全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（10）：1661–1666
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2010–06–13；修回日期：2010–08–24
基金项目：国家‘863’计划项目（2008AA10Z155）；国家公益性行业科技计划项目（nylyzx7-007）；华中农业大学科技创新基金项目
（2008XCX014）；国家大学生创新性实验计划项目（200810）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zbye@mail.hzau.edu.cn；Tel：027-87286867）
芥菜型油菜雄性不育系与甘蓝远缘杂交胚培养
及早代育性鉴定
王涛涛，蔡晓峰，张俊红，李汉霞，叶志彪*
（华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，华中农业大学园艺林学学院，武汉 430070）
摘 要：为了将优异的芥菜型油菜雄性不育性转育到甘蓝中，对甘蓝和芥菜型油菜不育系远缘杂交
胚的发育情况进行了研究，结果发现杂交胚发育 10 d 左右后开始败育。在杂交胚发生败育之前进行胚离
体培养，在 MS 基本培养基中添加 1 mg · L-1 BA，0.1 mg · L-1 NAA 和活性炭的条件下，得到了远缘杂交
胚发育而成的植株。进而利用石蜡切片对远缘杂交植株的不育性进行了显微观察，发现其败育的时期发
生在雄蕊原基分化时期。
关键词：甘蓝；芥菜型油菜；雄性不育；胚培养
中图分类号：S 635 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）10-1661-06
The Culture and Early Male Sterile Identification of Distant Hybrid
Embryos Derived from Brassica oleracea var. capitata L. and Male Sterile
Line in B. juncea
WANG Tao-tao，CAI Xiao-feng，ZHANG Jun-hong，LI Han-xia，and YE Zhi-biao*
（Key Laboratory of Horticultural Plant Biology，Ministry of Education，Huazhong Agricultural University，College of
Horticulture and Forestry，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）
Abstract：The development of the distant hybrid embryos derived from Brassica oleracea var. capitata
L. and male sterile line of B. juncea were investigated in this study. The results showed that the hybrid
embryos began to abort in approximate 10 days after pollination. Some hybrid plantlets were obtained by
using ovule rescue culture in vitro in MS media supplemented with 1 mg · L-1 BA，0.1 mg · L-1 NAA and
activated charcoal. The development of anther in distant hybrid plants were examined using paraffin
section，and the abortion was found in the differentiation stage of stamen primordium.
Key words：Brassica juncea；male sterile；cabbage；ovule rescue culture
十字花科作物存在明显的杂种优势，杂种一代的生产主要利用自交不亲和系和雄性不育系两条
途径。但自交不亲和系存在繁殖成本高，多代自交易出现生活力衰退，杂交种难以达到100%等缺陷。
而利用雄性不育系生产一代杂种则具有明显的优势。
目前国内外已报道的十字花科细胞质雄性不育类型很多，主要有Pol CMS（Fu，1981）、tour CMS
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（Rawat & Anand，1979）、Ogu CMS（Ogura，1968）等，应用最广泛的是波里马细胞质雄性不育
（Pol CMS）、萝卜细胞质雄性不育（Ogu CMS）。Pol CMS已经陆续转育到大白菜、菜薹、红菜薹
等作物中。但温度敏感和存在微量花粉仍是其应用的主要问题。Ogura不育细胞质是Ogura（1968）
