全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (1) : 15 - 20
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 06 - 05; 修回日期 : 2008 - 11 - 17
基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( 30360066 ) ; 国家 科 技 攻 关 计 划 引 导 项 目 ( 2003BA546C ) ; 兵 团 科 委 项 目
(NKB02SDXNK01SW )3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: njx105@1631com)
梨叶片中苹果褪绿叶斑病毒的引物原位标记检测
赵　英 , 牛建新 3
(石河子大学农学院 , 新疆石河子 832003)
摘 　要 : 选用带苹果褪绿叶斑病毒的香梨叶片 , 制备成适合进行原位 RT2PCR的石蜡切片。设计特异
引物 , 利用引物原位标记 ( Primed in situ labeling, PR INS) 技术对切片组织中的病毒进行了检测研究 , 结
果表明 , PR INS2F ITC染色法和 PR INS2Rhodam ine染色法均能获得良好的检测效果 , 有病毒部位分别显示绿
色荧光和红色荧光 , 而且荧光出现的位置与原位 RT2PCR检测的结果一致。由此证明引物原位标记技术可
用于果树病毒的原位检测。
关键词 : 梨 ; 引物原位标记 ; 苹果褪绿叶斑病毒 ; 病毒检测方法 ; 染色
中图分类号 : S 66112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0120015206
D etection of A pple ch loro tic leaf spot virus in Pear by Pr im ed in s itu Labeling
ZHAO Ying and N IU J ian2xin3
(A gricu ltura l College, Shihezi U niversity, Shihezi, X in jiang 832003, China)
Abstract: The slices of pear leaf samp les infected by A pple ch lorotic leaf spot virus were p repared for in
situ RT2PCR and were detected by p rimed in situ labeling technique using special p rimer. It was showed that
both staining methods of PR INS2F ITC and PR INS2Rhodam ine can get good detection results in which the parts
have viruses showed green and red fluorescence light, respectively, and the sites of showing fluorescence
showed the same sites as the sites detected by RT2PCR method. Therefore, p rimed in situ labeling technique
can be perfectly used for virus in situ detection of fruit trees, and it is also a rap id, simp le and reliable in situ
detection method.
Key words: pear; p rimed in situ labeling; A pple ch lorotic leaf spot virus; virus detection method;
staining
苹果褪绿叶斑病毒 (A pple ch lorotic leaf spot virus, ACLSV ) 为纤毛病毒属 ( Trichovirus) 的代表成
员 (洪健和周雪平 , 2005) , 是危害梨的一种主要病毒病原。该病毒可削弱树势 , 导致果实产量和品
质下降 , 引起果树衰退 , 提早枯死而绝收。
近年来 , 引物原位标记 ( Primed in situ labeling, PR INS) 技术发展较快 , 它将 PCR的特异性与
特异 DNA序列的细胞学定位有效结合 , 已在人类医学等领域得到应用 ( Tharapel & Kadandale, 2002;
Pellestor, 2006) , 但在植物病毒检测方面尚未报道。
本试验中成功应用引物原位标记技术对梨树病毒进行检测 , 研究病毒在组织中的分布 , 对研究复
合侵染中病毒之间的相互作用具有参考意义。
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园 　　艺 　　学 　　报 36卷
1　材料与方法
111　试验材料
选用新疆库尔勒沙依东园艺场内 4株经 RT2PCR和 cDNA探针杂交检测确认带有苹果褪绿叶斑病
