全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (10) : 1431 - 1436
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 05 - 21; 修回日期 : 2009 - 09 - 16
基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( 30571293 ) ; 教育部博士点基金项目 ( 200803890009 ) ; 福建省自然科学基金项目
(2007J0045)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: weichen909@1631com)
龙眼 142323基因的克隆与原核表达
游向荣 1 , 王　平 2 , 梁文裕 1 , 郑少泉 3 , 陈　伟 13
(1福建农林大学生命科学学院 , 福州 350002; 2 福建农林大学园艺学院 , 福州 350002; 3 福建省农业科学院果树研究
所 , 福州 350013)
摘 　要 : 以龙眼 (D im ocarpus longan Lour. ) 为试材 , 应用同源克隆和 RACE方法从花芽中获得了调控
蛋白 142323的全长 cDNA序列 , GenBank登录号为 FJ479618 ( GI: 218202931)。该 cDNA全长 1 121 bp, 包
括一个 783 bp的开放阅读框 , 编码 261个氨基酸 , 序列比较分析显示 142323 cDNA具有较高的保守性。半
定量 RT2PCR分析结果表明 , 142323 mRNA在龙眼叶芽、叶片、花芽和成熟的花中都有表达 , 但在花芽中
表达量最大。构建了 pET142323原核表达系统 , 将 142323全长 cDNA在大肠杆菌中表达 , 获得一个分子量
约为 34 kD的可溶性融合蛋白 , 经 W estern blotting验证 , 该蛋白为 142323蛋白。
关键词 : 龙眼 ; 花芽 ; 142323基因 ; 克隆 ; 原核表达
中图分类号 : S 66712; Q 78　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 1021431206
C lon ing and Prokaryotic Expression of 142323 Gene in L ongan
YOU Xiang2rong1 , WANG Ping2 , L IANG W en2yu1 , ZHENG Shao2quan3 , and CHEN W ei13
(1 College of L ife Science, Fu jian A gricu lture and Forestry U niversity, Fuzhou 350002, Ch ina; 2 College of Horticulture, Fujian
A griculture and Forestry U niversity, Fuzhou 350002, Ch ina; 3 Fruit Research Institu te, Fujian A cadem y of A gricu lture Sciences,
Fuzhou 350013, Ch ina)
Abstract: Full length cDNA of 142323 gene, encoding a p lant regulatory factor, was isolated from longan
(D im oca rpus longan Lour. ) using homology2based cloning and RACE methods. The accession number of the
gene in GenBanks is FJ479618 ( GI: 218202931). The full length cDNA is of 1 121 bp, with a 783 bp open
reading frame encoding 261 am ino acids. Homology analysis showed that the longan 142323 cDNA has high
consensus regions. Sem i2quantitative RT2PCR analysis detected the exp ression of 142323 gene in longan foliar
buds, leaves, mature flowers, and most up2regulated in flower buds. The p rokaryotic exp ression vector was
constructed and was exp ressed in E1coli; and a recombinant p rotein with a molecular weight of 34 kD was ob2
tained by SDS2PAGE analysis. W estern blotting confirmed the p rotein was 142323 p rotein.
