全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (11) : 1597 - 1602
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 07 - 13; 修回日期 : 2009 - 10 - 09
基金项目 : 广东省科技攻关计划项目 (2007A2030000223)3 E2mail: liangxuelian2005@ sina1com
从菠萝薄细胞层切片直接诱导体细胞胚
梁雪莲 13 , 陈晓玲 1 , Kheng Cheah2 , D iane M Sether2 , Q i L i2 , John Hu2
(1仲恺农业工程学院生命科学学院 , 广州 510225; 2 夏威夷大学植保系 , 夏威夷 96822, 美国 )
摘 　要 : 以菠萝 (A nanas com osus L. Merrill) 杂交种 MD1无菌苗为材料 , 通过培养薄细胞层切片
( Thin cell layer, TCL) 的方法 , 研究直接再生胚的固体培养体系。结果证明 , 预培养的设计 2 (在预培养
基 PT上黑暗预培养无菌苗 1周后 , 从预培养苗茎顶端切取 TCL, 在 MS + 2, 42D 2 mg·L - 1或 1 mg·L - 1胚
诱导培养基 E I2上黑暗培养 1周 , 然后转到光照条件下继续诱导胚 1周 , 再在成熟胚培养基 EM上培养 2
周 , 最后转入幼苗培养基 PL上培养 ) 是直接诱导获得体胚的最佳途径 ; 诱导的体胚最初均来自于薄细胞
层上微管束附近的细胞 ; p icloram有利于芽的诱导 , 2, 42D有利于直接再生胚 , 但如果球形胚形成后一直
培养在较高浓度的 2, 42D培养基中 , 将阻碍球形胚和心形胚进一步发育为成熟胚 , 反而促进芽的生成。
关键词 : 菠萝 ; 直接形成胚 ; 薄细胞层
中图分类号 : S 66813　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 1121597206
Establishm en t of D irect Soma tic Em bryogenesis System Through Tran sverse
Th in Cell Layer Culture in P ineapple ( A nanas com osus L. M err ill)
L IANG Xue2lian13 , CHEN Xiao2ling1 , KHENG Cheah2 , D IANE M Sether2 , Q IL i2 , and JOHN Hu2
(1 College of L ife Sciences, Zhongkai U niversity of A gricu lture and Engineering, Guangzhou 510225, China; 2D epartm ent of P lant
and Environm enta l Protection Sciences, U niversity of Haw aii 96822, USA )
Abstract: The direct embryogenesis in vitro using transverse thin cell layer ( TCL ) culture system of
hybrid p ineapp le (MD1) seedling was established. By comparison of 3 p rotocols, the effect of p retreatment on
inducing direct embryo, the functional difference between 2, 42D and p icloram for inducing morphogenesis
and the original cell of directly induced embryo in solid culture system were studied. The results revealed that
p rotocol 2 in which involved p retreatment is the best and all the direct somatic embryos originated from cells
near the vascular bundles on TCL. Relatively, 2, 42D was good for direct embryo inducing, while p icloram
was good for shoot inducing. But, if the globe and heart embryoswere continuously exposed to higher 2, 42D ,
development of them into mature embryos was inhibited and shoot development of them was p romoted.
