全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（3）：549–555 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2010–09–13；修回日期：2011–01–19
基金项目：国家自然科学基金项目（30700543）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项；农业部园艺作物遗传改良重点开放实验
室项目；农业部大宗蔬菜产业技术体系项目（nycytx-35）
* E-mail：zhangyy@caas.net.cn
拟南芥叶绿体 SSR 引物在甘蓝上的应用
张扬勇*，方智远，王庆彪，刘玉梅，杨丽梅，庄 木，孙培田
（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）
摘 要：根据拟南芥的叶绿体全基因组序列，搜索获得 89 个叶绿体基因组 SSRs（cpSSRs），平均每
1.736 kb 出现 1 个 SSR。针对这些 SSR 设计 cpSSR 引物 58 对，其中 32 对能在甘蓝上应用。5 对引物在
甘蓝 C300、C322 和波里马油菜 N478、N479 间有多态性，这些片段均位于基因内含子区或基因间隔区。
测序结果显示单核苷酸 A/T 重复数从 8 个到 13 个不等。同源性比较表明 C300、N479 之间的同源性大于
两者与拟南芥之间的同源性。
关键词：甘蓝；叶绿体 SSR；波里马油菜；多态性
中图分类号：S 635 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）03-0549-07

Utility of Arabidopsis Chloroplast Simple Sequence Repeat（cpSSR）
Primers in Cabbage（Brassica oleracea L. var. capitata L.）
ZHANG Yang-yong*，FANG Zhi-yuan，WANG Qing-biao，LIU Yu-mei，YANG Li-mei，ZHUANG Mu，
and SUN Pei-tian
（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）
Abstract：According to the Arabidopsis thaliana chloroplast whole genome sequence，89 chloroplast
SSRs（cpSSRs）were searched，with an average of 1.736 kb per SSR. Thirty-two pairs of primers，out of
58 designed primers got effective amplification in cabbage. Between cabbage C300，C322 and rapeseed
polima N478，N479，five primers showed polymorphism，which located in intron or intergenic region. The
number of single nucleotide repeat A/T ranged from 8 to 13. Homology between C300 and N479 was
greater than the homology between Arabidopsis thaliana and C300，N479.
Key words：Cabbage；cpSSR；polima rapeseed；polymorphism

过去 20 多年里，简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR）分子标记技术在甘蓝重要农艺
性状定位、核心种质构建、遗传多样性分析、图谱构建等方面得到广泛应用（陈琛 等，2010）。与
核基因组相比，叶绿体（chroloplast，cp）基因组为单亲遗传，保守程度高，结构相对简单，因此在
很多作物上利用叶绿体 SSR 标记进行原生质体融合植株鉴定、亲缘关系评价、叶绿体单倍型划分等
（Kaundun et al.，2002；Cheng et al.，2003；龚桂芝 等，2008；Fabio et al.，2009）。此外利用 RFLP、
CAPs 等标记也有报道，然而 RFLP 技术存在试验繁琐、费时费工的缺点，CAPs 标记也受酶切位点


