全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（7）：1147–1154
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2010–03–05；修回日期：2010–05–17
基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项(200903044)；国家‘863’计划（2006AA00108-2-3-4A）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wujun@njau.edu.cn；Tel：025-84396580）
与梨黑星病抗性基因连锁的 AFLP 标记筛选及
SCAR标记转化
张树军 1，张绍铃 1，吴 俊 1,*，王迎涛 2，李 勇 2，李 晓 2
（1南京农业大学梨工程技术研究中心，南京 210095；2河北省农林科学院石家庄果树研究所，石家庄 050061）
摘 要：以‘鸭梨’（Pyrus bretschneideri）ב雪青’梨（P. bretschneideri × P. pyrifolia）F1代群体（97
株）为试材，采用扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技术和集群分
类法（bulked segregant analysis，BSA）筛选与梨抗黑星病基因连锁的分子标记。通过 64对 AFLP标记引
物在亲本和分离群体中的筛选和验证，获得与梨抗黑星病基因紧密连锁标记两个，即 ACA/CAA-179 和
AAC/CAG-198。它们与抗黑星病基因的遗传距离分别为 5.2和 8.3 cM。对 AFLP标记片段的克隆和测序结
果显示其长度分别为 179 和 198 bp。根据序列信息设计特异引物，在杂交后代群体上的 PCR 分析表明
AFLPACA/CAA-179标记被成功转换成 SCAR 标记，命名为 SCAR-117。本研究结果将有助于对抗黑星病梨品
种资源的分子鉴定及杂种后代的早期辅助选择。
关键词：梨；抗黑星病；AFLP；SCAR
中图分类号：S 661.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）07-1147-08

Identification of AFLP-derived SCAR Markers Linked to the Pear Scab
Resistance Gene
ZHANG Shu-jun1，ZHANG Shao-ling1，WU Jun1,*，WANG Ying-tao2，LI Yong2，and LI Xiao2
（1Center of Engineering and Technology Research，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2Shijiazhuang
Pomology Institute，Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Shijiazhuang 050061，China）
Abstract：Pear scab is one of the most harmful diseases in pear production. Using 97 F1 progenies
produced by the cross‘Yali’（susceptible）בXueqing’（resistant），markers linked to pear scab resistance
gene were screened by amplified fragment length polymorphism（AFLP） technique combined with bulked
segregant analysis（BSA）method. Two molecular markers which linked to pear scab resistant gene had
been identified from 64 pairs of AFLP primer，named as ACA/CAA-179 and AAC/CAG-198. The genetic
distance to pear scab resistant gene were 5.2 cM and 8.3 cM，respectively. Sequencing results indicated
that the length of the two specific fragment amplified were 179 bp and 198 bp，respectively. The specific
primers were further designed based on the sequence information，and then were utilized to analyze the F1
population by PCR. Results showed that AFLPACA/CAA-179 had been successfully converted into SCAR
marker，and named as SCAR-117. This result will be helpful for molecular identification of germplasm and
