全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (4) : 493 - 500
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 12 - 29; 修回日期 : 2009 - 03 - 03
基金项目 : 广西壮族自治区人才小高地项目 (桂发办 [ 2004 ] 47号 )3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: liyr@ gxaas1net)
致谢 : 本试验在美国农业部加州帕利尔市圣瓦金谷农业研究中心 ( San Joaquin Valley Agricultural Sciences Center, Parlier, CA,
USDA /ARS) 林宏博士实验室完成 , 特此感谢 !
利用基因组步行方法克隆柑橘黄龙病病原菌亚洲种
序列
廖惠红 1, 2 , 李杨瑞 1, 33 , 彭宏祥 2 , 白先进 3 , 杨丽涛 1 , 徐　宁 2
(1 广西大学农学院 , 南宁 530004; 2 广西农业科学院园艺研究所 , 南宁 530007; 3 广西作物遗传改良生物技术重点开
放实验室 , 南宁 530007)
摘 　要 : 对 NCB I基因库黄龙病亚洲种病原菌序列进行拼接 , 并根据拼接结果在 rplKAJL2rpoBC, 16S/
23S rRNA和 om p 3个位点上设计引物 , 采用基因组步行方法 , 在其亚洲种 3个位点上共获得了 15 168 bp非
冗余新序列 , 其中 , 在 rplKAJL2rpoBC位点上 5′端上游区和 3′端下游区分别获得了 3 218和 2 653 bp的非冗
余新序列 ; 在 16S/23S rRNA 位点上 5′端上游区和 3′端下游区分别延伸了 1 853和 2 459 bp的新序列 ; 在
om p基因位点上分别获得了 4 014和 971 bp的新序列。序列分析表明在 rplKAJL2rpoBC位点上的新序列包含
2个新基因 ( suhB和 serA) ; 16S/23S rRNA位点新序列包含 4个新基因 (膜转运蛋白基因、细胞壁脱氢酶
假基因、5S rRNA、tRNAMet ) , om p位点新序列包含 6个新基因 ( rpsB、 tsf、pyrH、 frr、 cdsA2、 cds2)。这些
新序列的获得为以 PCR为基础的黄龙病相关研究提供了有用的参考依据。
关键词 : 柑橘 ; 黄龙病 ; Candidatus L iberibactor; 序列
中图分类号 : S 666　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0420493208
Sequences C lon ing of C andida tus L iber ibactor asia ticus A ssoc ia ted w ith
Huanglongb ing Using Genom ic W a lk ing M ethod
L IAO Hui2hong1, 2 , L I Yang2rui1, 33 , PENG Hong2xiang2 , BA I Xian2jin3 , YANG L i2tao1 , and XU N ing2
(1 A griculture College, Guangxi U niversity, N anning 530004, Ch ina; 2 Horticu lture Research Institu te, Guangxi A cadem y of
A gricultural Sciences, N ann ing 530007, China; 3 Guangxi C rop Genetic Im provem ent and B iotechnology Lab, N anning 530007,
China)
Abstract: Huanglongbing (HLB ) , p reviously known as greening disease, is p robably the most serious
disease in citrus. The p resump tive causal agent is believed to be a non2cultured, phloem 2restrictedα2p ro2
teobacterium. Currently, there are three Cand ida tus L iberibactor spp. associated with citrus Huanglongbing
(HLB) disease, Ca. L iberibactor asia ticus, Ca. L iberibactor africanus and Ca. L iberibactor am ericanus. In
this study, a genom ic walking method was used to obtain new sequences extended from p reviously known loci,
rplKAJL 2rpoBC, 16S/23S rRNA and outer membrane p rotein ( om p) of Ca. L iberibactor asia ticus. In rplKA2
JL 2rpoBC locus, 3 218 bp of new sequenceswere obtained at the 5′up stream end and 2 653 bp at the 3′down2
stream. Totally, fragments about 1 853 bp and 2 459 bp were also acquired from 5′up stream and 3′down2
stream of 16S/23S rRNA region, respectively. Sim ilarly, in om p locus, fragment about 4 014 bp were ob2
tained at 5′up stream and 971 bp at 3′downstream, respectively. Genom ic walking app roach was used in this
study, and totally 15 168 bp non2redundancy sequences from asiaticus specieswere obtained. Sequence analy2
sis shows that there are two new genes ( suhB and serA ) at the rplKAJL2rpoBC gene cluster locus, four new
genes ( transmembrane p rotein gene, cell wall hydrolase p seudogene, 5S ribosomal RNA and tRNAM et ) ex2
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tended from the 16S/23S rRNA gene locus and six new genes ( rpsB , tsf, pyrH, frr, cdsA2, cds2) at the om p
locus. These new sequences obtained in this study will facilitate the PCR2based HLB research.