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的限制（Jack et al.，1995；Panda et al.，2003）。
国内外很多甘蓝育种者以 polCMS 为不育源转育甘蓝、白菜、青花菜等芸薹属作物（Yarrow et al.，
1990；张鲁刚 等，2001；马超，2007），圣尼斯种子公司通过有性杂交方式将 polCMS 转到青花菜
中（USA 专利 6046383）。然而异源胞质有核质不协调的风险（方智远 等，2004），在育种过程中本
课题组也发现 polCMS 转到甘蓝后即使多代回交转育，除雄性不育性状外仍有一些不良性状，如种
荚心皮化、花朵瓣化等。而且在不同核背景条件下均出现这些不良性状，因此这些不良性状的出现
应归因于胞质的差异。
鉴于目前还未见叶绿体 SSR（cpSSR）标记在甘蓝上应用的报道，有必要开发在甘蓝上可应用
的 cpSSR。本研究中以拟南芥叶绿体全基因组序列为基础，设计 cpSSR 引物，以甘蓝自交系和波里
马油菜（polCMS）为试材，一方面筛选可在甘蓝上应用的 cpSSR 引物，另一方面用设计的 cpSSR
引物分析甘蓝和 polCMS 油菜在叶绿体基因组水平上的差异。
1 材料与方法
1.1 材料
甘蓝自交系 C300 为引自俄罗斯的晚熟耐寒材料，C322 为从荷兰引进的早熟圆球材料，均由中
国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝组提供。波里马 polCMS 油菜 N478 和 N479 由西南大学农学与生
物科技学院钱伟博士提供。以上材料于2009年7月播种在中国农业科学院蔬菜花卉研究所试验基地。
1.2 总 DNA 提取
利用改良 CTAB 法提取幼嫩叶片基因组总 DNA。
1.3 SSR 引物设计
根据 NCBI 数据库的拟南芥叶绿体基因组序列（GI：7525012），登陆网站 http：//www. gramene.
org/gremene/searches/ssrtool，应用 SSRIT 软件结合人工搜索 SSR。搜索标准参照 Li 等（2010）：单
核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重复序列的重复次数分别大于或等于 10、5、5、5。所有
重复类型的总核苷酸数大于 10 个。利用 Primer Premier 5.0 程序设计引物，引物长度在 20 ~ 25 bp，
由上海生物工程技术服务有限公司合成。为了在聚丙烯酰胺凝胶上获得好的分离效果，预期产物长
度一般控制在 100 ~ 400 bp。
1.4 SSR 分析
PCR 反应体系（20 μL）包括：200 mol · L-1 dNTPs，正反向引物各 0.4 ng · μL-1，1.0 U Taq 酶，
1 × Buffer（内含 1.5 mmol · L-1 MgCl2），20 ng DNA 模板，所用试剂均购自北京博迈德科技发展公司。
PCR 扩增反应条件是： 94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 30 s，合适温度退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，
30 个循环；72 ℃延伸 7 min。各引物的合适退火温度根据引物合成报告单而定。8%聚丙烯酰胺凝
胶电泳分离 PCR 产物，160 V 恒压，快速银染法染色。
1.5 PCR 产物测序及分析
为验证扩增产物的叶绿体来源，所有能在甘蓝上应用的 SSR 引物扩增产物经回收纯化后，以自
身 SSR 引物进行双方向直接测序，每测序反应均重复 2 次，由北京博迈德科技发展公司完成。获得
的序列进行 NCBI Blast 在线比对。
3 期 张扬勇等：拟南芥叶绿体 SSR 引物在甘蓝上的应用 551

为比较甘蓝和 polCMS 间的叶绿体基因组片段差异，扩增的多态性条带回收纯化后进行测序，
与拟南芥相应区域进行同源比对。
2 结果与分析
2.1 拟南芥 cpSSR 引物设计及其在甘蓝上的应用
根据拟南芥叶绿体基因组序列，共搜索获得 89 个 cpSSR。
单核苷酸 n ≥10 的 SSR 数量最多（69 个），单核苷酸 SSR 中以 A/T 重复类型为主（68 个）。

