全 文 ：园 艺 学 报
, 一
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‘ 鸭梨 ’ 芽变 ‘ 闰庄梨 ’ 自交亲和性分子机制初步
研究
李晓芳 , 李茂福 , 韩振海 , 许雪峰 , 李天 忠
‘
中国农业大学园艺植物研究所 , 北京
摘 要 通过 ‘ 鸭梨 ’ 凡凡、 及其芽变 ‘ 门 , 梨 ’ 自花授粉和相互授粉结实率和种子数调查发现
,
‘ 鸭梨 ’ 自花授粉结实率为
,
果实平均种子数为 , 表现 自交不亲和性 ‘ 闰庄梨 ’ 自花授粉结实率
为
,
果实平均种子数为
,
表现 自交亲和性 以 ‘ 巾 梨 ’ 为母本 , ‘ 鸭梨 ’ 为父本 , 授粉结实
率为 , 果实平均种子数为
,
也表现亲和性 而以 ‘ 鸣梨 ’ 为母本 , ‘ 同庄梨 ’ 为父本 , 授粉结
实率仅为 , 果实平均种子数为。, 表现不亲和性 因此 , 初步推断 ‘ 门庄梨 ’ 自交亲和性可能是由于
花柱突变所致
〔
利川 ‘ 和 凡、等位基因特异性引物对 ‘ ’庄梨 ’ 自交后代 一 基因型进行鉴定 , 结果
发现 在所有后代中均有扩增条带 , 进 一 步证明
‘
门 梨 ’ 花十 , 等位从囚及其编码产物可能发生了突
变 。 蛋自质印迹杂交分析结果表明 , ‘ 庄梨 ’ 花卞
一 一 。 缺失 一条带
,
而没有缺失的条带蛋白含量
也比 ‘ 鸭梨 ’ 低 山此初步 几明 ‘ 门庄梨 ’ 的白交亲和性 可能足 , 于花丰 一 。 的突变和 表达量低所
致
关键词 梨 自交亲和性 一 。 分子机制
中图分类号 一 文献标识码
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气 文章编号 一 别 一
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一 、 飞
自交不亲和性是显花植物防止 自交衰退的一种遗传机制 。 绝大多数植物的自交不亲和性受具等位
基因的单一位点 一 控制 。 , 。 当花粉的 基因型与花柱的 基因型一致时 ,
收稿 日期 一 一 修回 日期 一 一
基金项目 北京市重点实验室 ‘ 果树逆境生理与分 子生物学实验室 ” 项 国家自然科学基金项 目 既
通讯作者 。〔, , 、 一 , , , , ,
园 艺 学 报 卷
自交不亲和性反应被激活 , 从而导致花粉的花粉管生长受阻 在单基因控制的配子体白交不亲和植物
如茄科
、
蔷薇科等 中
, 花柱 一 川 、 产物为
一 一 、 以某种方式进人花粉管中 , 作为细
胞毒素使自花的花粉管 降解 , 导致蛋白合成终结 , 花粉管生长受阻
, 不能进人胚囊完成双受精
,
蔷薇科果树大多数品种表现为自交不亲和性 , 少数品种表现为自交亲和性 其中一部分自交亲和
性品种是由于 自然突变形成 , 如日本梨 ‘ 奥嘎二 十世纪 ’ , 等 , 还有一部分是采
用射线处理
、
杂交选育等方式人工培育出来的自交亲和性品种 , 如甜樱桃
‘
拉宾斯 ’ 和 ‘ 斯坦拉 ’
, , 等。
‘ 鸭梨 ’ 是我国古老的梨树品种 , 栽植面积较大 已发现该品种有许多自然突变类型 , 其中包括
多个自交亲和芽变 。 为通过基因工程技术培育自交亲和性品种 , 解决传统人工杂交方法选育过程中难
以克服的耗时长
、
不 良基因连锁等问题
,
弄清 ‘ 鸭梨 ’ 自交亲和性芽变分子机制非常有必要
作者以 ‘ 鸭梨 ’ 及其自花结实性芽变 ‘ 习庄梨 ’ 王彦敏 等 , 为试材 , 通过授粉试验
、
后代鉴定及蛋白质印迹杂交等
, 初步确认