Key words: citrus; Huanglongbing; Candida tus L iberibactor; sequence
柑橘黄龙病 (Huanglongbing, HLB ) 因其毁灭性及快速传播而成为世界上最严重的柑橘病害之一
(Bove, 2006)。该病害在南亚、东南亚、非洲东南部、阿拉伯半岛和印度洋岛屿等地区严重流行 ,
我国广东、广西、福建、湖南南部也受到严重危害 , 台湾、江西、云南、贵州、四川和浙江等省的部
分地区也有发生。巴西圣保罗州和美国佛罗里达州分别于 2004年和 2005年发现该病 ( Halbert,
2005; Teixeira et al. , 2005)。目前认为该病害是由寄生在柑橘韧皮部筛管的原核生物韧皮部杆菌属
(Candida tus L iberibactor) 的革兰氏阴性细菌所引起 ( Garnier & Bove, 1977; Jagoueix et al. , 1994) ,
可通过嫁接和柑橘木虱传播 (林孔湘 , 1956; McClean & Oberholzer, 1965; Capoor et al. , 1967)。根据
16S rDNA序列的比较 , 该病原菌可分为 3个种 , 分别是亚洲种 (Ca. L iberibactor asia ticus)、非洲种
(Ca. L iberibactor africanus) 和美洲种 (Ca. L iberibactor am ericanus) , 我国柑橘黄龙病病原菌属于亚
洲种 (田亚南 等 , 1996; Bove, 2006)。迄今为止 , 该病原菌仍然无法在人工培养基上培养 , 基因组
信息非常有限 , 与该病原菌有关的研究受到了严重阻碍。
柑橘黄龙病病原菌的基因组信息主要来源于亚洲种 rplKAJL2rpoBC, 16S/23S rDNA及 om p 3个位
点上的序列。V illechanoux等 (1993) 首次在 rplKAJL2rpoBC位点上获得该病原菌的序列 , 之后 Okuda
等 (2005) 和 L in等 ( 2008) 分别在该位点上进一步对该序列进行延伸 , 目前该位点上的非冗余
DNA序列为 11 260 bp。Jagoueix等 (1994) 利用 PCR方法首次获得了该病原菌的 16S rDNA序列 , 并
用同样的方法于 1997年在该位点上延伸到 16S/23S基因区间 (Jagoueix et al. , 1997) , L in等 (2008)
在 16S/23S位点上进一步延伸 , 目前该位点上的非冗余 DNA序列为 3 619 bp。Hocquellet等 (1999)
利用 RAPD的方法首次在 om p位点上获得该病原菌的序列 , Bastianel等 (2005) 和 L in等 (2008) 在
该位点上对该序列进行了延伸 , 目前该位点上的非冗余 DNA序列为 5 423 bp。本研究中利用基因组
步行的方法 , 用 CAP3软件对 NCB I基因库黄龙病亚洲种病原菌序列进行拼接并根据拼接结果在
rplKAJL2rpoBC, 16S/23S rRNA和 om p 3个位点上设计 24个引物 , 其中 12个引物用于第 1轮 PCR扩
增 , 12个引物用于第 2轮 PCR扩增以获取柑橘黄龙病亚洲种病原菌的序列 , 从而为以 PCR为基础的
黄龙病相关研究提供理论依据。
1　材料与方法
111　试验材料
本试验于 2006年 12月 —2007年 12月在美国农业部加州帕利尔市圣瓦金谷农业研究中心 ( San
Joaquin Valley Agricultural Sciences Center, Parlier, CA, USDA /ARS) 进行 , 感染黄龙病的暗柳橙来源
于广西柑橘研究所 , 未感染黄龙病的华盛顿脐橙来源于圣瓦金谷农业研究中心资源圃。
112　植物总 D NA的提取
叶片总 DNA 的提取采用 CTAB 法 , 其中感染黄龙病的暗柳橙叶脉 DNA在广西作物遗传改良生物
技术重点开放实验室提取 , 然后邮寄到美国农业部加州帕利尔市圣瓦金谷农业研究中心 , 未感染黄龙
病的华盛顿脐橙叶脉 DNA在圣瓦金谷农业研究中心提取。
113　PCR扩增
基因组步行方法 , 接头及接头引物的设计 , 扩增模板的准备参考 L in等 (2008) 方法。位点特异
引物及巢式引物采用 CAP3软件对 rplKAJL2rpoBC, 16S/23S rDNA及 om p 3个位点上的序列进行非冗
余分析 , 利用 Gene Runner (3105) 软件进行设计 (表 1)。PCR反应在 AB I 7700 ( Foster City, CA ) ,
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　4期 廖惠红等 : 利用基因组步行方法克隆柑橘黄龙病病原菌亚洲种序列 　
PCR仪上进行。
第 1轮 PCR反应体系为 20μL, 含有 2μL 10 ×PCR缓冲液 , 210 mmol·L - 1 MgOAc, 012 mmol·