Key words: A nanas com osus L. Merrill; direct embryo; thin cell layer ( TCL)
为改良菠萝 (A nanas com osus L. Merrill) 种质 , 人们采取了组织培养技术 , 如体细胞突变体筛
选、花粉或子房培养、细胞融合杂交以及转基因技术等 ( Sm ith et al. , 2003) , 其中菠萝转基因显示
出越来越突出的优势 , 但难点在于如何减少或避免转基因嵌合体植株的产生。
薄细胞层切片 ( thin cell layer, TCL) 培养技术一贯用来研究植物发育过程中的形态建成和生理
变化。本研究采用薄细胞层切片培养技术 , 在显微镜下从菠萝苗茎段或叶基部切取 012～014 mm厚
含 3～6层细胞 (Bui et al. , 1997) 的薄片 , 进行培养。这种薄层细胞首先利于单细胞同目的 DNA接
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合 , 提高转基因效率 ; 如果进而诱导这些单细胞直接形成胚 , 最后生成的植株便是阳性纯合植株。但
如果外植体不经过薄层处理 , 便会首先产生愈伤组织 , 在筛选培养过程中不得不经过二次胚性诱导 ,
从转化的细胞团上诱导新的胚生长 , 产生间接形成胚 ( Snyman et al. , 2006)。这不仅增加了嵌合体形
成的可能 , 而且 , 已经转化的细胞经过愈伤阶段时也增加了产生体细胞突变的风险 ( Karp , 1991)。
由于 TCL途径避免了经由愈伤组织这一复杂过程 , 保持了遗传稳定性 ; 直接形成胚 , 还可免去生根
阶段 , 发育速度快 , 所以越来越受到人们的重视。目前 , 利用这种方法已经获得再生植株的有单子叶
的小麦、大麦、橡胶和高粱 (Okole & Schulz, 1996)。
本研究旨在运用 TCL培养法在菠萝上获得直接诱导的体细胞胚 , 从而改善转基因的受体系统 ,
提高菠萝转基因效率。
1　材料与方法
111　植物材料与培养基成分
材料采用美国杂交种菠萝 MD1无菌苗 , 培养在 MS中 , 苗高约 5～10 cm。试验于 2007年 7月到
2008年 2月在美国夏威夷大学人力资源与环境保护系 D r1 John Hu的实验室进行。
无菌苗培养基 ( PM ) 成分 : MS + 1 mL·L - 1维生素 B5 + 014 mg·L - 1肌醇 (pH 517)。
预培养培养基 ( PT) : MS + 2, 42D 2 mg·L - 1 (pH 517)。
胚诱导培养基 ( E I1 ) : 包括 M4和 M5。M4: MS +添加混合物 + 2, 42D 4 mg·L - 1 ( pH 417
或 517) ; M5: MS +添加混合物 + 2, 42D 4 mg·L - 1 + NAA 1 mg·L - 1 + IAA 1 mg·L - 1 ( pH 417
或 517)。
胚诱导培养基 ( E I2) : MS + 2, 42D 2 mg·L - 1 , 1 mg·L - 1 (pH 417)。
胚诱导培养基 ( E I3) : MS + p icloram 2 mg·L - 1 , 3 mg·L - 1或 2, 42D 0 mg·L - 1 , 1 mg·L - 1和
2 mg·L - 1 (pH 417)。
胚成熟培养基 ( EM ) : MS (pH 517)。
幼苗培养基 ( PL) : 1 /2 MS大量 (pH 517)。
以上各培养基再加 30 g·L - 1蔗糖和 2 g·L - 1琼脂。培养均在 28 ℃培养室进行 , 光照强度 35
μmol·m - 2 ·s- 1 , 12 h /12 h光暗周期。
添加混合物成分 : 维生素 B1 (014 mg·L - 1 ) , 维生素 B2 ( 01004 mg·L - 1 ) , 维生素 B6 ( 012
mg·L - 1 ) , 泛酸钙 (0103 mg·L - 1 ) , 烟酸 (012 mg·L - 1 ) , 叶酸 (01006 mg·L - 1 ) , 甘胺酸 (210
mg·L - 1 ) , 抗坏血酸 (20 mg·L - 1 ) , 氨基苯甲酸 ( 0101 mg·L - 1 ) , L - 半胱胺酸 ( 10 mg·L - 1 ) ,
肌醇 (100 mg·L - 1 ) , 硫酸腺嘌呤 (150 mg·L - 1 ) , L -酪胺酸 (100 mg·L - 1 ) , 椰汁 (4 m l·L - 1 )
