Raswin（http://www.bbioo.com/Soft/2007/710.htm）软件。
2 结果与分析
2.1 PpKO 全长 cDNA 序列的获得
以梨茎尖总 RNA 的反转录产物为模板进行 RT-PCR 扩增，以 FA/RA 为引物，扩增产物经测序
后得到 282 bp 的中间片段 A；以 FB/M13、FC/M13 为引物，通过 3′RACE、巢式技术扩增得到 765 bp
片段 B；以 FD/RB 为引物，通过 RACE-PCR 获得到靠近 5′端的 636 bp 中间片段 C；以 UPM/RC、
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NUP/RD 引物，通过 5′RACE、巢式技术扩增获得 5′端的 411 bp 片段 D（图 1）。







图 1 梨茎尖 PpKO cDNA 中间片段（A）、3′ RACE（B）、靠近 5′ 端中间片段（C）及 5′ RACE（D）扩增结果
Fig. 1 The cDNA fragment（A），3′ RACE product（B），The cDNA fragment near 5′ terminus（C）and 5′ RACE product（D）
将获得的 4 条片段经 DNAMAN 软件拼接，得到梨茎尖 PpKO 基因 cDNA 序列全长 1 752 bp，5′
端有 49 bp 的非翻译区（5′UTR）；3′端含有 155 bp 的非翻译区（3′UTR），其终止子 TAA 后具有非常
保守的 AATAAA 序列区域，该区域为链的切断和多聚腺苷酸化提供信号，并且片段末端含有 poly
（A）序列（图 2）。依据上述特征判断，本研究获得了 PpKO 的完整 cDNA 序列。























图 2 PpKO基因的cDNA序列及其推导的氨基酸序列
★代表终止密码子，方框内为AATAAA序列区域。
Fig. 2 Sequence of PpKO and its deduced amino acid sequence
★ stands for the termination codon. AATAAA motif is in the box.
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2.2 PpKO 推导的氨基酸序列的同源性及系统进化分析
利用 ORF Finder 软件分析 PpKO 开放性阅读框（ORF），长度为 1 548 bp，编码 515 个氨基酸（图
2）。用 ProtParam tool 软件预测该基因所编码的蛋白质相对分子量为 59.007 kD，等电点（PI）为 7.19，
分子式为 C2652H4181N709O759S27。将克隆到的 PpKO 推导的氨基酸序列与 GenBank 中已登录的 KO 氨
基酸序列进行同源性比对，结果表明 KO 的 C 端序列相对保守，N 端序列保守性相对较低（图 3）。
图 3 PpKO 与其他物种 KO 氨基酸序列的同源性比较
方框内为CYP450结构域，黑色表示氨基酸序列同源性为100%，灰色表示50% ~ 99%。ADE61678：梨；AAS68017：苹果；
AAG41776：南瓜；ACQ99374：咖啡；XP_002282197：葡萄；AAR18407：草莓；NP_197962：拟南芥。
Fig 3. The homologous alignment of PpKO amino acid sequence with other KO proteins
CYP450 motifs are in the boxes. Black and grey show 100% and 50%–99% identity on amino sequences，respectively.
ADE61678：Pyrus pyrifolia Nakai；AAS68017：Malus× domestica；AAG41776：Cucurbita maxima；
ACQ99374：Coffea Arabica；XP_002282197：Vitis vinifera；AAR18407：Fragaria grandiflora；
NP_197962：Arabidopsis thaliana.

氨基酸聚类分析表明：本研究从梨中克隆的 PpKO 推导氨基酸与苹果的氨基酸序列属于一个进
化枝，和草莓属于同一个分支（图 4）。氨基酸同源矩阵表明：梨与苹果、草莓、葡萄、拟南芥、南
瓜、咖啡等 KO 基因编码的氨基酸序列的同源性分别达到 95.9%、68.6%、66.7%、65.3%、62.6%、59.4%。
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图 4 7个来自不同物种的贝壳杉烯氧化酶氨基酸序列的聚类分析
Fig. 4 Cluster analysis of ent-kaurene oxidase sequences derived from seven different species
2.3 PpKO 的生物信息学分析
NCBI保守域分析表明PpKO属于细胞色素超家族P450系。研究表明，所有已知结构的CYP450具
有一系列的特征结构域：羧基端的血红素结合域、氨基端的跨膜区域和P450的氧化还原位点（图5）。
其中，血红素结构域在所有CYP450中完全保守，序列为FXXGXRXCXG，其中的半胱氨酸（C）是
亚铁血红素的第5个轴配体（Rupasinghe & Schuler，2006）。CYP450羧基端有4个保守的芳香氨基酸
（PERF），即真核生物CYP450的氧化还原位点（Lewis et al.，1998）。利用SMART在线分析，PpKO
具有CYP450的典型特征，距离羧基端53 ~ 62位氨基酸为CYP450半胱氨酸血红素亚铁配体结合位点
（FGAGKRVCAG），距离羧基端79 ~ 82位氨基酸为PERF位点（图3）。