early selection of progenies which are resistant to pear scab.

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Key words：pear；scab resistance；AFLP；SCAR

梨黑星病是梨树栽培中的主要病害之一，在我国主要梨产区均有发生，给生产造成很大损失。
梨黑星病常规的防治方法为化学药剂防治，但随着其病菌抗药性菌株的出现，化学防治效果逐渐减
弱，这为该病害的防治带来了新的难题。从长远发展来看，选育和栽植抗黑星病的优良品种将是控
制梨黑星病发生和实现无公害生产的最有效措施。
由于果树的基因组学研究较为滞后，直接获得控制梨黑星病的基因目前难以实现。国际上曾有
学者开展了有关梨黑星病抗性的分子图谱定位研究。例如，Pierantoni 等（2007）用 AFLP 标记构
建了西洋梨的遗传连锁图谱，并检测出与梨黑星病（Venturia pyrina）抗性相关的两个主效 QTL位
点。Terakami等（2006）利用 SSR、AFLP和 RAPD等标记技术将日本梨品种‘Kinchaku’中所含
的抗黑星病 Vnk基因定位在梨遗传图谱中 LG1的中间区域，并鉴定出多个与黑星病抗性基因紧密连
锁的分子标记。此外，Terakami等（2006）指出，分属不同种的梨的黑星病的抗性遗传位点可能不
同。在我国，对梨黑星病的研究主要集中在品种及其杂交后代的遗传行为及表型方面。蒲富慎（1979）
以日本梨为试材研究后认为梨黑星病抗性可能受显性单基因控制；汤浩茹和冷怀琼（1993）通过分
析‘鸭梨’、‘早酥’等 8个品种 15 个杂交组合的 F1群体，认为梨对黑星病的抗性为质量性状，抗
病性对感病性为显性。到目前为止，还未见利用国内梨品种资源开展抗黑星病基因连锁标记的报道。
许多学者通过接种试验和田间自然发病调查发现，隶属白梨系统的‘鸭梨’是最易感病品种（沈言
章 等，1993；汤浩茹和冷怀琼，1993），汤浩茹等（1998）利用生物间遗传学的原理和方法对梨黑
星病菌和梨品种相互作用进行分析，发现‘鸭梨’不含抗黑星病基因。因此，本研究中以‘鸭梨’
ב雪青’及其 97株 F1植株为试材，利用 AFLP技术和集群分类法（bulked segregant analysis，BSA），
筛选与梨抗黑星病基因连锁的 AFLP 标记，并将其转换为 SCAR（sequence characterized amplified
region）标记，为梨抗黑星病品种的分子辅助选择育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 亲本及 F1分离群体抗/感黑星病的鉴定
试验于2007—2008年在河北省农林科学院石家庄果树研究所进行。
供试材料为‘鸭梨’（感病）ב雪青’（抗病）的杂交后代97株。当亲本及F1的叶龄在25 d 左
右时，接种梨黑星病菌（Venturia nashicola）进行抗性鉴定。
接种病菌体来自当年‘鸭梨’黑星病菌分生孢子体，浓度为10 × 显微镜下每视野150 ~ 200个分
生孢子。用涂抹法将黑星病菌分生孢子均匀涂抹于叶背面，每株接种30个叶片，并利用塑料膜覆盖
保湿72 h，90 d后调查记载黑星病发病情况。染病叶表型为有坏死斑且有少量孢子形成，记为抗病
植株；染病叶表型为病斑蔓延全叶且有黑霉产生，记为感病植株。
1.2 基因组 DNA提取和近等基因池的构建
2007年春季采集供试植株的幼嫩叶片，液氮处理后保存于–70 ℃冰箱备用。
利用本实验室改良的CTAB法（张妤艳 等，2006）提取亲本及后代个体的基因组DNA，经RNAase
消化后用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA的纯度和完整性，存于–20 ℃冰箱备用。
根据BSA法（Michelmore et al.，1991）的基本原理，取杂交后代表现为抗病与感病的个体各7
7期 张树军等：与梨黑星病抗性基因连锁的AFLP标记筛选及 SCAR标记转化 1149

株，将其DNA分别等量混合，构建抗/感黑星病性状基因池。
1.3 AFLP分析
参照Vos等（1995）的方法，基因组DNA采用 Mse I 和 EcoR I 两种内切酶进行酶切；预扩增引
物采用不含选择性碱基的M00和E00。AFLP引物由上海英骏生物工程公司合成，所用Taq DNA聚合酶
购自TaKaRa公司。选择性PCR扩增结束后，通过6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，利用银染法
进行检测。
同时对抗病、感病亲本和抗病、感病基因池进行AFLP扩增，筛选在两亲本及两基因池间产生相
应多态性的引物组合，并获得与抗/感黑星病相连锁的候选标记。然后将产生多态性的引物在F1群体
中进行单株验证，从而进一步确认所筛选到的标记与目标性状的连锁关系。统计群体的共分离分析
结果，计算标记与控制目标性状基因间的重组率，并根据 Kosambi 函数（Kosambi，1944）估算遗
传连锁距离。
从聚丙烯酰胺凝胶上回收确定为连锁标记的多态性片段，置于盛有20 µL ddH2O的离心管中，
100 ℃煮沸15 min，离心，取上清液作为DNA模板，用与之相对应的AFLP选择性引物进行PCR扩增，
反应程序和体系与选择性扩增相一致。
重扩增的PCR产物用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）
回收，方法参照厂商说明书。
将纯化的目的条带转入pMD19-T载体（宝生物工程有限公司）进行克隆，方法参照厂商说明书。