Key words: longan; flower bud; 142323 gene; clone; p rokaryotic exp ression
龙眼是我国南方特产的亚热带果树。当前 , 在龙眼生产中存在着产量不稳和大小年结果的问题 ,
小年产量往往不及大年的一半。造成龙眼大小年结果的原因是多方面的 (吕柳新和林顺权 , 1995) ,
其中 , 成花质量与龙眼产量密切相关 , 龙眼花芽分化的好坏以及成花量的多少对龙眼的产量影响很大
(林顺权和胡又厘 , 2001)。因此 , 研究龙眼花芽分化分子调控机理有着重要的理论和生产意义。
142323蛋白作为一类重要的调控蛋白 , 调控植物发育过程的信号转导 , 从而发挥其生物学功能
(Roberts, 2000)。142323蛋白调控的植物细胞功能涉及代谢酶合成、囊泡穿梭、细胞周期、细胞凋亡
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和细胞信号转导等多方面 , 因此 142323蛋白在调控糖、氨基酸、核酸和蛋白质生物合成的代谢中处
于中心地位 (Roberts, 2003)。
本研究中应用分子生物学方法克隆并原核表达了 142323基因 , 以探讨其在龙眼成花过程中可能
的生物学功能 , 为阐明 142323基因在龙眼成花中的重要调控作用奠定试验基础。
1　材料与方法
111　材料
龙眼 (D im ocarpus longan Lour. ) 品种为 ‘龙优 ’, 种植在福建省莆田市农业科学研究所果树分所
龙眼品种园。选用生长发育一致的 20年生植株 3株 , 分别采集龙眼花芽、叶芽、盛花期的花及叶片 ,
装于液氮罐中带回实验室后 , 立即贮于 - 80 ℃冰箱备用。试验于 2007—2008年进行。
112　总 RNA提取和 RACE方法克隆 142323
龙眼花芽总 RNA以 SDS法提取 (章希娟 等 , 2008) , 采用 Fermentas公司 RevertA idTM Furst Strand
cDNA Synthesis试剂盒合成 cDNA第一链 , 以反转录模板直接进行 PCR反应。
以 MALD I2TOF2TOF /MS分析鉴定的 142323蛋白氨基酸序列为主要参照 , 运用 BLAST程序对 Gen2
Bank进行搜索 , 选取与龙眼亲缘关系较近植物的 142323核酸序列进行比对分析并设计保守区特异性
引物 , 上游引物 ( P1 ) 为 : 5′2AGAAATGGTGGAGTTTATGG23′, 下游引物 ( P2 ) 为 : 5′2GATTGT2
CACGGAGAAGTTGC23′。PCR扩增条件为 : 95 ℃变性 5 m in, 95 ℃ 1 m in, 52 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 m in进
行 35个循环 , 72 ℃延伸 5 m in。
PCR产物以 1%琼脂糖凝胶电泳回收 , 连接到 pMD182T载体上 , 热激转化大肠杆菌 DH5α感受态
细胞 , Amp抗性筛选和 X2gal/ IPTG蓝白斑筛选。选取白色菌落进行液体培养 , PCR检测阳性克隆 ,
送上海英骏生物技术公司测序。
根据保守区扩增产物的测序结果设计 3′RACE特异性引物 : 5′2GTCCCATCTCATTCCCTCGGCT2
TCGTCA23′和 5′RACE特异性引物 : 5′2CCACGAAGCCCTCCTAGCCCCAATCACA23′, 采用 Clontech公
司的 SMARTTM RACE cDNA Amp lification试剂盒进行 3′端和 5′端的 RACE反应。将 3′端和 5′端的
RACE反应产物分别回收 , 连接 pMD182T载体 , 转化测序。
113　序列分析
将 5′RACE、3′RACE及中间序列测序结果提交 NCB I进行 BLAST检索 , 确认为 142323基因同源
序列后拼接得到龙眼 142323 cDNA全长序列 , 并应用 BLAST程序在 GenBank上进行相似性比较 , 应
用软件 DNAMAN 对龙眼与其他植物的 142323核苷酸序列进行同源性比较分析并绘制系统进化树。
114　RT2PCR分析 142323的表达
分别提取龙眼叶芽、叶片、花芽和成熟的花中的总 RNA, 分光光度法定量后转录合成 cDNA 第
一链 , 设计龙眼 142323特异性引物。14P1: 5′2GTCGCCTACTGAATCATCTCGT23′; 14P2: 5′2TGTGG2
TAATCACCCTTCATCTT23′, RT2PCR检测 142323的表达量。 PCR扩增条件为 : 95 ℃ 5 m in, 95 ℃ 1
m in, 54 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s进行 30个循环 , 72 ℃延伸 5 m in。以龙眼β2actin基因作为内参 , 引物为
ACT1: 5′2CTATGAGTTGCCTGATGGAC23′, ACT2: 5′2TGCTGAGGGATGCTAAGATG23′, PCR扩增参数
与 142323一致。
115　142323全长 cD NA克隆及原核表达
根据 5′RACE、3′RACE及中间序列测序结果拼接而成的 142323 cDNA, 重新设计扩增全长基因
cDNA 的引物 : AP1为 5′2GCGGGATCCATGTCGCCTACTGAATCATCTCGTG23′; AP2为 5′2GCGCTCGAG2