表 1 在甘蓝 C300 和 C322 上特异扩增的 cpSSR 引物表
Table 1 The cpSSR primers with specific bands in cabbage
引物
Primer
SSR单元
Motif
SSR 起点
SSR start
SSR 终点
SSR end
分区
Region
正向引物 5′→3′
Forward primer
反向引物 5′→3′
Reverse primer
ACP1 A15 112 126 LSC GAACGACGGGAATTGAACC GGTGGAATTTGCTACCTTTTT
ACP2 A10 1781 1790 LSC GAAAAATGCAAGCACGGTTT TACGATCCGTAGTGGGTTGC
ACP4 T12 4114 4125 LSC TACCCGTATTAGGCACTA TTTGTAAGACCACGACTG
ACP7 A13 7905 7917 LSC TGGAGAAGGTTCTTTTTCAAGC CGAACCCTCGGTACGATTAA
ACP9 A10 8502 8511 LSC AACCATAATCATAGAAATAGAG GTCGAACAAAGTAATCGG
ACP10 T10 12843 12852 LSC GTATTAAATCCGAAACTC ACTTGACATAAAACTTGG
ACP15 T10 25684 25693 LSC CGACCAATCCTTCCTAAT GAATGTTTGCTACCCTGA
ACP17 T13 28673 28685 LSC TGCACTCTTCATTCTCGTTCC GCGTTCCTTTCATTTAAGACG
ACP18 T10 28835 28844 LSC AATGAAGAGTGCAGTAGC CTAGGTTTTAGAAAGGAAA
ACP20 T10 30667 30676 LSC CTCAACCGCCATCATACT CGAAACTTAACCCTCTTT
ACP25 A10 36693 36702 LSC CCCAAACCAAAGAGTGTA GCTCGCAAGGCTCATAAC
ACP26 A11 42555 42565 LSC AGAGGACCAAGAAACCAA AACAGGCCATTCAACAAG
ACP27 45196 45206 LSC GAAGAGCAAACAAGGGAT GAAGGGTTAGTCAATCAAAT
ACP29
T11
T13 49959 49971 LSC GGCCATAGGCTGGAAAGTCT GTTTATGCATGGCGAAAAGG
ACP32 T10 56839 56848 LSC TTCATAAGCGAAGAACAA TCAGAGTAAGCAAAACAT
ACP33 A13 57372 57384 LSC AGGGATAGTAATAAGAATAG CAGATGTAAGAACGAAAA
ACP35 T10 60382 60391 LSC ATTGGCTTACTTCTTGCG GGTTTCCGGGATGTTATT
ACP38 G13 67164 67176 LSC GGTTCGTTAGCAGGTTTA GTTCCCTAGCAACACTTT
ACP39 A11 68086 68094 LSC AGACGGGTGAATAGAGTG GTTATGCTTTTCGACGAT
ACP40 A13 70189 70201 LSC GCAGAATGAGACGGGATA AGACACTTTGGGATTGCT
ACP41 T13 70404 70416 LSC GGCTCCACAATGGAATTGAC GCACATTTCAGCGTCACAAA
ACP42 T11 71178 71188 LSC CTTTCTCGATAAAGTCGGTTGA GGAAGAAGCCCGTTCAGG
ACP43 A12 76735 76746 LSC GCTGTCGTGGATGAGTGG AAGTGCTTTCTGGGTCGT
ACP44 T14 78095 78108 LSC ATTGTAGATTCTGGGAGG ATCGATGCTGTATTCATG
ACP45 T11 82454 82464 LSC TTACATTGCTTTTCTTACAG CTCGTTGGTTTAGGATTA
ACP46 (TA)5 94532 94539 IR CTACCATTTCACCACCAA GGACCCTATTCACCTCTT
ACP47 T11 99400 99410 IR TGTACTTATGGGAAAGCG CTGGGTTCTTCTACTTCATT
ACP48 T11 100168 100178 IR AGGCAAGATGATAGGATA CAAGTCAAGATGATACGG
ACP49 A10 108115 108124 IR AATAGCTCGACGCCAGGAT TTCGGATGTGAAAGTGCC
ACP50 A10 110415 110424 IR TCCGAGTGAATGGAAAAG GATGGAATTACAAATGGAGTAG
ACP51 (TA)5 112698 112707 SSC TTCTTATTCACTGGTTTG GTGGAAATCTTTGTTCTA
ACP58 T10 127024 127033 SSC GCTATCCCAAGTTTCTGC TGGCTTTGATCCGTTATT
注：引物设计序列来源 NCBI 数据库（GI：7525012）；LSC、IR、SSC 区的划分参见 Sato 等（1999）。
Note：Sequence for primer design was downloaded from NCBI database（GI：7525012）；LSC，IR，SSC area division was cited from Sato et
al.，（1999）.
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二核苷酸 SSR 只有 AT/TA 一种类型，三核苷酸 SSR 也只有 AAT/TTA、TAT/ATA 两种类型。
进一步比较长单拷贝区（LSC）、反向重复区（IR）、短单拷贝区（SSC）3 个不同区域的分布，
发现 SSC 区出现的频率最高（9.00 个 SSR/10 kb），其次为 LSC（7.24 个/10 kb），最少为 IR 区（均
为 2.28 个/10 kb）。针对这些 SSR 用 Primer Premier 5.0 程序，设计出 58 对拟南芥 cpSSR 引物，在甘
蓝上能通用的有 32 对（表 1），通用性比例为 55.17%。其中来自 LSC 区的通用性比例为 55.56%
（25/45），IR 区 100%（5/5），SSC 区 25%（2/8）。
引物通用性比例从高到低顺序为：IR 区 > LSC 区 > SSC 区，正好与 SSR 位点的分布频率（SSC
区 > LSC 区 > IR 区）相反。因此在拟南芥 cpSSR 出现频率越高的区域，甘蓝上通用的引物越少。
2.2 甘蓝上 cpSSR 扩增产物的同源性
为验证这 32 个扩增产物的叶绿体来源，对能在甘蓝上通用的扩增产物回收纯化、测序，拼接
后经 Blast 在线比对，获得同源序列信息。从表 2 可见，所有的 32 对引物扩增片段的序列 BLAST
后均与种（属）内叶绿体序列同源，最大同源性均在 91%以上，部分达到 100%。期望值（E 值）
很低，表明叶绿体基因组的保守性很强。其中最高同源性片段 X17331.1、GQ861354.1、AY541615.1、
DQ231548.1、AF451562.1、AP009374.1、AP009370.1、EU410077.1、AC189190.1 分别对应于白芥、
甘蓝型油菜、甘蓝野生种、大白菜、甘蓝、独行菜、山芥、甘蓝、大白菜的叶绿体序列，它们都属
于十字花科作物。