( Sigma, St. Louis, MO ) 在培养基经过高温灭菌之后添加。
112　试验方法
试验进行 3种设计。
设计 1: 直接从在 PM上培养的无菌苗茎顶端切取 TCL, 在胚诱导培养基 E I1上黑暗培养 17 d,
转入光照继续诱导胚 1周 , 然后在成熟胚培养基 EM上培养 2周 , 最后转入幼苗培养基 PL上培养。
设计 2: 在预培养基 PT上黑暗预培养无菌苗 1周后 , 从预培养苗茎顶端切取 TCL, 在 MS +
2, 42D 2 mg·L - 1或 1 mg·L - 1胚诱导培养基 E I2上黑暗培养 1周 , 然后转到光照条件下继续诱导胚 1
周 , 再在成熟胚培养基 EM上培养 2周 , 最后转入幼苗培养基 PL上培养。
设计 3: 直接从在 PM上培养的无菌苗茎顶端切取 TCL, 在 p icloram 2、3 mg·L - 1或者 2, 42D 0、
1或 2 mg·L - 1的胚诱导培养基 E I3上黑暗培养 17 d, 然后转到光下继续诱导胚 1周 , 再在成熟胚培
养基 EM上培养 2周 , 最后转入幼苗培养基 PL上培养。
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2　结果与分析
211　不同设计直接形成体胚的效果
如表 1所示 , 设计 1在胚诱导阶段添加了大量的营养物质 , 其培养的 TCL细胞致密 , 形成的球
形胚较好 (图 1, A) , 可能是添加混合物使这些细胞营养丰富 , 生长健壮的缘故 ; 其成胚数在不含
NAA和 IAA的情况下也较好 ; pH 417和 517的成胚数分别为 3和 2, 无明显区别 ; 但从成苗数来看 ,
设计 1最后却并没发育为成熟的胚性苗 , 而设计 2和 3均有胚性苗形成 , 也有不定芽形成的无根苗。
表 1　不同设计直接形成胚的效果
Table 1　D irectly em bryo forma tion from d ifferen t plan
设计
Plan
E I培养基
Medium of E I
接种数
Number of
initiation
直接诱导成胚反映
Responses to
induction
成胚数
Number of
embryo
成苗数
Number of
p lantlet
1 M4, pH 417 30 ±1 出胚 D ifferentiated into embryo 3 0
M4, pH 517 30 ±1 出胚和芽 D ifferentiated into embryo and shoot 2 0
M5, pH 417 30 ±1 出芽 D ifferentiated into shoot 0 0
M5, pH 517 30 ±1 出芽 D ifferentiated into shoot 0 0
2 MS + 2, 42D 1 mg·L - 1 , pH 417 30 ±1 出胚 D ifferentiated into embryo 7 4 (胚苗 Seedling)
MS + 2, 42D 2 mg·L - 1 , pH 417 30 ±1 出胚和芽 D ifferentiated into embryo and shoot 4 2 (芽苗 Shoot)
3 MS + p icloram 2 mg·L - 1 , pH 417 30 ±1 出芽 D ifferentiated into shoot 0 0
MS + p icloram 3 mg·L - 1 , pH 417 30 ±1 出芽 D ifferentiated into shoot 0 0
MS + 2, 42D 1 mg·L - 1 , pH 417 30 ±1 出胚 D ifferentiated into embryo 5 3 (胚苗 Seedling)
MS + 2, 42D 2 mg·L - 1 , pH 417 30 ±1 出胚 D ifferentiated into embryo 3 2 (芽苗 Shoot)
　　
设计 2在程序中增加了预培养一步 , 即在切取 TCL前对无激素的无菌苗材料在 2, 42D 2 mg·L - 1
培养基上预培养 1周。结果表明其最后获得的成胚数最高达到 7, 胚性苗也最多 (胚性苗数为 4)。这
可能是由于在体细胞胚诱导中 , 原材料的外植体组织各不相同。某些外植体组织中包含了特殊能力的