以10个与特异条带大小一致的阳性克隆为模板，用与之相对应的引物进行PCR扩增，反应程序和体
系与选择性扩增相一致。
6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步检测相应的PCR产物，与特异条带大小一致的阳性克隆，提
取质粒后由上海英骏生物工程公司进行测序。
1.4 SCAR引物设计与 PCR扩增
根据获得的特异片段DNA序列设计特异性引物，以亲本的基因组DNA为模板，进行程序和体系
的优化分析，确定了SCAR-117特异引物的最佳体系和程序。25 µL体系含模板DNA 25 ng，Mg2+ 2.5
mmol · L-1，dNTP 0.25 mmol · L-1，Taq DNA聚合酶1.0 U，引物 0.6 µmol · L-1；反应程序为 94 ℃预
变性 5 min，前10个循环在 94 ℃ 1 min，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，后25个循环退火温度为 63 ℃，
最后72 ℃延伸10 min。
以亲本及杂交后代基因组DNA为模板，进行SCAR标记的PCR扩增，以检测其可靠性和特异性。
2 结果与分析
2.1 梨黑星病抗性的后代分离规律
2007 年和 2008 年对‘鸭梨’、‘雪青’及其 97 株 F1 群体后代单株进行人工接种黑星病病菌鉴
定。结果表明，‘鸭梨’高度感病，而‘雪青’表现出很强的抗性，后代单株中抗病个体 44株，感
病个体 53 株。
根据卡方检验（χ2 = 0.835）符合1︰1的分离比例，表明该杂交群体中抗（感）黑星病性状符合
单基因遗传规律，即存在主基因控制梨黑星病的抗（感）表型。
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2.2 梨抗黑星病基因的 AFLP标记分析
采用 64 对 AFLP 选择性引物组合对两亲本及抗/感黑星病近等基因池进行扩增，其中 10 对引
物表现出多态性扩增。利用这些多态性引物组合对 F1 后代植株进一步筛选验证，结果表明，两对
引物组合（即E-ACA/M-CAA和E-AAC/M-CAG）所获得的多态性片段与梨抗（感）黑星病性状相连锁。
其中AFLP引物组合E-ACA/M-CAA获得的多态性片段大小约为180 bp，在抗病基因池及抗病亲本
‘雪青’中均有该特异带，而感病基因池及感病亲本‘鸭梨’中无此条带。单株检测结果显示：44
株抗病个体中有41株扩增出特异片段，3株没有扩增出特异片段，为交换型；53株感病个体有51株无
特异片段，2株扩增出特异片段，为交换型（图1）。
根据以上鉴定结果，判断来自引物组合E-ACA/M-CAA的多态性标记与抗黑星病性状连锁，群体验
证的重组率为5.2%。
利用Kosambi函数计算出该标记与抗黑星病基因的遗传距离为5.2 cM。

图 1 AFLP 引物 E-ACA/M-CAA在两亲本、近等基因池及部分 F1单株中的电泳图谱
X：‘雪青’(抗病亲本)；Y：‘鸭梨’（感病亲本）；R：抗病池；S：感病池；1 ~ 15：抗病植株；
16 ~ 30：感病植株；其中 5为重组株；箭头所指为特异性片段。
Fig. 1 Electrophoresis patterns amplified by AFLP primer E-ACA/M-CAA in parents，
two DNA bulks and partial F1 individuals
X：‘Xueqing’（Resistant parent）；Y：‘Yali’（Susceptible parent）；R：Resistant bulk；
S：Susceptible bulk；1–15：Resistant plants；16–30：Susceptible plants；
5：Recombination plant；The specific fragment was indicated by the arrow.

另一AFLP引物组合E-AAC/M-CAG扩增的特异性片段大小约为200 bp，在感病性状基因池及亲本有
特异带，而抗病基因池及亲本中无此条带；对F1后代单株验证结果显示，44株抗病个体有5株发生了
交换，53株感病个体有3株发生了交换（图2），即标记与抗黑星病性状的重组率为8.2%。
利用 Kosambi 函数计算该标记与抗黑星病基因的遗传距离为8.3 cM。
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图 2 AFLP 引物 E-AAC/M-CAG在两亲本、近等基因池及部分 F1单株中的电泳图谱
X：‘雪青’（抗病亲本）；Y：‘鸭梨’（感病亲本）；R：抗病池；S：感病池；1 ~ 11：感病植株；
12 ~ 27：抗病植株；其中 3、23、为重组株；箭头所指为特异性片段。
Fig. 2 Electrophoresis patterns amplified by AFLP primer E-AAC/M-CAG in parents，two DNA bulks and partial F1 individuals
X：‘Xueqing’（Resistant parent）；Y：‘Yali’（Susceptible parent）；R：Resistant bulk；S：Susceptible bulk；1–11：Susceptible
plants；12–27：Resistant plants；3，23：Recombination plants；The specific fragment was indicated by the arrow.