毒 (ACLSV) 的香梨植株叶片和 1株无病毒的健康植株叶片为材料 , 采样时间为 2007年 4月下旬。
112　引物
根据 GenBank上登录号为 D14996的序列设计引物 , 该序列经 BLAST与该病毒的全基因组序列比
对后验证标记序列的有效性和特异性 ( German et al. , 1990; Sato et al. , 1993; German et al. ,
1997)。引物由上海生工生物工程技术服务有限责任公司合成。
表 1　引物序列及相关条件
Table 1　Sequences and cond ition for pr im ers
引物
Primer
引物序列
Primer sequence
(5′- 3′)
退火温度 /℃
Annealing
temperature
wkdbP1f(1222) CCCGCTGTTGGATTTGATACAC 6017
wkdbP1 r(4224) CAAGACCGCGACCAAGTTTGC 6119
wkdbP2f (26247) CGGTTCATTTTAATTTGACAAC 5216
wkdbP2 r (41261) CCTAACCCTCCAGTTCGAGGT 6119
wkdbP3f(1212142) TGGAGAATCGACTTGTCAAACG 5811
wkdbP3 r(36257) CGACTCCTAACCCTCCAGTTCG 6111
wkdbP4f(1342154) TGTCAAACGTTGTACCTGAGC 5811
wkdbP4 r(51270) CAGTTCGAGGTTACTCTCCG 5918
wkdbP5f(1292149) CGACTTGTCAAACGTTGTACC 5811
wkdbP5 r(942115) TGTCCTTCAGTACGAAAAAGCC 5811
113　试剂及主要仪器
Taq DNA聚合酶、dNTPs、SuperScriptⅡ RNase H2Reverse Transcrip tase为 Invitrogen公司产品。鲑
精 DNA、聚蔗糖、牛血清白蛋白、去离子甲酰胺购于华美生物工程公司 ; DNase I、多聚赖氨酸为上
海普飞产品 ; 蛋白酶 K为 Merck公司产品 ; 地高辛 - 11 - dUTP购于 ROCHE公司。其余试剂均为国
产分析纯。
试验所用主要仪器有 : LongGene MG96 +基因扩增仪 ( Peltier Thermal Cycler MG48G, LongGene
Scientific Instruments, China) , 原位杂交加热平板模块 , O lympus BX51荧光显微系统 (O lympus Corpo2
ration, Japan)。
114　反转录反应
玻片的清洗和处理参考牛建新等 ( 2007) 的方法。石蜡切片的制备和组织预处理参考刘宏等
(2006) 和牛建新等 (2007) 的方法。
在 012 mL Eppendorf管中加入总体积 20μL的 SuperS criptⅡ RT预混液 : DEPC H2 O 5μL、5 ×
Frist2Strand Buffer (MgCl2 15 mmol·L - 1 ) 4μL、dNTPs (10 mmol·L - 1 each) 2μL、RNasin (40 U·
μL - 1 ) 1μL、Antisense Primer (20μmol·L - 1 ) 5μL (为 wkdbp1 r2p5 r之和 )、DDT (011 mol·L - 1 )
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2μL、SuperScript ⅡRT (200 U·μL - 1 ) 1μL。
将该混合液加于切片上 , 将切片放于湿盒中密封 , 42 ℃温育 1 h。
用双蒸水冲洗切片两次共 10 m in, 用 100%酒精脱水 5 m in, 室温干燥。然后浸入 72 ℃的 70%
去离子甲酰胺 /2 ×SSC溶液变性 7 m in, 快速转入 70%、85%、100%冰乙醇梯度溶液中脱水并风
干。
靶标序列的标记体系为 25μL, 内含所需特异引物 (20μmol·L - 1 ) 10μL, 011%BSA 215μL,
012 mmol·L - 1 dNTP 215μL, 0102 mmol·L - 1 dTTP 215μL, 0102 mmol·L - 1 D ig2112dUTP 3μL, 215
U TaqDNA聚合酶 1μL及 Taq缓冲液 215μL, ddH2 O 1μL。
115　退火与延伸
反应混合物于 72 ℃水浴中预热 , 变性后的样本玻片和盖玻片置于 PCR仪原位反应模块上预热至
退火温度 , 并滴加反应混合物 (72 ℃预热 ) , 立即覆盖 22 mm ×22 mm的盖玻片并封片。
先在退火温度下预热载玻片 7 m in, 然后每张玻片加 25μL预热的反应混合液 , 并盖上塑料盖玻
片 , 再用退火温度继续孵育 9 m in, 72 ℃延伸 30 m in。
反应结束后去掉盖玻片并将玻片迅速浸泡在 73 ℃NE溶液 (500 mmol·L - 1 NaCl, 50 mmol·L - 1
EDTA , pH 810) 中 5 m in, 然后将玻片移到 50 ℃ 4 ×SSC /012% Tween20溶液中 5 m in。5个循环 , 每