细胞 , 这种特殊能力可以使他们对一定的诱导处理作出反应 , 最后成为胚。预培养可以使外植体获得
这种竞争能力 , 并决定以后条件适合将继续发育为体细胞胚 (Jaime & Teixeira, 2003)。可见预培养
对于诱导 TCL获得这种竞争能力是很重要的。
设计 3比较了 2, 42D和 p icloram的作用 , 结果证明 , 2, 42D 1 mg·L - 1和 2 mg·L - 1均可诱导直
接形成胚 , 成胚数分别为 5和 3, 其中 2, 42D 1 mg·L - 1的处理最后发育为胚性苗 , 胚苗数为 3;
2 mg·L - 1的处理最后发育为芽苗 , 芽苗数为 2。而 p icloram的处理只诱导出芽 , 最后也没有生成苗。
212　不同生长素对形态建成的影响
从本试验设计 1可以看出 , M4培养基可以诱导出胚 , 而 M5未诱导出胚 , 说明 2, 42D单激素可
以诱导胚 , 但如果再加入 IAA和 NAA反而不利于胚的诱导。从设计 2的结果又可以看出 , 由于预培
养时已经使用了 2, 42D, 则在胚诱导 ( E I) 阶段需降低其浓度才可以生成胚苗 (如图 1中 D、E) ,
而继续使用较高浓度 2, 42D反而促进芽苗的生成。如表 1设计 2在 MS + 2, 42D 2 mg·L - 1中原本已
经形成胚 , 但最后只获得芽苗 ; 设计 3在 MS + 2, 42D 2 mg·L - 1中也原本生成胚 , 但最后也只获得
芽苗。从设计 3还看出 , p icloram诱导产生不定芽 (图 1, I) , 而 2, 42D无论 1 mg·L - 1和 2 mg·
L - 1均可诱导出胚。
综上所述 , 可以得出 : (1) 从茎尖 TCL诱导胚时 , 必需的生长素是 2, 42D, 不是 p icloram, IAA
或 NAA; (2) 2, 42D浓度 1、2或 4 mg·L - 1均可诱导出胚 , 但 4 mg·L - 1诱导的胚最后全部褐化死
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亡。 (3) 无论预培养与否均可诱导出胚 , 但设计 2预培养的效果最好 , 不过 2, 42D 2 mg·L - 1预培
养后需降低其浓度到 1 mg·L - 1 , 才可发育为成熟的胚苗 (图 1, E)。
图 1　不同生长素对形态建成的影响
A为设计 1薄细胞层切片诱导 11 d的球形胚 ; B～E分别是设计 2在 2, 42D中预培养的材料 (B) , 从该材料
切取 TCL诱导 10 d形成的球形胚 (C) , 诱导 16 d的心形胚 (D) 以及 45 d后形成的带根胚苗 ( E) ;
F、G为设计 3薄细胞层切片在 2, 42D 1 mg·L - 1和 2 mg·L - 1中诱导 9 d形成的球形胚 ;
H为设计 3中经 2, 42D 1 mg·L - 1诱导 44 d后形成的芽苗 ;
I、J为设计 3在 p iclora 3 mg·L - 1上诱导 9 d形成的
不定芽及其在 E I上形成的无根苗。
F ig. 1　Effects of d ifferen t aux in on m orphogenesis
A. Globular embryo from Plan 1 after 11 d induction; B - E. Pretreated materials in 2, 42D 2 of p lan 2 (B) ,
embryos after 10 d induction from p lan 2 (C) , embryo after 16 d induction from p lan 2 (D) ,
p lantlet with 1 root in EM medium from embryo of p lan 2 ( E) ; F, G. Globular
embryo from p lan 3 after 9 d 2, 42D 1 mg·L - 1 and 2, 42D 2 mg·L - 1
induction; H. Plantlet without root in EM medium from p lan 3
after 2, 42D 1 mg·L - 1 induction; I, J. Adventitious bud
and p lantlet from p lan 3 after p iclora
3 mg·L - 1 induction.