在萝卜自然群体中发现的细胞质不育类型，萝卜不育系最初存在低温苗期黄化、蜜腺不发达等问题。
后来通过原生质体融合方法获得了无黄化，生长正常的新的Ogura CMS，随后转育到甘蓝、大白菜、
青花菜等十字花科作物中（Sigareva & Earle，1997）。方智远等（2001）从美国引进该不育材料，
用30多个不同类型的甘蓝和青花菜自交系与它们进行回交转育，回交后代在低温下叶色不黄化，大
多数开花正常，雌蕊正常，但存在个别植株死蕾现象。
甘蓝显性雄性不育材料是从甘蓝原始材料79-399自然群体中发现的（方智远 等，1997），经研
究发现控制其不育性的主效基因为一显性核基因，并有修饰基因起作用。目前已选出几个优良的甘
蓝显性不育系，其不育株率和不育度均为100%，其它各方面表现正常，已用该雄性不育系与优良自
交系杂交，选育出一批优良的杂交组合。其中中甘16号、中甘17号、中甘18号已通过国家农作物品
种审定委员会审定。
芥菜型油菜细胞质雄性不育是在华中农业大学实验田中发现（万正杰，2006），命名为 hau CMS，
当时用相邻的芥菜型油菜保持下来，在武汉和兰州不同环境条件下 6 年的育性调查发现，hau CMS
不受环境条件影响，没有花粉产生，不育性非常彻底，没有蕾败现象。目前已经将这种新的雄性不
育转移到不同油菜品系和部分蔬菜中（Wan et al.，2008），但由于远缘杂交不亲和，目前还没有转
育到甘蓝上。为了丰富甘蓝雄性不育的类型，弥补目前一些甘蓝雄性不育系的不足，实现新的种质
资源的综合利用，作者通过远缘杂交结合胚培养的方式，将芥菜型雄性不育系转育到甘蓝上，对杂
交后代的不育性进行了切片观察，以期能创造更加稳定，不育彻底的甘蓝雄性不育新类型。
1 材料与方法
1.1 材料
芥菜型油菜雄性不育系（hau CMS）来自华中农业大学油菜组傅廷栋院士。回交亲本为 12 个甘
蓝自交系及 DH 系，均来自本实验室。试验从 2007 年到 2010 年在华中农业大学蔬菜基地及园艺植
物生物学教育部重点实验室进行。
1.2 授粉及胚珠观察
选取发育一致的花朵，在授粉后 5、8、9、10、11、12 和 15 d 对胚珠的发育情况进行观察，并
拍照，以调查植株授粉后角果内胚珠开始败育的时间。
1.3 远缘杂交胚培养
取授粉后 8 ~ 10 d 的合子胚进行培养。角果首先用 75%的乙醇消毒 1 min，然后用有效氯浓度为
6% ~ 7%的 84 消毒液消毒 10 min，再用无菌水冲洗 3 ~ 4 次。用镊子和解剖针将角果切开，将幼胚
取出放入培养基中培养。幼胚培养基 E1（MS + 1 mg · L-1 BA + 0.1 mg · L-1 NAA + 2%蔗糖）和 E2
（NLN + 1 mg · L-1 BA + 0.1 mg · L-1 NAA + 13%蔗糖）设添加和不添加活性炭两种处理，培养基 pH
值调至 5.8 ~ 6.0，在高压灭菌锅中灭菌 17 min。每个培养皿接种胚不多于 100 个，于 24 ~ 26 ℃，转
速为 60 r · min-1 的摇床上振荡培养，直至形成子叶型胚。将成熟的胚转移到固体培养基 E3（B5 + 2%
蔗糖 + 0.8%琼脂）上培养成苗，在生根培养基 E4（MS + 0.2 mg · L-1 NAA + 2%蔗糖 + 0.8%琼脂）
上诱导生根。
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1.4 胚败育的石蜡显微切片
取远缘杂交后代及对应的可育的甘蓝自交系不同大小的花蕾，固定后，按照常规石蜡法程序制
作切片：各级酒精脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→展片→脱蜡→染色→封藏。切片厚度为6 ~ 8
µm，爱氏苏木精稀释液染色（爱氏苏木精原液1份，加入50%酒精与冰醋酸等量混合液1份），选择
有代表性、结构完整、染色清晰的切片用树胶封藏，制作永久切片，然后观察并拍照（王灶安，1992）。
2 结果与分析
2.1 授粉后胚珠败育时期观察
通过对芥菜型油菜授粉后不同发育天数角果的观察，发现 5 d 时角果内胚珠发育良好（图 1，A），
颜色嫩绿，但大小却参差不齐，差异明显，可能有些胚在很早期就已经败育了。在 8 ~ 9 d 后，发育
不良的小胚珠已经死亡，但膨大的胚珠状态仍比较好（图 1，B、C），在 10 d 时角果内大部分胚珠
开始萎蔫，少数胚珠仍然具有活力（图 1，D）。11 ~ 12 d 时大部分胚珠已经败育，剩下的少数几个
也开始变褐发黑，活力明显降低（图 1，E、F）。15 d 后胚败育情况越明显，基本全部萎缩发黑，死
亡（图 1，G）。由此可以看出，授粉后胚珠在前期发育良好，在 10 d 左右开始败育。
图 1 甘蓝和芥菜型油菜不育系授粉杂交不同天数后角果内胚珠发育情况
A ~ G：分别代表授粉后5、8、9、10、11、12和15 d。
Fig. 1 Ovule developmental condition in pod after pollination different days in the hybrid of cabbage and male sterile rapeseed
A–G：Ovule after pollination 5，8，9，10，11，12 and 15 d respectively.