L - 1 dNTPs, 015μmol·L - 1接头引物 AP1 (5′2GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGC23′) , 015μmol·
L - 1位点特异引物 (表 1) , 1μL经 3种酶 ( EcoR I, H indⅢ和 PstⅠ) 对感染黄龙病的柑橘 DNA样品
进行酶切并连接上接头的产物 (作为扩增模板 ) , 015 U XL DNA rTth聚合酶 (AB I, Foster City, CA )。
第 1次基因组步行 : 在 rplKAJL2rpoBC位点上 5′端采用 GC212L, 3′端采用 GC212R; 在 16S/23S rRNA
位点上 5′端采用 16S212L, 3′端采用 16S212R; 在 om p基因位点上 , 5′端采用 OMP212L, 3′端采用 OMP2
12R。第 2次基因组步行 : 在 rplKAJL2rpoBC位点上 5′端采用 GC222L, 3′端采用 GC222R; 在 16S/23S
rRNA位点上 5′端采用 16S222L, 3′端采用 16S222R; 在 om p基因位点上 , 5′端采用 OMP222L, 3′端采用
OMP222R。反应程序为 94 ℃ 1 m in, 94 ℃ 10 s, 72 ℃ 6 m in, 7个循环 ; 94 ℃ 10 s, 67 ℃ 6 m in, 32个
循环 ; 最后 67 ℃延伸 10 m in。
第 2轮 PCR反应体系也为 20μL, 含有 2μL 10 ×PCR缓冲液 , 210 mmol·L - 1MgOAc, 012 mmol·
L - 1 dNTPs, 015μmol·L - 1接头引物 AP2 ( 5′2ATAGGGCTCGAGCGGC23′) , 015μmol·L - 1巢式引物
(表 1) , 2μL第 1轮 PCR产物的稀释物 (作为模板 ) , 015U XL DNA rTth聚合酶 (AB I, Foster City,
CA )。第 1次基因组步行 : 在 rplKAJL2rpoBC位点上 5′端采用 N2GC212L, 3′端采用 N2GC212R; 在 16S/
23S rDNA位点上 5′端采用 N216S212L, 3′端采用 N216S212R; 在 om p基因位点上 , 5′端采用 N2OMP212
L, 3′端采用 N2OMP212R。第 2次基因组步行 : 在 rplKAJL2rpoBC位点上 5′端采用 N2GC222L, 3′端采用
N2GC222R; 在 16S/23S rRNA位点上 5′端采用 N216S222L, 3′端采用 N216S222R; 在 om p基因位点上 ,
5′端采用 N2OMP222L, 3′端采用 N2OMP222R。反应程序为 94 ℃ 1 m in, 94 ℃ 10 s, 62 ℃ 6 m in, 5个循
环 ; 94 ℃ 10 s, 65 ℃ 6 m in, 20个循环 ; 最后 67 ℃延伸 7 m in。
114　PCR产物的克隆和测序
从琼脂糖胶上回收 500～2 500 bp第 2轮 PCR产物片段 , 产物经基因净化试剂盒 ( GENECLEANµ
Ⅲ KIT) 纯化后 , 连接到载体 pGEMµ 2T上 ( Promega, Madison, W I, USA )。将连接产物转入细菌
JM109, 挑选白色克隆进行液体培养并用试剂盒 (Q IAp rep 96 well kit, Q iagen, Valencia, CA ) 提取质
粒 DNA用于测序。测序在 AB I 3100 DNA analyzer测序仪上进行。
115　序列的分析及证实
测序结果与 NCB I基因库中的序列进行同源性比较 , 排除植物 DNA及真菌 DNA序列。利用 CAP3
软件对测序结果进行冗余分析。根据 CAP3分析结果利用 Gene Runner 3105软件设计引物 (表 2) 对
新序列进行进一步鉴定。
2　结果与分析
211　第 1次基因组步行结果
第 1次基因组步行第 1轮 PCR扩增产物呈弥散状 (图 1) , 第 2轮 PCR扩增产物有特异带出现
(图 2)。特异带经回收测序分析 (表 1) 后发现 , 在 rplKAJL2rpoBC位点上 5′端和 3′端分别获得了 895
bp和 1 018 bp的碱基序列 , 这些序列分别来源于 EcoR I酶切扩增的片段 (图 2, 1和 2) ; 在 16S/23S
rRNA位点上 5′端和 3′端分别获得了 2 010 bp和 922 bp的序列 , 其中 2 010 bp序列来源于 EcoRⅠ酶
切扩增的片段 (图 2, 3) , 922 bp序列来源于 H indⅢ酶切扩增的片段 (图 2, 10) ; 在 om p基因位点
上 5′端和 3′端分别获得了 2 252 bp和 1 137 bp的序列 , 其中 2 252 bp序列来源于 H indⅢ酶切扩增的