‘ 闻庄梨 ’ 花柱突变可能是造成其 自交亲和性的原因 , 为
进一步弄清其自交亲和性分子机制奠定了基础 。
材料与方法
授粉试验
供试品种 ‘ 鸭梨 ’ ,姚、 , 登录号 和 和 ‘ 习庄梨
’
均栽植于北京市双河
果园 。 年春选取长势均匀一致的树进行授粉试验 授粉使用当年花药在室温阴干后获得的花粉 。
花蕾期 花前 一 选留 个健壮花朵 , 去雄套袋 , 开花当天进行 自花授粉和相互授粉处理 , 再
套袋 。
一周后摘袋
,
授粉后 个月调查坐果数 。
提取及特异性 扩增
自交后代叶片采自本实验室盆栽实生苗。
总 提取依据改良的 法 乌云塔娜 等 , 。 酶
、
试剂
、
普通 聚合酶购 自
上海生工生物工程技术服务有限公司 。
根据 数据库中的 , 和 基因序列设计特异引物 。 引物由 仁海生工生物工程技术服务
有限公司合成 。
引物序列分别为 一姚』 气脚 竹
一 ‘ 一 气 竹
一 ‘ 一 ‘一 『 一 ’ 和 一 ’一竹 二 钾
一 ‘ 一 ‘一 竹
一 ‘ 一 ‘一
一 ‘ , 。 扩增条件如下 ℃预变性 , ℃变性 , ℃
退火 , ℃延伸 , ℃延伸 , 个循环 。
花柱 蛋白质印迹杂交
将 花柱放人预冷的研钵中研磨成粉末 按质量体积比加人 , 转人 离心管中 ,
加入 提取液
· 一 ’ , 、 · 一 ’ , 。 · 一 ’ , , , 飞。 · 一 ’ 竹
,
· 一 ’ , 一 甘油 , , 提取 。 离心 。 ℃
, 取上清液根据
法测定蛋白含量 。
李晓芳等
‘ 鸭梨 ’ 芽变 ‘ 门庄梨
’
自交亲和性分子机制初步研究 巧
一 电泳后 , 将蛋白转移至 膜 , 用 ‘ 红星 ’ 苹果花柱
一
兔抗体为一抗
, , 碱性磷酸酶标记山羊抗兔抗体 购自北京中杉金桥公司 为二抗 , 购
自华美生物工程公司 染色 , 进行蛋白质印迹杂交 。
结果与分析
‘ 闰庄梨 ’ 自交亲和性及突变部位初步分析
为了确定 ‘ 闻庄梨 ’ 自交亲和性及其突变部位 , 分别进行了 ‘ 鸭梨 ’ 和 ‘ 问庄梨 ’ 自花授粉与
相互授粉结实率和果实平均种子数的调查 。
从表 中可以看出 , ‘ 鸭梨 ’ 自花授粉结实率为 , 果实平均种子数为 , 表现出自交不亲和
性 , ‘ 习庄梨 ’ 自花结实率为 , 果实平均种子数为 , 表现出自交亲和性 以 ‘ 闻庄梨 ’
为母本 , ‘ 鸭梨 ’ 为父本 , 授粉结实率为 , 果实平均种子数为 , 也表现 出亲和性 , 而以
‘ 鸭梨 ’ 为母本 , ‘ 闻庄梨 ’ 为父本 , 授粉结实率仅为 , 果实平均种子数为 , 表现出强的不亲
和性 。
授粉结果显示 , ‘ 鸭梨 ’ 表现很强的自交不亲和性 , 而其芽变 ‘ 闻庄梨 ’ 表现 自交亲和性 , 由于
‘ 鸭梨 ’ 为父本给 ‘ 问庄梨 ’ 授粉表现亲和性 , 相反 , 则表现不亲和性 , 因此 , 可以初步推断 ‘ 闺庄
梨 ’ 自交亲和性突变可能发生在花柱而非花粉 。
表 ‘ 鸭梨 ’ 与 ‘ 闰庄梨 ’ 自花及相互授粉结实率及果实平均种子数
锹
‘ ’ ‘ ’
授粉组合 授粉花朵数 坐果数 结实率 果实平均种子数
, 一 一 。一 “ 一 ’ 一
‘ 鸭梨 ’ 自花授粉
‘ ’
‘ 问庄梨 ’ 自花授粉
、
‘ ’ 一 趁
‘
习庄梨 ’ ‘ 鸭梨
’
‘ 一 ’ ‘ ’
‘ 鸭梨 ’ ‘ 同庄梨 ’
‘ ’ ‘ ’
‘ 闰庄梨 ’ 自交后代的 一 基因特异性 扩增
根据对立因子假说 , 对 ‘ 闻庄梨 ’ 自交后代的 基因型进行了预测 表 。 当花柱 等位基因
及其编码产物发生突变时 , 能表现 自交亲和性 , 产生种子 。
当 等位基因及其编码产物发生突变时 , 其后代可能的 基因型为 ’