GCTGTCAACACTCAAGATTATCACT23′, 进行 PCR扩增。
纯化的 PCR产物和 pET228a载体以 B am HⅠ和 X hol Ⅰ双酶切 , 回收酶切产物 , 连接目的基因与
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载体片段 , 转化 DH5α感受态细胞 , Kan抗性筛选阳性克隆 , 提质粒酶切鉴定 , 鉴定正确的质粒转化
BL21感受态细胞 , 以终浓度为 012 mmol·L - 1的 IPTG诱导 142323的表达。SDS2PAGE电泳分析。
116　W estern blotting鉴定
SDS2PAGE后 , 用半干转移仪将蛋白从凝胶转移到硝酸纤维素滤膜 (NC膜 ) 上 , 20 mL 5%脱脂
奶粉封闭。一抗为 1∶200兔抗拟南芥 142323多克隆抗血清 , 二抗为 1∶5 000 HRP标记的羊抗兔 IgG。
用化学显色蛋白免疫印迹法进行 W estern blotting分析。
2　结果与分析
211　142323全长 cD NA克隆及序列分析
以逆转录合成的 cDNA为模板 , 利用一对特异性引物 P1、P2进行保守区 PCR扩增 , 产物经琼脂
糖凝胶电泳得到一段约 600 bp的 DNA条带 (图 1) , 对该片段进行回收测序 , 得到一段 622 bp的
cDNA序列 , 经 DNAMAN和 BLAST比对分析 , 该序列为 142323cDNA的同源片段。
图 1　龙眼花芽 142323 RT2PCR扩增结果
M: 100 bp DNA分子量标准 ; 1: 142323保守区特异扩增结果 ; 2: 142323 3′RACE扩增结果 ;
3: 142323 5′RACE扩增结果 ; 4: 142323全长 cDNA扩增结果。
F ig. 1　RT2PCR am plif ica tion product of 142323 cD NA sequence in longan flower buds
M: 100 bp DNA ladder; 1: Amp lification of 142323 conservative region; 2: 3′RACE amp lify of 142323;
3: 5′RACE amp lify of 142323; 4: Amp lification of 142323 full length cDNA.
以带有 UPM接头的 cDNA为模板 , 利用 3′RACE特异性引物 AP1和 UPM引物进行扩增 , 获得一
个约 900 bp的 DNA条带 , 对该片段进行回收测序 , 得到一段 920 bp的 cDNA序列 , 该片段包含一个
多聚腺苷 (p loy A) 尾 , 并有 354 bp与保守区测序结果重叠。
以带有 UPM接头的 cDNA为模板 , 利用 5′RACE特异性引物 AP2和 UPM引物进行扩增 , 获得一
个约 300 bp的 DNA条带 , 对该片段进行回收测序 , 得到一段 310 bp的 cDNA序列 , 该片段有 131 bp
与保守区测序结果重叠。
将 3个片段进行拼接 , 获得 1 121 bp的 142323 cDNA全长序列 (图 2) , 该 cDNA序列包含一个
783 bp的完整开放阅读框 , 已登录 GenBank, 登录号为 FJ479618。该开放阅读框编码一个具有 261个
氨基酸残基的蛋白 , 推测其分子量为 2914 kD。在 3′开放阅读框处包含 194 bp的 UTR结构。
通过与 GenBank上其他植物进行 BLAST比较发现 , 龙眼 142323基因具有较高的保守性 , 与苹果
(M alus dom estica) 142323基因同源性达 82% , 与杨树 ( Populus canescens) 同源性达 8017% , 与拟南
芥 (A rabidopsis tha liana) 同源性达 78% , 与木薯 (M anihot escu len ta) 同源性达 7614% , 与大花牵牛
( Ipom oea n il) 同源性达 7519% , 与烟草 (N icotiana tabacum ) 同源性达 73% , 与番茄 (L ycopersicon
escu len tum ) 同源性达 72% , 与水稻 (O ryza sa tiva ) 同源性达 70% , 与玉米 ( Zea m ays) 同源性达
66% (图 3)。
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212　RT2PCR分析 142323组织表达特性
以龙眼不同组织的总 RNA为模板 , 以β2actin基因为内参 , 对 142323进行半定量 RT2PCR分析。
结果显示 , 142323 mRNA在叶芽、叶片、花芽和成熟的花中都有表达 , 但在花芽中表达量最大 (图
4)。
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图 4　龙眼 142323组织特异性表达分析
1: 叶芽 ; 2: 叶片 ; 3: 花芽 ; 4: 花。
F ig. 4　Ana lysis of the expression of 142323 in d ifferen t tissues of longan
1: Foliar bud; 2: Leaf; 3: Flower bud; 4: Mature flower.