表 2 甘蓝上各拟南芥 cpSSR 引物扩增片段的 Blast 结果
Table 2 Blast result of cpSSRs amplified fragments in cabbage
引物
Primer
最高同源性片段
Fragment with
highest identity
最大同源性/%
Maximum
Identity
E 值
E-value
引物
Primer
最高同源性片段
Fragment with highest
identity
最大同源性/%
Maximum
Identity
E 值
E-value
ACP1 X17331.1 91 2e-52 ACP35 GQ861354.1 99 3e-143
ACP2 GQ861354.1 97 3e-49 ACP38 DQ231548.1 91 4e-97
ACP4 AY541615.1 97 1e-137 ACP39 AC189190.1 99 7e-155
ACP7 GQ861354.1 97 9e-61 ACP40 GQ861354.1 99 5e-141
ACP9 GQ861354.1 100 4e-132 ACP41 GQ861354.1 97 4e-127
ACP10 DQ231548.1 98 1e-157 ACP42 GQ861354.1 98 0.0
ACP15 AP009374.1 99 2e-98 ACP43 AC189190.1 99 6e-161
ACP17 GQ861354.1 100 3e-65 ACP44 GQ861354.1 99 2e-171
ACP18 GQ861354.1 98 1e-172 ACP45 DQ231548.1 99 3e-164
ACP20 AF451562.1 95 3e-134 ACP46 GQ861354.1 99 1e-142
ACP25 GQ861354.1 98 1e-168 ACP47 GQ861354.1 99 2e-99
ACP26 GQ861354.1 97 6e-110 ACP48 GQ861354.1 99 4e-152
ACP27 GQ861354.1 99 2e-135 ACP49 GQ861354.1 100 2e-89
ACP29 AP009370.1 96 8e-93 ACP50 GQ861354.1 100 1e-137
99 3e-76 ACP51 GQ861354.1 96 4e-148 ACP32
ACP33
GQ861354.1
EU410077.1 99 2e-119 ACP58 GQ861354.1 95 2e-131