们 和 , , 应在其所
有后代中均能检测到 凡 , 等位基因的存在 。
反之 , 当 等位基因及其编码产物发生突变时 , 其后代可能的 基因型为 ’ 和 凡 ’ , 应
在其所有后代中均能检测到 凡 等位基因的存在 。
当 , 和 等位基因及其编码产物均发生突变时 , 其后代可能的 基因型为 , ’”
、
怡 、
’ 和 凡 ‘ , 在其后代中应能检测到只有 等位基因存在的植株 , 也能检测到只有 凡 等位基因存
在的植株 , 又能检测到两者都存在的植株 。
以此来判定发生突变的 等位基因 表 。
表 ‘ 闰庄梨 ’ 自交后代基因型预测
· ‘ ’
突变基因型 自交后代基囚塑 备庄
二 ‘, 一 一 一 ‘ 犷 ‘, 一一 仁一〕《 一 【 ,盆 、 , ·
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,
凡 ’ 指 乓 或 从 突变
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, ”
, ,
”’ 一 一 ,
根据这一原理 , 利用 ,
一 和 苏 一 基因特异性引物 一 ,
、
自交后代的叶片基因组 进行 一 基因特异性 扩增 ,
性扩增条带 , 而 况 只在部分自交后代中有特异性扩增条带 图
,等位基因及其编码产物可能发生了突变 , 而 没有发生突变
一
,
、 一姚 和 一戈 对 ‘ 闻庄梨 ,
结果发现 ,在所有后代中均有特异
因此
,
初步判定 ‘ 门庄梨 ’ 花柱
图 ‘ 闰庄梨 ’ 自交后代的 基因特异性扩增
‘
鸭梨 ’ 丫 习庄梨
’ 一 ‘ 日庄梨
’
自交后代
· · ‘
万 ‘ 丫 ’ ‘ 、 一 ,一 ’ 一 。 一。
、 一 。一 ‘ ‘ 、 一 、 ’
鸭梨 ’ 及 ‘ 闰庄梨 ’ 花柱 表达分析
为了检测花柱 一 的表达情况
,
首先对花柱 曾
、
蛋白进行 了
一 电泳分析 图
, 在
上样量相同的情况下
, 未发现 ‘ 鸭梨 ’ 和
‘ 问庄梨 ’ 花柱蛋白表达上的差异
图 ‘ 鸭梨 ’ 和 ‘ 闰庄梨 ’ 花柱总蛋白 电泳图
上样量为 卜
,
箭头所指为 , 、 位置
标准蛋白 丫
‘
月庄梨 ’ ‘ 鸭梨 ’
一 ‘ ’ ‘ ’
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期 李晓芳等 ‘ 鸭梨 ’ 芽变 ‘
二
庄梨 ’ 自交亲和性分子机制初步研究
蛋白质印迹杂交分析结果发现
, 在 ‘ 鸭梨
’ 及 ‘ 门庄梨 ’ 花柱总蛋白上样量一致的情况下 , 染
色时间较短 时 ,
‘
鸭梨
’ 花柱 一 出现两条带
, 而 ‘ 闰庄梨 ’ 花柱的 一 没有信
号 图 , 但当染色时间较长 时 , ‘ 鸭梨
’ 花柱的 一 有两条带 , 而 ‘ 问庄梨 ’
花柱的 一 只有一条带 , 且这条带表达量显著低于 ‘ 鸭梨 ’ 图 , 卜 、
、
为了进 一步验证 ‘ 闻庄梨
’
花柱 一 含量 , 增加 了 ‘ 问庄梨 ’ 花柱总蛋白的上样量 , 即分
别上样
、 、 林 , 进行印迹杂交分析
,
结果显示 ‘ 阅庄梨 ’ 花柱的 一 仍然只有一条带 ,
且不如 ‘ 鸭梨 ’ 花柱 一 条带清晰 图 ,
根据以上结果初步推测 , ‘ 间庄梨 ’ 的一 个 一 表达缺失 , 同时另一个 一 的表达量显
著低于正常水平
图 ‘ 鸭梨 ’ 和 ‘ ’庄梨 ’ 花柱 印迹杂交分析
染色时间 , , ,
,
上样量 卜 染色“寸司
, 上样星 卜
染色时 飞 ,
,
不同上样量 林只
, 卜 , 卜
‘ 鸭梨
’ ‘ 庄梨 ’