片段 (图 2, 11) , 1 137 bp序列来源于 EcoR I酶切扩增的片段 (图 2, 6)。
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表 1　用于基因组步行的位点特异引物和巢式引物及产物大小
Table 1　L ocus spec if ic pr im ers and nested pr im ers for genom ic wa lk ing and product size
位点特异引物 5′- 3′
Locus2specific p rimers 5′- 3′ 巢式引物 5′- 3′Nested2p rimers 5′- 3′ 产物大小 / bpProduct size
GC212L CCCTACCCCGCCTCGACTCCCATAAAATTGA N2GC212L CAGGAATCTGTCGAGCAATGG 895
GC212R GTACTCCTGTAGATATCGTTCTCAACCCATTG N2GC212R GGCATGTGTTGGTCTTGGGA 1 018
16S212L TCCACGTCTCCCTTTCTTCTCTCTATTCTATTC N216S212L CACATAACCAAGTCAACCCA 2 010
16S212R TACCGCCTTACTGCTCCTAACCAAACTC N216S212R CAACAACCCTGACCTCCATC 922
OMP212L AGAAACCTTCCAACGCACACCAGAC N2OMP212L GATAGCACCCTGATATTACACAA 2 252
OMP212R TCATAACTTCGTCGGGACGGAGTTGTTG N2OMP212R GAGGAACCGTTGAGTATGGC 1 137
GC222L CATTACAACGCTCAACACATGCAGAAAGACCTCCC N2GC222L GCCAAAGCAACGCATCAATGTA 2 541
GC222R CGTGGACAGATGATAGAGGATTTGATTCAGTCAGG N2GC222R TTGCGTCTTTGTCTTATGGTGAG 2 215
16S222L GCTGTTAAACAAGGACAAATAATTGGATGGATTGGAA N216S222L GCAGGATTATCAACAGGCCCGC 　 0
16S222R CTGACGCCTGCCCGGTGCTGGAAGGTTAATAG N216S222R GAATTGAAGCCCCAGTAAACGG 1 943
OMP222L CCATTTCCTTATCCCAAACAGAAACTACAAGCATAC N2OMP222L CTAGATCAAGCATGGAGGGAG 2 019
OMP222R GGGTACTTGTGTTCCTAATAGAGATGTCAAACGGG N2OMP222R GCAGTTAGTATTGGAGGGAGGG 　 0
图 1　第 1次基因组步行第 1轮 PCR产物 112%琼脂糖凝胶电泳
M: 1 kb p lus marker; 1～6: EcoR I酶切产物为模板的扩增产物 [ 1 ( GC212L) , 2 ( GC212R) , 3 (16S212L) , 4 (16S212R) ,
5 (OMP212L) , 6 (OMP212R) ]; 7～12: H indⅢ酶切产物为模板的扩增产物 [ 7 ( GC212L) , 8 ( GC212R) , 9 (16S212L) ,
10 (16S212R) , 11 (OMP212L) , 12 (OMP212R) ]; 13～18: PstⅠ酶切产物为模板的扩增产物 [ 13 ( GC212L) , 14 ( GC212R) ,
15 (16S212L) , 16 (16S212R) , 17 (OMP212L) , 18 (OMP212R) ]。
F ig. 1　112% agarose gel electrophoresis of the f irst round PCR products from the f irst genom ic wa lk ing
M : 1 kb p lus marker; 1 - 6: EcoR I digested temp late [ 1 ( GC212L) , 2 ( GC212R) , 3 (16S212L) , 4 (16S212R) , 5 (OMP212L) , 6 (OMP2
1 2R) ]; 7 - 12: H indⅢ digested temp late [ 7 ( GC212L) , 8 ( GC212R) , 9 (16S212L) , 10 (16S212R) , 11 (OMP212L) , 12 (OMP212R) ];
13 - 18: PstⅠdigested temp late [ 13 ( GC212L) , 14 ( GC212R) , 15 (16S212L) , 16 (16S212R) , 17 (OMP212L) , 18 (OMP212R) ].