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213　TCL上形态建成的部位与时间
由图 1中 A、C、D、F、G可以看出 , 直接诱导的芽和胚最初发自维管束附近的细胞 , 而且越靠
中心维管束部位 , 越可能发育为胚 (图 1, C) , 反之则形成不定芽的可能性较大。与梨叶的相关试验
相似 , 即首次的细胞分化出现在微管组织附近 , 形成原始细胞 , 最后成为生长点区域 ( Steinmacher et
al. , 2007)。
统计以上 3种设计试验结果中体胚形态建成出现的时间 , 认为直接形成胚的时间主要在 TCL培
养后 9～16 d, 在 TCL培养 45 d内可以发育为成熟的幼苗 , 因此 TCL培养是一种快速的植株再生体
系。本试验结果显示 , 采用 TCL系能够避免愈伤形成阶段 , 得到直接诱导的体细胞胚。但 TCL越厚 ,
越有愈伤形成。最佳的厚度为 013 mm, 约含 6层细胞。
3　讨论
311　从 TCL可直接诱导形成体细胞胚
大多数体细胞胚来自于单细胞 , 所以由这些体细胞胚发育来的植株基因型是相对较稳定的。体细
胞经过体细胞胚发育成一种相似于合子胚的特殊结构 (即具有双极性 , 并且与母细胞之间没有微管
联系 ) , 这是有序的系列过程 , 但并不经过配子体的融合 (V ictor, 2005)。本试验中 , 有的胚在球形
期 , 有的在双极性期 , 均清晰地展示出这种双极性和无微管联系的特性 , 即生理独立性。因此 , 很明
显可以从 TCL上得到直接诱导的体细胞胚。即在菠萝上采用 TCL培养法 , 可以不经过愈伤阶段 , 在
外植体培养后 2～3周内获得直接诱导的胚 , 4～6周内获得再生植株。这种再生体系既快速又极大地
避免了嵌合体形成 , 提高了基因转化效率。比较文中 3种设计 , 得到从 TCL直接形成胚的最优途径
为 : 无激素培养的无菌苗在 MS 2, 42D 2 ( PT) 黑暗预培养 1周后 , 切取 TCL (013 mm ) 在 MS 2,
42D 1 ( E I) 培养基上黑暗诱导胚 1周 , 再在胚成熟培养基 ( EM ) 光照培养 1～2周 , 最后在 1 /2 MS
( PL) 上培养成苗。
312　体胚形成的不同阶段对生长素水平的要求不同
本试验已证明 , 2, 42D 1、2和 4 mg·L - 1促进了早期体细胞胚的发育 , p icloram 2、3 mg·L - 1则
利于从 TCL上形成芽。这个结论与 Sripaoraya等 (2003) 培养叶基部的结果相反 , 他们将叶基部培养
在含有 015 mg·L - 1 2, 42D和 210 mg·L - 1 BA的 MS中 , 认为光下有利于芽的形成 ; 当用 310 mg·
L - 1 p icloram在黑暗中培养则有利于胚的形成。可见 , 不同的品种或组织材料 , 其本身所含有的激素
水平不同 , 诱导体胚时对生长素的要求也就不同。但是 , 本试验中 , 这些已经形成的球形胚 (图 1,
A、C、F、G) 和心形胚 (图 1, D ) 并没有全部发育为成熟的具有芽和根的胚性苗 , 尤其是设计 1,
最后全部褐化死亡 , 只从设计 2得到从胚发育来的苗 , 从设计 3得到的苗或者无根 (图 1, J ) 或者
有根却像不定根 (图 1, H)。前人曾经对 2, 42D功能特性进行研究 , 认为相对较高的含量有利于胚
性细胞的诱导 , 较低的 2, 42D 有利于胚的形成 , 而完全脱去激素则最利于胚的发育成熟 (Val
Raghavan, 2004)。因此 , 本试验设计 1很可能是由于最后未降低或去掉 2, 42D而导致这些体细胞胚
的夭折。另一方面 , 在设计 2和 3中 , 也可能是由于继续采用了较高浓度的 2, 42D, 导致已形成的
球形胚最终转化发育成芽苗。因为尽管对于多数植物种 , 生长素是利于膨大的主要因素 , 但同时它也
抑制了胚前体发育为成熟胚 , 这可能是由于它抑制了电子细胞的极性化 (Von A rnold et al. , 2002;
Feher et al. , 2003) 或者是由于生长素成分的不匹配所致。这点需进一步的试验证明。
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