2.3 AFLP标记特异片段的回收及序列测定
将AFLP引物E-ACA/M-CAA、E-AAC/M-CAG扩增所得的特异片段回收、克隆和转化，挑取10个阳性
克隆的质粒PCR产物，经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，选取3个与特异条带大小一致的阳
性克隆，送样测序，取其共同DNA序列。
E-ACA/M-CAA引物组合扩增的特异性片段测序结果为：5′-GACTGCGTACCAATTCACACCATC
AAACTATCTATTAGACCTTGTGCTACAACGAAGAGGAAGATAAGAGGGCCTAAACGTTCATACA
ATTCAAGTGAGTTGTTGGAATGTTTAGGTACCTTCCAACACAATGATAAGGATTTGGTTTGTAAT
TGCATGATTGTTACTCAGGACTCATC-3′。
E-AAC/M-CAG引物组合扩增的特异性片段测序结果为：5′-GACTGCGTACCAATTCAACGCGTG
TAGAATAGGTATCAGATTTCTTCGGACTGAACTAAGCAACATCGATCTTGTTTTTCTTTTGGAAT
TTGAAGTCAACAAACTAACAGTGATTTGGGTTATGAAATTTGTTTAGGATTGATAGACCTAATTC
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TCAGTCGAGTGTCCTTGTTTTTCTTCTGTTACTCAGGACTCATC-3′。
对特异片段测序结果分析，在5′端和3′端分别有AFLP引物E-ACA/M-CAA和E-AAC/M-CAG的结合位点
（黑体部分），进一步证实了特异性片段的正确性，该片段大小分别为179 bp和198 bp，与AFLP标记
扩增的特异片段大小相吻合。
2.4 SCAR引物的设计和 PCR扩增
根据AFLP标记的DNA序列信息，利用Premier 5.0软件设计SCAR的特异引物：E-ACA/M-CAA和
E-AAC/M-CAG的上游引物序列分别为：5′-GTGCTACAACGAAGAGGAAGATAAG-3′，5′-GAATAGGTA
TCAGATTTCTTCGGAC-3′（序列中下划线部分）；E-ACA/M-CAA和E-AAC/ M-CAG的下游引物序列分别为：
5′-TCATGCAATTACAAACCAAATCCTT-3′，5′-GGACACTCGACTGAGAATTAGGT-3′（序列中下划
线部分）。以两亲本、抗/感基因池的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。结果显示，根据AFLP引物
E-ACA/M-CAA扩增的标记片段设计的特异引物，在‘雪青’及抗黑星病近等基因池中均能扩增出与抗
黑星病基因连锁的特异条带，特异PCR扩增产物的大小为117 bp，与预期大小相一致；在‘鸭梨’
及感病基因池中无特异片段扩增。对F1群体的进一步分析验证，抗病植株中有特异片段的扩增，感
病植株无扩增，交换型的数量与AFLP标记相符合。以上分析表明，该AFLP标记已成功转化为SCAR
标记（图3），即SCAR-117标记与抗黑心病基因连锁距离为5.2 cM。而来自AFLP引物 E-AAC/M-CAG的
标记则在转化过程中丢失了其特异性。
图 3 SCAR引物对两亲本及部分 F1单株的扩增结果
M：DNA ladder；X：‘雪青’（抗病亲本）；Y：‘鸭梨’（感病亲本）；1 ~ 7：抗病植株；8 ~ 14：感病植株。
Fig. 3 SCAR amplification of parents and some of F1 plants
M：DNA ladder；X：‘Xueqing’（Resistant parent）；Y：‘Yali’（Susceptible parent）；
1–7：Resistant plants；8–14：Susceptible plants.