2.2 胚抢救及再生植株性状观察
2007 年春季，利用 12 个甘蓝自交系或 DH 系对芥菜型油菜不育系进行授粉，取授粉后 8 ~ 10 d
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的胚珠进行离体培养，大约 10 d 后，在添加了活性炭的 E1 培养基中有幼胚萌发，两个杂交组合中
共获得 65 个发育正常的胚，由此可见，回交所用的甘蓝基因型对胚抢救也有一定的影响。
培养 2 周后，待幼胚形成子叶期成熟的胚，将其转移到 E3 培养基上进行培养。待苗长到一定
大小时，切取幼芽转入生根培养基 E4，幼芽生根非常迅速，幼苗生长快。待苗长到一定大小，炼苗
后移栽到温室。移栽后生长状态良好，叶深绿，圆形，与甘蓝叶片的形状相似，但叶柄明显比甘蓝
长，同时具有芥菜型油菜的特点（图 2，A、B），特别是在后期，叶片上会长出小叶，与芥菜型油
菜相似。从这些农艺学性状来看，这些植株确实为甘蓝与芥菜型油菜杂交后形成的植株。
2008 年春季田间观察发现，胚培养形成的远缘杂交植株生长健壮，蜜腺和雌蕊正常，能正常招
引蜜蜂传粉，而雄蕊则完全退化，没有花粉，表现为 100%彻底的不育性状（图 2，C），不育性状未
与不良农艺性状连锁。同年，在隔离区间内，通过多次重复授粉的方法，克服了远缘杂交的不亲和
性，获得了 BC1 代种子。于 2008 年秋季播种后，在 2009 年春季，对 BC1 代植株的性状和育性进行
了调查，发现 BC1 代植株的农艺学性状分离较大，叶片基本趴地生长，叶片颜色深浅各异，有些叶
片上有小叶，与油菜相似，有些没有，与甘蓝相似（图 2，D），对其所有植株育性调查发现仍为 100%
不育，没有育性分离。2010 年春季，同样通过多次重复授粉的方法，目前已经获得了 BC2 代的种子，
其各种性状有待进一步调查研究。
图 2 远缘杂交胚培养形成再生植株的性状
A：移栽后的幼苗；B：胚抢救植株田间生长状态；C：胚抢救植株的花朵；D：BC1代植株的田间生长状态。
Fig. 2 The feature of regenerated plants derived from embryo rescue
A：The plantlet after transplantation；B：The plants derived from embryo rescue in the field；
C：The flower of plant derived from embryo rescue；D：BC1 generation plants in field.