2.3 在甘蓝和 polCMS 油菜上的 PCR 扩增及其多态性差异
通过筛选获得在甘蓝和 polCMS 油菜之间有多态性（图 1）的引物 5 对：ACP2、ACP 4、ACP 35、
ACP 38 和 ACP 47，占通用引物数的 15.63%。ACP2、ACP 4、ACP 35 和 ACP 38 位于 LSC 区，ACP47
位于 IR 区，这与大多数 SSR 位于 LSC 区的分布特征是一致的。虽然 SSC 区的 SSR 频率很高，但
没有发现在 SSC 区有多态性的引物。根据拟南芥叶绿体全长序列信息（GI：7525012），其中 ACP2
位于 trnK 内含子区，ACP4、ACP 35、ACP 38、ACP 47 分别位于 trnS-trnG、ycf4-cemA、psaJ-rpl33、
tRNAval-rps7 基因间隔区。
3 期 张扬勇等：拟南芥叶绿体 SSR 引物在甘蓝上的应用 553


图 1 在甘蓝自交系 C300、C322 以及 polCMS 油菜上不同引物扩增产物的差异
M：100 bp marker；1：N478；2：N479；3：C300；4：C322；
片段大小均为参照 DNA marker 的估计值。
Fig. 1 PCR products polymorphism between cabbage C300，C322 and polCMS N478，N479
Fragment size was estimated according to DNA marker.
2.4 PCR 产物测序验证及序列比较
PCR 产物经纯化后以正反向引物进行测序。因为在两份甘蓝、两份 polCMS 油菜内部的带型一
致，只选其中的 C300、N479 的扩增产物测序。
测序结果如表 3 所示，C300 和 N479 之间 SSR 重复单元数差别不等，但差别均小于或等于 3
个重复单元（表 3、图 2）。
表 3 部分 cpSSR 引物扩增产物在 C300 及 N479 间多态性的比较
Table 3 Polymorphism of some cpSSR amplified products between C300 and N479
扩增片段长/bp
Fragment length
重复基元
Repeat motif
与拟南芥对应区域同源性
/%
Similarity with Arabidopsis
C300 与 N479 同
源性/% 引物
Primer
重复基元
Repeat
motif
SSR 起点/bp
SSR start site
C300 N479 C300 N479 C300 N479
Similarity between
C300 and N479
ACP2 A10 1 781 120 123 A8 A11 91.7 94.3 95.0
ACP4 T12 4 114 287 285 T13 T12 94.0 98.9 95.4
ACP38 G13 67 164 276 262 T8 T11 78.2 75.8 91.2
ACP47 A11 139 239 241 262 A10 A11 83.0 93.1 95.0

ACP2、ACP4、ACP47 的 SSR 位点碱基类型与拟南芥一致，只是重复数有区别。但 ACP38 的
SSR 位点碱基类型不同于拟南芥，发生了 T/G 替换，在拟南芥里是 13 个 G，但在 C300 和 N479 中
相应位置变成了包含 8 或 11 个 T。
甘蓝、油菜属于十字花科芸薹属，拟南芥为十字花科拟南芥属。从序列同源性比较来看，甘蓝
与波里马油菜间的同源性高于这两者与拟南芥之间的同源性，表明在叶绿体水平上属间差异要大于
属内差异（表 3）。