图5 CYP450氨基酸保守位点
Fig. 5 Conserved regions of plant cytochrome P450 proteins

此外，多数植物 CYP450 是内质网结合蛋白，氨基端有一疏水性螺旋将其锚定在内质网膜上并
将其余大部分蛋白定位于内质网膜外胞质中。通过在线软件 PSORT 进行亚细胞定位发现 PpKO 蛋白
位于内质网膜上。利用 TMHMM Server v. 2.0 程序对 PpKO 进行蛋白跨膜区分析发现：距 N 端 1 ~ 15
位氨基酸位于膜内，16 ~ 38 位氨基酸位于跨膜螺旋区，39 ~ 515 位氨基酸位于膜外（图 6）。这与在


图6 PpKO跨膜区域预测结果 图7 SWISS-MODEL预测PpKO-3D结构图
Fig. 6 The predicted result of PpKO transmembrane region Fig. 7 The tertiary structure of PpKO was predicted with
SWISS-MODEL
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拟南芥（Helliwell 等，1998，1999，2001）以及草莓（石琰璟，2002，石琰璟 等，2006）上的研究
结果相符合。
CYP450 紧邻氨基端疏水螺旋的为一富含脯氨酸（P）的保守区：（P/I）PGPx（G/P）xP（Rupasinghe
& Schuler，2006），但 KO 的 N 端富含脯氨酸（P）的区域的氨基酸序列并不完全符合以往发表的 P450
酶保守模式，因此，Helliwell 等（1999）认为 KO 是一新类型的 P450 单加氧酶。本试验 PpKO 中该
保守区序列是 PSVPVVPGWP（图 3）。
用Hopfield神经网络（HNN）预测PpKO的氨基酸序列，结果表明，PpKO的二级结构是由大量的
α–螺旋、无规则卷曲和少量的扩展链结构组成，其中α–螺旋结构有266个，占51.65%，而扩展链和
无规则卷曲分别占10.49%和37.86%。利用SWISS-MODEL对PpKO的立体结构进行在线预测，以人的
微粒体CYP450蛋白（PDB code：2hi4）为模板，对PpKO进行同源模建，结果如图7。
3 讨论
自 20 世纪 60 年代起，由于水稻 sd1 基因和小麦 Rht1 基因在育种中的大规模推广应用，使世界
主要粮食作物产量大幅度地提高，这一历程即为众所周知的“绿色革命”。最近的研究表明主要农作
物的“绿色革命”都与赤霉素密切相关（Spielmeyer et al.，2002）。KO 是目前研究相对较多的 GAs
生物合成限速酶（Sun & kamiya，1994；Helliwell et al.，1998；Itoh et al.，2004；Sakamoto et al.，2004），
并且是植物重要的生长延缓剂多效唑（PP333）的靶酶，在 GAs 合成途径中催化三步反应。KO 基因
在植物矮化型、徒长型突变体内表达丰度差别很大（Helliwell et al.，2001；Davidson et al.，2004），
因此，研究 KO 基因可能会对从分子水平探明果树树型机制具有重要意义，并可为优良种质的创新
和利用提供重要依据，从而更好地服务于果树育种和生产。
矮化栽培因具有结果早、品质好、管理方便等优点，已成为果树业发展的趋势。国内关于果树
矮化机理的研究开始于 20 世纪 70 年代末和 80 年代初，早期的研究主要在苹果上进行，且主要集中
在生理方面，对于分子致矮机理研究相对较少，在梨上相关研究更是鲜有报道。目前，虽然矮化密
植已成为果树栽培的重要模式，然而生产上适合梨树矮化密植的优良品种却十分匮乏，主要原因是
缺乏优良的矮化种质资源。研究表明抑制 GAs 的合成或使 GAs 的活性减弱，是控制高等植物高矮的
有效措施（Bonna et al.，2008）。
本研究克隆到了梨 KO 基因的全长 cDNA，是从木本的高等植物中克隆到的关于 GAs 合成代谢
早期步骤的关键酶基因。该项研究对于探明一些果树矮化型突变的分子机制和利用基因调控技术进
行果树的矮化育种具有重要意义。另外，利用生物信息学对 PpKO 基因的功能域和结构进行了分析
和预测，发现 PpKO 具有 CYP450 典型特征，为开展该基因的表达研究，进一步确定其功能奠定了
基础。

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