2.3 胚培养再生植株不育性切片观察
胚培养再生植株育性观察见图 3，A、B，长约 1.30 mm 的花蕾，最外层为花萼，其次是花瓣，
中间 6 个花药紧紧围绕着花柱，花药绒毡层细胞明显增厚，没有正常分化花粉囊；图 3，C 是长度
约 2.00 mm 花蕾纵切图，可以看出其雌蕊发育正常，中间胚珠清晰可见，雄蕊退化与花瓣相似，花
药部位略微增大，下部有短缩的花丝；图 3，D、E 是花蕾长约 4.0 mm 时的横切和纵切图，雌蕊基
本上发育成熟，但雄蕊仍然异常短缩，花药部位没有分化；花药大小不等，有的如同花瓣没有花丝
10 期 王涛涛等：芥菜型油菜雄性不育系与甘蓝远缘杂交胚培养及早代育性鉴定 1665
的分化，有的稍有分化，但花药没有发育。图 3，F 为回交亲本可育花蕾的花药纵切图，可以清晰
地看见 6 个花药饱满，每个花药形成 4 个正常的蝶形花粉囊，花粉粒充实。
通过石蜡切片可见，该细胞质雄性不育材料的 6 枚雄蕊有些转变为小花瓣，不能形成正常的花
丝和花药，没有花粉囊，后期有不明显的花药、花丝的分化，败育时期发生在雄蕊原基分化时期。
其主要特点是雄蕊原基偏离正常的分化轨道，有些形成花瓣原基，与正常的花瓣相比，由雄蕊退化
的花瓣较正常的花瓣厚，细胞层数多，没有产生孢原细胞的分化。细胞层数增加，没有孢原细胞的
形成，更无造孢细胞和花粉囊的形成，说明其雄蕊己完全退化。
图 3 不同发育时期花蕾石蜡切片观察
A、B：长度为1.3 mm不育花蕾的横切面和纵切面；C：长度为2.0 mm的不育花蕾纵切面；
D、E：长度为 4.0 mm的不育花蕾横切面和纵切面；F：为回交亲本可育花蕾的横切面。
Fig. 3 The paraffin section of buds during the period of different development stages
A–E：The transverse and vertical section of 1.3 mm bud（A，B），the vertical section of 2.0 mm bud（C），the transverse and vertical section of
4.0 mm（D，E）bud in distant hybrid plants respectively；F：The transverse section of fertility bud in back cross parent.
3 讨论
目前国内外报道的十字花科作物细胞质雄性不育（CMS）类型，在不育系的花药发育过程中，
花粉败育形式和时期是多种多样的。黑芥胞质不育 Ni CMS 败育时期非常早，主要败育时期为造孢
细胞期，败育特征为绒毡层细胞分化和发育异常（康俊根，2006）。红菜薹 Polima CMS 花药发育受
阻于孢原细胞分化期，没有孢原细胞分化，不形成药室（田福发 等，2004），这与 Polima CMS 不
结球白菜和甘蓝型油菜花药败育的细胞形态学研究结果一致，表明 Polima CMS 在不同的作物上有
相同的败育特征（余凤群和傅廷栋，1990）。甘蓝型油菜 Ogu CMS 花药发育受阻于四分体到单核花
粉形成之间；芥菜型油菜 tour CMS 败育时期在孢原细胞时期至花粉粒形成各个时期（万正杰，2006）。
Wan 等（2008）对芥菜型油菜细胞质雄性不育材料进行观察表明，这一不育材料与前人研究的
不育胞质明显不同，败育时期较早，发生在雄蕊原基分化时期，败育时期比以前报道的油菜细胞质
雄性不育类型（Pol、tour、nap、Ogu）都要早。由于雄蕊原基偏离正常的分化轨道，形成花瓣原基，
不形成孢原细胞和正常的花粉囊。未看见花药的分化，6 枚雄蕊完全转变为小花瓣。但本研究中看
到有花药形态的简单分化，特别是在后期可以看见类似花药的结构，但是绒毡层明显增厚，没有形
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成花粉囊，也没有花粉粒的形成。说明此类雄性不育性转育到不同材料后，其不育的表现会发生变
化，其机理有待进一步研究。
另外通过对授粉后角果内胚珠的观察可知道，胚珠败育的时间非常早，在授粉 5 d 后，部分胚
珠就明显小于正常胚珠，这些小胚珠很快就萎缩死亡了，而另外部分较大的胚珠到 9 和 10 d 也开始
败育。大白菜和羽衣甘蓝杂交胚在 17 d 后都有成活，利用授粉后 14 d 的杂交胚离体培养也获得了
成功（祝朋芳 等，2008）。与此相比本试验材料的败育时期要更早些。远缘杂交的后代一般要经过
多次的胚抢救才能获得与回交亲本亲和的后代，但是本试验通过在隔离区间内，利用多次重复授粉
的方法，在 BC1 和 BC2 代均获得了回交的种子，大大简化了回交的流程，为获得纯合的甘蓝不育系
和保持系提供的基础。
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