ACP2 cab 61 TTTCCTTGTTAAATGAAAAAA---AAGTAAAAAACCCCTCCCCAAACCGTGCTTGCATT 116
Pol 61 TTTCCTTGTTAAATGAAAAAAAAAAAGTAAAAAACCCCTCCCCAAACCGTGCTTGCATT 119
ACP4 cab 120 TCCATTTATATTTATTCACTCGACCCAAATTGGAATTCTTCTTTTTTTTTTTT-CGACAA 178
pol 121 TCCATTTATATTTATTCACTCGACCCAAATTGGAATTCTTCTTTTTTTTTTTTTCGACAA 180
ACP38 cab 61 GGCCCCCCTTTTTTT- -TCTAATTCTTTTTTATTCTAAAAAAATTTATTCTAAAAAAAGA 118
pol 61 GGCCCCCTTTTTTTTTTTCTAATTCTTTTTTATTCTTAAAAAA--------------GA 105
ACP47 cab 181 TTTTTTTTTGATCAAAAAAAAATCACTATGTGAAATCTTCGTTTTTTTTTT-CTCTTTCT 219
pol 161 TTTTTTTTTGATCAAAAAAAAATCACTATGTGAAATCTTCGTTTTTTTTTTTCTCTTTCT 240
图 2 引物 ACP2、ACP4、ACP38 和 ACP47 的扩增产物序列比对结果
Fig. 2 Sequence comparison of ACP2，ACP4，ACP38 and ACP47 amplified products
554 园 艺 学 报 38 卷
3 讨论
3.1 cpSSR 引物的开发及应用前景
本研究中搜索标准是单核苷酸重复数≥10，与 Cheng 等（2003）、Daniel 和 Rod（2009）、Li 等
（2010）的搜索标准相符合，比 8 个（Jakobsson et al.，2007）更多，比 17 个（王化坤 等，2006）
更少。这既保证了这些 cpSSR 在甘蓝上的通用性，又可以获得足够多的多态性。从本研究测序结果
来看，5 个多态性引物均在 C300 和 N479 间表现出 SSR 位点的差异。
本研究首次获得了可以在甘蓝上应用的 32 对 cpSSR 引物，将来可用于甘蓝细胞质多样性、亲
缘关系鉴定、细胞质雄性不育类型划分等方面的研究。58 对引物中有 26 对不能在甘蓝上获得有效
扩增，这是由于拟南芥、甘蓝的叶绿体基因组差异引起的。Cheng 等（2003）从 22 对水稻、黑松、
烟草的 cpSSR 中仅筛选出 9 对能用于柑橘胞质研究，通用性比例为 40.91%。而拟南芥、甘蓝均属
于十字花科作物，亲缘关系更近，因此在本研究中获得了更高的通用性比例。
3.2 利用基因组 DNA 扩增叶绿体 cpSSR 的可靠性
从本研究中扩增片段的特异性、同源性、Blast 结果 E 值（≤2e-52）来看，扩增片段是来自于
叶绿体基因组，不是来自核基因组。这与在茶树（Kaundun et al.，2002）、柑橘（Cheng et al.，2003）、
树兰（Fabio et al.，2009）等作物上，采用特异 cpSSR 引物和总基因组 DNA 模板扩增叶绿体片段的
结果一致。这既避免了叶绿体 DNA 提取的繁琐程序，也避免了叶绿体 DNA 提取过程中核基因组
DNA 的污染带来的影响。
3.3 PolCMS 胞质与甘蓝胞质的差异
在线粒体水平上，polima 胞质位于 atp6 基因上游的嵌合基因 orf224 与 CMS 密切相关（Singh &
Brown，1991）。然而是否在线粒体其它区域和叶绿体基因组上还有区别呢？本课题组还用 21 对线
粒体 SSR 引物分析 C300、C322 和 N478、N479 间的多态性，但没有检测到长度多态性（数据未附），
这也表明自交系 C300、C322 和 N478、N479 间胞质 SSR 的差异主要来自于叶绿体。
一些叶绿体基因间隔区已被证明可以调控基因的转录和翻译，如 petB-petD 基因间隔区（Monde
et al.，2000）、petA 和 psaC 的 5′非翻译区（Schmitz et al.，2005）、atpI-atpH 和 psaJ-rpl33 间隔区（Pfalz
et al.，2009）。本研究的多态性引物 ACP38 正好位于 psaJ-rpl33 间隔区，这种差异是否影响 psaJ、
rpl33 的 RNA 转录调控有待于进一步研究。

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