图 2　第 1次基因组步行第 2轮 PCR产物 112%琼脂糖凝胶电泳
M: 100 bp marker; 1～6: EcoRⅠ酶切产物为模板的扩增产物 [ 1 ( GC212L) , 2 ( GC212R) , 3 (16S212L) , 4 (16S212R) ,
5 (OMP212L) , 6 (OMP212R) ]; 7～12: H indⅢ酶切产物为模板的扩增产物 [ 7 ( GC212L) , 8 ( GC212R) ,
9 (16S212L) , 10 (16S212R) , 11 (OMP212L) , 12 (OMP212R) ]; 13～18: PstⅠ酶切产物为模板的扩增产物
[ 13 ( GC212L) , 14 ( GC212R) , 15 (16S212L) , 16 (16S212R) , 17 (OMP212L) , 18 (OMP212R) ]。
F ig. 2　112% agarose gel electrophoresis of the second round PCR products from the f irst genom ic wa lk ing
M: 100 bp marker; 1 - 6: EcoR I digested temp late [ 1 ( GC212L) , 2 ( GC212R) , 3 (16S212L) , 4 (16S212R) , 5 (OMP212L) , 6 (OMP2
12R) ]; 7 - 12: H indⅢ digested temp late [ 7 ( GC212L) , 8 ( GC212R) , 9 (16S212L) , 10 (16S212R) , 11 (OMP212L) , 12 (OMP212R) ];
13 - 18: PstⅠdigested temp late [ 13 ( GC212L) , 14 ( GC212R) , 15 (16S212L) , 16 (16S212R) , 17 (OMP212L) , 18 (OMP212R) ].
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212　第 2次基因组步行结果
第 2次基因组步行第 1轮 PCR扩增产物与第 1次基因组步行第 1轮 PCR扩增产物一样呈弥散状 ,
第 2次基因组步行第 2轮 PCR扩增产物如图 3所示。产物经回收测序分析后 (表 2) 发现 , 在 rplKA2
JL2rpoBC位点上 5′端和 3′端分别获得了 2 541和 2 215 bp的碱基序列 , 这些序列分别来源于 EcoR I酶
切扩增的片段 (图 3, 1和 2) ; 在 16S/23S rRNA位点上 5′端没有获得新序列 , 3′端获得了 1 943 bp
的序列 , 该序列来源于 PstⅠ酶切扩增的片段 (图 3, 16) ; 在 om p基因位点上 5′端获得了 2 019 bp的
碱基序列 , 该序列来源于 PstⅠ酶切扩增的片段 (图 3, 17) , 3′端没有获得新序列。
表 2　验证新序列引物及产物片段大小
Table 2　Pr im ers for iden tif ica tion of newly obta ined sequences and product size
引物名称
Primer
正向引物 5′- 3′
Forward p rimers 5′- 3′
反向引物 5′- 3′
Reverse p rimers 5′- 3′
大小 / bp
Product size
Conf2GC2L GGTCAATTCAATGCGCTATAC CAGGAATCTGTCGAGCAATGG 3 308
Conf2GC2R GGCATGTGTTGGTCTTGGGA TCGGTGATTCAATAATTTCC 2 999
Conf216S2L GCGGGCCTGTTGATAATCCTGC CACATAACCAAGTCAACCCA 1 937
Conf216S2R CAACAACCCTGACCTCCATC GGGGGATCTATTGTCTTTAGG 2 692
Conf2OMP2L GCAGCTGGAAGGGGATTCAC GATAGCACCCTGATATTACACAA 4 151
Conf2OMP2R GAGGAACCGTTGAGTATGGC CCCTCCCTCCAATACTAACTGC 1 060
图 3　第 2次基因组步行第 2轮 PCR产物 112%琼脂糖凝胶电泳
M: 1 kb p lus marker; 1～6: EcoR I酶切产物为模板的扩增产物 [ 1 ( GC212L) , 2 ( GC212R) , 3 (16S212L) , 4 (16S212R) ,
5 (OMP212L) , 6 (OMP212R) ]; 7～12: H indⅢ酶切产物为模板的扩增产物 [ 7 ( GC212L) , 8 ( GC212R) , 9 (16S212L) ,
10 (16S212R) , 11 (OMP212L) , 12 (OMP212R) ]; 13～18: PstⅠ酶切产物为模板的扩增产物 [ 13 ( GC212L) ,
14 ( GC212R) , 15 (16S212L) , 16 (16S212R) , 17 (OMP212L) , 18 (OMP212R) ]。
F ig. 3　112% agarose gel electrophoresis of the second round PCR products from the second genom ic wa lk ing
M: 1 kb p lus marker; 1 - 6: EcoRⅠ digested temp late [ 1 ( GC212L) , 2 ( GC212R) , 3 (16S212L) , 4 (16S212R) ,
5 (OMP212L) , 6 (OMP212R) ]; 7 - 12: H indⅢ digested temp late [ 7 ( GC212L) , 8 ( GC212R) , 9 (16S212L) ,
10 (16S212R) , 11 (OMP212L) , 12 (OMP212R) ]; 13 - 18: PstⅠdigested temp late [ 13 ( GC212L) , 14 ( GC212R) ,
15 (16S212L) , 16 (16S212R) , 17 (OMP212L) , 18 (OMP212R) ].