3 讨论
目前对梨黑星病抗性遗传的研究结果差异较大。Brown（1960）和蒲富慎（1979）等认为，梨
对黑星病的抗性由一对主效显性基因控制，而Crane和Lewis（1949），Abe和Kotobuki（1998）认为
梨对黑星病的抗性受多基因支配。Stanton（1953）观察到梨品种间杂交后代对黑星病的抗感分离比
例有多种情况，但未推测出抗性基因的数量。汤浩茹和冷怀琼（1993）认为梨对黑星病的抗性表现
为质量性状遗传，多数组合的抗感分离比例支持有 4 对基因控制梨黑星病的抗性。之后，利用生物
间遗传学的方法推导梨对黑星病的抗性由 1 ~ 6个基因控制（汤浩茹 等，1998）。Terakami等（2006）
在对日本梨黑星病的抗性鉴定试验中，发现杂交后代的抗病程度分为高抗（没有可见病症）和易感
（有病斑且附有大量孢子）两种表现类型，没有出现中间类型，并认为梨黑星病的抗性由单显性基
因控制。在中国梨的品种资源中，‘鸭梨’为公认的感病品种，汤浩茹和冷怀琼（1993）的试验结果
显示，‘鸭梨’的基因型是隐性纯合的。沈德绪等（2002）报道‘雪青’系‘雪花’ב新世纪’梨
种间杂交育成的优质早熟梨，表现为抗黑星病。在本试验抗性鉴定中，统计‘鸭梨’（感病）ב雪
7期 张树军等：与梨黑星病抗性基因连锁的AFLP标记筛选及 SCAR标记转化 1153

青’（抗病）的F1抗性鉴定表现中抗病/感病的表型符合1︰1的分离比例（χ2 = 0.835），符合单基因遗
传规律，即由主基因控制梨黑星病的抗（感）性状。虽该研究中抗病亲本‘雪青’具有日本梨血统，
但本试验中所得到的与梨抗黑星病连锁的两个AFLP标记与日本学者Terakami等（2006）在日本梨中
发现的Vnk抗黑星病基因有无关系，还有待进一步研究。
AFLP技术操作步骤繁琐，需要较高的试验技能，且成本较高，很难直接应用于图位克隆和分子
辅助选择，如将AFLP标记转化成SCAR标记，可有效解决上述问题。不过AFLP标记存在转化效率低
的问题，许多标记在向SCAR标记转化时会丢失其特异性或扩增基因组DNA失败，其原因目前尚不
清楚，这种现象在结球芥菜 （Negi et al.，2000）、苹果（Evans & James，2003）和油菜（Hong et al.，
2006）的研究中也有出现。本试验中AFLP E-AAC/M-CAG标记在转化过程中丢失了其特异性，分析原因
可能是AFLP标记特异性引物产生于标记的序列末端，AFLP引物的选择性碱基决定AFLP条带的染色
体特异性，根据内部序列设计特异性引物时，这种特异性很可能消失。Shan等（1999）在对大麦与
小麦的AFLP多态性片段转化过程中也有类似情况发生。为保证SCAR标记的特异性和可靠性，作者
在将AFLP标记转化成SCAR标记时，首先对10个阳性克隆的质粒PCR产物进行6%变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳检测，选取与特异带型相一致的阳性克隆，送其测序，可以有效解决在回收过程可能出现的
污染情况；其次在检测SCAR标记时，先以预扩增产物和选择性扩增产物作为模板，可以将基因组
背景的影响减少到最小；最后对抗（感）病亲本和后代的基因组DNA进行扩增检测。
SCAR标记是一种十分稳定的分子标记，具有迅速、简便、低成本的特点，在苹果（王彩虹 等，
2002）、梨（贾彦利 等，2007）、桃（姜立杰 等，2005；吴俊 等，2009）、无花果（王亮 等，2009）
和葡萄（杨英军 等，2002）等果树的农艺性状筛选和资源研究上得到了开发和利用。本研究中利用
AFLP技术获得了与梨抗黑星相关基因紧密连锁的分子标记，并成功转化为SCAR标记，该标记在苗
期对梨杂种后代植株黑星病抗性的分子辅助选择中具有一定的应用价值。
为了提高分子标记辅助育种的效率和准确性，一般要求分子标记与目标基因的连锁距离在5 cM
以内，因此，寻找与梨黑星病抗性基因连锁更为紧密的分子标记将成为后续工作的重点。
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