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讨论
不同果树树种自交亲和与不亲和性的判定标准不同 , 且 同一树种不同研究者掌握的尺度也不同 。
等 认 为 , 梨树授粉结实率在 以下被认定 为不 亲和 , 而在 以上 为亲和性 。
等 认为苹果授粉亲和与不亲和性应从果实平均种子数和结实率两方面结合判定更精
确 , 即结实率在 , 果实平均种子数在 个以下的为不亲和 , 结实率在 一 和果实平均
种子数在 一 个为亲和与不亲和的混合范围 , 结实率在 , 果实平均种子数在 个以上的为亲和
性 。 综合分析近年来果树授粉亲和与不亲和性判定标准 , 该试验将结实率 , 果实平均种子数
个作为判定基准 。 通过自交与相互授粉试验 , 判定
‘ 间庄梨 ’ 表现 自交亲和性 , 同时初步推断 ‘ 闺
庄梨 ’ 自交亲和性突变可能发生在花柱部位 。
蔷薇科果树发生 自交亲和性突变的途径有 自然突变和人工诱导突变 , 突变类型有花柱突变体和花
粉突变体 。 在自交亲和性 日本梨品种 ‘ 奥嘎二十世纪 ’ 中 , 花柱 等位基因之一发生突变或缺失使
之在花柱中不表达是形成 自交亲和的原因
,
但并不影响在花粉中的表达 , 张绍铃
等
, 。 本研究通过 ‘ 闰庄梨 ’ 后代 一 基因特异性 扩增结果证明 又 等位基因及其编
码产物突变可能是导致其 自交亲和性的原因 , 但蛋白质印迹杂交显示 , ‘ 同庄梨 ’ 花柱 一 之一
缺失 , 另一个表达量比 ‘ 鸭梨 ’ 少 , 其结果与 ‘ 奥嘎二十世纪 ’ 梨类似 。 但现在还不能确认 ‘ 闻庄
园 艺 学 报 卷
, 自交亲和性是否只是由于花柱
一 之一缺失造成的 , 或与另一花柱
一
。 另外 , 在蛋白水平上是不是 乓一 缺失 , 还需进行质谱分析判定 。 ‘ 闺庄梨 ’
表达量少也有
花柱 一
梨关
缺失和表达量降低的原因还有待基因和基因转录水平的研究 。
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王彦敏 申连长
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张喜焕
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傅玉瑚
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杨 淳
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张丙昌 】 鸭梨新优系选育初报 河北果树 增刊 一
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乌云塔娜 , 张党权
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谭晓风 梨不同 提取方法的效果研究 中国生物工程杂志
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张绍铃
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徐国华
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刘友良 梨 自交不亲和及其亲和突变品种花柱内 “ 犷““ ’ 基因表达与作用的比较 植
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