213　新序列的分析及证实
将两次基因组步行的结果及在 rplKAJL2rpoBC, 16S/23S rRNA及 om p基因 3个位点上的已知序列
进行非冗余序列及基因的分析 , 在 rplKAJL2rpoBC位点上 5′端和 3′端分别获得了 3 218 bp和 2 653 bp
的新序列 (序列号 : EU523380和 EU523379) , 其中在 5′端 , 我们获得了 SerA 和 SuhB基因的全长序
列 , 分别为 1 176 bp和 771 bp; 在 3′端 , 我们获得了 2 266 bp rpoC基因的部分序列并将 rpoB基因序
列延长至全长 , 长度为 4 161 bp。在 16S/23S rRNA位点上 5′端和 3′端分别获得了 1 853 bp和 2 459 bp
的新序列 (序列号 : EU523375和 EU523376) , 其中在 5′端发现一个反向编码转膜蛋白 ( transmem2
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brane p rotein) 的全长基因 ; 在 3′端下游区获得了 23S rRNA及 5S rRNA基因的全长 , 分别为 2 202 bp
和 119 bp; 在 23S/5S区间 , 一个反向编码的全长细胞壁脱氢酶假基因 ( cell wall hydrolase p seudo2
gene) 也被发现 , 长度为 559 bp; 5S rRNA基因之后是一转运 RNA基因 ( tRNAM et ) , 其长度为 74 bp。
在 om p基因位点上 5′端和 3′端分别获得了 4 014 bp 和 971 bp 新序列 (序列号 : EU523377 和
EU523378) , 其中在 5′端上游区的新序列包括 4个全长基因 ( cdsA2, frr, pyrH, tsf) 和 rpsB基因的部
分序列 ; 在 3′端将 lpxA基因序列延伸至全长并获得 cds2基因的部分序列。从 rplKAJL2rpoBC, 16S/
23S rRNA及 om p基因 3个位点 5′端和 3′端设计的引物 Conf2GC2L、Conf2GC2R、Conf216S2L、Conf216S2
R、Conf2OMP2L和 Conf2OMP2R (表 2) 分别用于柑橘黄龙病感病材料和健康材料的扩增 , 结果发现
健康材料未发现扩增 , 感病材料扩增出预期的大小片段。回收片段后进行克隆测序分析 , 分析结果表
明序列长度及组成与前两次基因组步行所获得的结果一致。
3　讨论
由于柑橘黄龙病病原菌至今仍无法在人工培养基上培养 , 研究柑橘黄龙病只能通过提取寄主
DNA进行。柑橘黄龙病病原菌 DNA在寄主总 DNA中的含量非常小 , 约为 1 /1000或更低 (L i et al. ,
2006) , 因此很难获得柑橘黄龙病病原菌基因组序列信息。在本研究之前 , 在 NCB I基因库上的柑橘
黄龙病病原菌亚洲种在 rplKAJL2rpoBC、16S/23S rRNA和 om p基因位点上的序列分别为 11 260、3 619
和 5 423 bp , 有限的基因组序列信息限制了黄龙病的相关研究。
基因组步行或染色体步行是从已知序列获取侧翼序列的有效方法。本研究采用基因组步行的方法
从 3个位点上获取黄龙病病原菌已知序列的侧翼基因组序列。在准备扩增模板时 , 使用了 3种酶
( EcoRⅠ、H indⅢ和 PstⅠ) , 目的是使同一个位点的每个侧翼在同一引物的作用下其扩增的片段有重
叠区域产生。但在试验中 , 因扩增片段太小 , 太弱 , 或太多以至于难以分开 , 使得在同一个位点同一
侧翼同一引物不同模板下很难同时获得理想的扩增片段。不过 , 3种酶切产物做模板进行扩增 , 基本
上保证在每一个位点每个侧翼上至少有一种酶切产物作模板获得理想的片段。比较而言 , EcoRⅠ酶
切产物作模板较好 , 在两次基因组步行时 , 均获得了理想的扩增片段 , H indⅢ酶切产物做模板只在第
一次基因组步行时获得了理想的扩增片段 , PstⅠ酶切产物做模板只在第二次基因组步行时获得了理