213　142323在大肠杆菌中诱导表达
将 pET28a2142323阳性质粒转化到 BL21感受态细胞中 , 并以 IPTG诱导 142323表达 , 1215% SDS2
PAGE电泳结果如图 5, 2～4道电泳图谱可见大量外源蛋白的表达 , 参照蛋白分子量标准 , 外源蛋白
分子量约为 34 kD, 符合预测的 142323蛋白分子量 , 表达的融合蛋白带有组氨酸标签 , 后期可纯化制
备抗体。
经凝胶扫描测定 , 经凝胶扫描测定 , 外源蛋白约占细菌蛋白总量的 2815%。
图 5　142323在大肠杆菌中表达的 SD S2PAGE电泳图谱
M: 蛋白分子量标准 ; 1: IPTG诱导的空质粒转化子 ; 2～4: IPTG诱导的阳性质粒转化子。
F ig. 5　SD S2PAGE map of 142323 expressed in E. coli
M: Protein marker; 1: IPTG induced negative transformant; 2 - 4: IPTG induced positive transformant with pET28a2142323.
214　W estern blotting鉴定
应用兔抗拟南芥 142323多克隆蛋白抗体对
SDS2PAGE结果进行验证 , 可见诱导后的细菌有
预期大小的显色条带 , 而空载体对照无此条带
(图 6 ) , 证明表达的外源蛋白确实为 142323蛋
白。
图 6　142323蛋白的 W estern blotting杂交图谱
C: 空质粒转化子 ; 1～3: 阳性质粒转化子。
F ig. 6　W estern blotting prof ile of 142323
C: Negative transformant; 1 - 3: Positive transformant
with pET28a2142323.
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3　讨论
142323蛋白在植物生长发育过程的信号转导中处于中心地位 (Oksvold et al. , 2004) , 作为植物
生长发育的重要调节因子参与了植物成花转变阶段的调控。
余梅等 (2007) 利用 cDNA2AFLP技术对茶树花蕾发育早期和晚期的差异表达进行分析 , 发现
142323基因在花蕾发育晚期阶段特异表达 , 推测 142323基因在花蕾发育中可能起重要作用。Mayfield
等 (2007) 通过对拟南芥光周期开花控制的研究 , 发现 142323蛋白缺失的突变植株开花延迟且对光
周期信号响应不敏感 , 他们认为这一现象与 142323蛋白在光敏色素 B信号途径中的作用一致 , 酵母
双杂交试验证明 142323通过与光周期调控关键因子 CONSTANS互作以调控开花周期。Daugherty等
(1996) 对拟南芥 142323蛋白进行组织定位发现 , 在成花早期 , 142323蛋白在花芽中大量累积 , 且在
花熟阶段的表达活性主要集中于柱头、花粉囊和花粉中 , 原位杂交试验也证明 142323 mRNA在花芽
中的大量累积。Pertl等 (2006) 认为膜结合 142323蛋白可能通过调控质膜 H + 2ATP酶活性 , 以二聚
体形式进入胞质 , 进而在花粉发育过程中起作用。
半定量 RT2PCR结果显示 , 与在叶芽、叶片等组织中的表达量比较 , 142323在龙眼花芽中的表达
有较明显的上调 , 说明 142323在龙眼成花过程的细胞信号传导和基因表达调控中可能起重要作用 ,
本研究成功克隆了龙眼 142323基因并在大肠杆菌中表达 , 为 142323基因的真核表达及进一步研究其
对龙眼成花转变的调控作用奠定了基础。
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