个循环结束后均放入 1 ×PBS溶液洗 2～3 m in。
116　荧光标记与复染
靶标所结合的 dUTP - 半抗原由荧光抗体进行间接标记 , 用 10μg·mL - 1 avidin2Rhodam ine和
F ITC (异硫氰酸荧光素 ) 进行荧光检测。
在玻片干燥之前避光滴加检测抗体 40μL (免疫荧光抗体 ) 到载玻片上 , 复盖封口膜于 37 ℃孵
育 30 m in, 之后依次经 37 ℃预热的 1 ×PBS/012% Tween 20、015 ×PBS/012% Tween 20、012 ×PBS/
012% Tween 20溶液中各洗 3 m in左右。待玻片自然晾干 , 杂交区域滴加 10μL DAP I复染 10 m in, 封
片 10 m in, 在暗条件下风干玻片。
采用 O lympus BX51荧光显微系统进行图像检测和分析。
2　结果与分析
211　梨树组织中 ACL SV的 PR INS2F ITC染色结果
PR INS2F ITC染色结果表明 , 带病毒的叶片出现绿色的荧光阳性信号 (图 1, A～D, 箭头所指示
的位置 ) , 与原位 RT2PCR检测的结果 (牛建新 等 , 2007) 一致。而健康植株的叶片 (图 1, E) 和
带病毒叶片省去 SuperS cript ⅡRT、省去引物、省去荧光抗体、省去 Taq酶的对照均未出现绿色荧光信
号 (图 1, F～ I)。
212　梨树组织中 ACL SV的 PR INS2Rhodam ine染色结果
PR INS2Rhodam ine染色结果表明 , 带病毒叶片出现红色荧光阳性信号 (图 2, A～D , 箭头所指示
的位置 ) , 与原位 RT2PCR检测的结果 (牛建新 等 , 2007) 一致。而健康植株叶片 (图 2, E) 和带
病毒叶片省去 S uperScript ⅡRT、省去引物、省去荧光抗体、省去 Taq酶的对照均未出现红色荧光信号
(图 2, F～ I)。
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3　讨论
引物原位标记技术的基本原理是将特异性寡核苷酸引物与已变性的 DNA模板退火 , 在 dNTP (其
中一种脱氧核苷酸已标记 ) 及 TaqDNA聚合酶存在的条件下使引物得以延伸并同时被标记 , 由于反应
体系中的引物延伸将严格遵循碱基配对原则 , 从而保证了标记的特异性 (徐杰 等 , 2002)。牛建新
等 (2006) 利用原位 RT2PCR的方法对 ACLSV在梨树组织中的存在位置进行了定位。本研究利用
PR INS技术对此进行了进一步的验证 , 得到相同的结果。实践证明 PR INS技术是一种快速进行原位
检测病毒的方法 , 虽然有时也会造成一些背景信号 , 但是一般不会影响结果的判断。原位引物标记反
应的特异性主要取决于退火温度 , 所以退火温度要通过准确地计算与预试验来确定 , 当使用不同型号
的原位 PCR仪进行反应时 , 退火与延伸温度均应做相应调整。标记信号强度也是应予重视的问题 ,
Terkelsen等 (1993) 曾提出采用重复引物原位标记 ( repeated2PR INS) 技术来提高信号的强度 , 倪斌
等 (1998) 发现虽然可以达到增强信号的强度 , 但玻片上的细胞经过长时间的反复高温变性和延伸
过程而失去正常的形态。本研究中加入 Anti2digoxigenin2F ITC抗体后 , 再加增强荧光信号的抗体可提
高标记信号的强度。也可以通过增加 dTTP与标记的 dUTP的比例 , 因为在一般情况下 , dTTP与标记
的 dUTP的浓度比例 1∶1即可产生足够强的标记信号 , 如果将 dTTP与标记的 dUTP浓度之比提高到 1
∶3, 可进一步提高信号强度。
使用寡聚核苷酸引物标记病毒所在位置的方法比原位杂交 ( in situ hybridization, ISH ) 省时 , 杂
交信号更强 , 特异性更易控制 ( Koch et al. , 1989) , 可进行 mRNA的标记。近年来 , PR INS技术得
到了很大发展 ( Thomas et al. , 2001; Yan et al. , 2001; Cinti et al. , 2002; Tharapel & Kadandale,
2002; 徐杰 等 , 2002; Pellestor, 2006; Pellestor et al. , 2006; Tharapel & W achtel, 2006a, 2006b;
W achtel & Tharapel. , 2006; 曾梅 等 , 2006; Kaczmarek et al. , 2007)。该技术是将 PCR的特异性与
特异 DNA序列的细胞学定位结合起来 , 可以在细胞及细胞形态结构信息与分子信息背景清晰的条件
下 , 获得准确的靶序列标记信号。PR INS技术与传统的原位杂交和原位 PCR技术相比较 , 省去了探
针制备 , 探针孵育等几个关键的耗时费力的操作步骤 , 更简便、快速、高效、准确。同时 PR INS技
术所采用的试剂价格更为低廉。随着 PR INS技术的发展和成熟已逐渐引起研究人员的重视 , 该技术
在原位检测、染色体定位等方面具有更为广泛的应用前景。
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