想的扩增片段。因为重复序列的存在 , 通过基因组步行的方法获得的序列很可能不是线性的扩增。为
了证实两次基因组步行的结果是 3个位点上原有序列的线性扩增 , 本研究将两次基因组步行的结果及
3个位点上原有序列进行拼接 , 并根据拼接结果在 3个位点的原有序列上设计正向 (反向 ) 引物 , 在
新序列上设计反向 (正向 ) 引物 , 分别在感染黄龙病的柑橘 DNA样品及健康 DNA样品上重新验证
是必需的。
关于 rplKAJL2rpoBC位点的研究 , V illechanoux等 ( 1993 ) 第 1 次报道了 3 197 bp (序列号 :
M94319) 黄龙病亚洲种序列 , 该序列包括 nusG2rplK2rplA2rplJ2rplL基因 , 并将这些基因命名为 rplKA2
JL2rpoBC基因族。Okuda等 (2005) 在 rplKAJL2rpoBC位点上的 5′端进行了延伸 , 获得了 secE基因的
全长及 tufB基因的部分序列 , 并命名为 “tufB2secE2nusG2rplKAJL2rpoB”基因族 , 序列长度为 6 145 bp
(序列号 : Y342001)。L in等 (2008) 利用基因组步行的方法继续在该位点的 5′端和 3′端分别进行延
伸 , 在 5′端延伸了 2 920 bp (序列号 : EF164805和 DQ778017) , 将 tufB基因的序列延伸至全长 , 此
外还获得了 trmU基因的全长序列 ; 在 3′端延伸了 2 329 bp (序列号 : EF164807) , 获得了 rpoB基因
的大部分序列。本研究利用基因组步行方法 , 在 trmU基因的上游端获得了 serA及 suhB两个新的基
因 , 在 rplL 基因的下游端将 rpoB基因的序列延伸至全长 , 并获得了 rpoC基因的部分序列。最近 ,
NCB I数据库上公布了许多黄龙病的基因组序列 , 与本研究结果在 rplKAJL2rpoBC位点上相应的基因组
序列号为 NZ_ABQW 01000009。通过比较分析 , 本研究结果除在 rpoB基因及 rpoC基因区间有 42个碱
894
　4期 廖惠红等 : 利用基因组步行方法克隆柑橘黄龙病病原菌亚洲种序列 　
基的缺失外 , 与 NZ_ABQW 01000009相应的序列基本一致。至于缺失的原因是否由于黄龙病的多样性
引起 , 有待进一步研究。对于黄龙病非洲种而言 , 在 rplKAJL2rpoBC位点上 , Planet等 ( 1995) 根据
亚洲种的序列设计引物 , 在非洲种上扩增 , 获得了约 117 kb的非洲种序列 (U09675) , 包括 rplJ ,
rplL基因的全长及 rpoB基因的部分序列。Teixeira等 (2008) 利用 PCR方法获得了 rplA, rplK基因的
全长及 nusG基因的部分序列 , 从而将 rplJ基因延伸至 nusG基因 , 序列长度为 1 388 bp ( EF122255)。
目前 , 非洲种在 rplKAJL2rpoBC位点上的序列总长度为 3 061 bp , 包括 nusG、 rplK、 rplA、 rplJ、 rplL
和 rpoB基因。对于黄龙病美洲种来说 , Teixeira等 (2008) 利用染色体步行的方法第一次在 rplKAJL2
rpoBC位点上获得美洲种的病原菌序列 , 序列长度为 4 673 bp ( EF122254) , 包括 tufB、 secE、 nusG、
rplK、 rplA、 rplJ、 rplL及 rpoB基因。
关于 16S/23S rDNA位点的研究 , Jagoueix等 (1994) 利用原核生物通用引物 f2D1 / r2P1从感黄龙
病的长春花扩增出 1 450～1 500 bp (序列号 : L22532) 的片段 , 经杂交和 PCR试验证实该片段是黄
龙病亚洲种 16S rDNA的序列 ; 之后在 16S rDNA 3′端设计一引物 O I2, 在与黄龙病病原菌关系较近的
其它细菌 23S rDNA开始处设计另一引物 23S1, 引物对 O I2 /23S1用于黄龙病亚洲种的扩增 , 扩增出
595 bp (U61359) 的 16S/23S rRNA基因区间片段。对 16S/23S rRNA基因区间片段分析表明亚洲种
在该区间存在两个转运 RNA ( tRNA Ile和 tRNAA la )。L in等 (2008) 在 16S/23S rRNA位点上进一步延
伸 , 在 5′端上游区获得了 356 bp序列 , 在 3′端下游区获得了 1 260 bp序列 ( EF438153) , 序列分析
表明 3′端的 1 260 bp序列为黄龙病 23S rDNA的部分序列。本研究利用基因组步行方法 , 获得了 23S
rRNA基因的全长 , 此外在 16S rRNA基因位点上游区获得了转膜蛋白基因 , 在 23S/5S rRNA基因区
间获得了细胞壁脱氢酶假基因 , 在 5S rRNA基因之后获得了 tRNAM et基因。转膜蛋白基因与 NCB I数
据库 ABQW 01000011相应序列的碱基基本一致 , 只有少数单核苷酸发生了变化。23S rRNA基因下游
端的序列与 ABQW 01000011相应序列的碱基完全一致 , 与 Deng等 (2008) 报道的序列 ( EU644449)
有少数单核苷酸的差别 , 但对于 23S rRNA基因及 5S rRNA基因的起始位点和终止位点的解释仍没有
统一的观点。不管怎样 , 现已明确黄龙病病原菌亚洲种和其他大多数细菌一样 , 有 16S223S25S2
tRNAM et的结构。Jagoueix等于 1994、1997前后分别获得黄龙病非洲种病原菌 16S rRNA基因及 16S/
23S rRNA基因区间的序列 , 长度分别为 1 454 bp和 498 bp (L22533, U61360) , 16S/23S rRNA基因
区间包括 tRNAA la基因。Teixeira等 (2005) 利用亚洲种和非洲种引物 OA1 /O I2c及 O I1 /O I2c对巴西
圣保罗的斑驳状黄龙病样品进行检测时发现大部分样品没有产物 , 改用原核生物通用引物进行扩增获
得了黄龙病美洲种 16S rRNA基因及 16S/23S rRNA基因区间的序列 (AY742824和 AY859542) , 16S/
23S rRNA基因区间包括 tRNA Ile和 tRNAA la基因 , 目前美洲种在 16S/23S rRNA位点上的已知序列长度
为 2 062 bp。
关于 om p基因位点的研究 , Hocquellet等 (1999) 利用 RAPD方法对黄龙病进行研究 , 发现感染
黄龙病的材料有特异扩增的条带 , 回收该特异片段并进行测序分析表明该片段为 om p基因的部分序
列。Bastianel等 (2005) 利用 PCR和染色体步行的方法 , 获得了亚洲种序列 2 346 bp (AY642159) ,
该序列包括 om p基因的全长 , om p基因上游端 yaeL基因的部分序列及下游端 lpxD基因的部分序列。
L in等 (2008) 用基因组步行的方法 , 在 om p基因的 5′端上游区获得了 692 bp序列 ( EF164804) , 该
序列将 yaeL基因的序列延伸至全长 ; 在 3′端下游区获得了 1 272 bp序列 ( EF164806) , 该序列将
lpxD基因延伸至全长 , 此外还获得了 fabZ基因序列的全长及 lpxA基因的部分序列。本研究采用基因
组步行的方法 , 在 yaeL基因的上游端分别获得了 cdsA2、 frr、pyrH、 tsf、 rpsB基因 , 在 fabZ基因的下
游端将基因延伸至全长并获得 cds2基因的部分序列。本研究获得的序列与 NCB I基因库上最近公布的
ABQW 01000007相应的序列相比 , 只有少数单核苷酸的变化。在 om p基因位点上 , Bastianel ( 2005)
等首次在非洲种上获得了 3 694 bp碱基序列 (AY642158) 包括 yaeL、 om p、 lpxD基因。目前在美洲
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园 　　艺 　　学 　　报 36卷
种上尚未报道 om p基因位点的任何序列。
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