全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（4）：740–746 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2010–07–16；修回日期：2011–03–09
基金项目：国家科技支撑计划项目（2007BAD07B04）；福建省自然科学基金项目（2009J01066）
* E-mail：wjhham@yahoo.com.cn
中国水仙 3 个特异种质的分子细胞遗传学分析
吴菁华*，张志忠，吕柳新
（福建农林大学园艺学院，福州 350002）
摘 要：应用荧光原位杂交技术进行 rDNA 在黄花水仙和两色花水仙染色体上的定位研究，并分析
了两色花水仙的基因组成。结果表明：不同材料的 NOR 位点表现出多态性，即黄花水仙上具 3 个 45S rDNA
位点，两色花水仙具有 5 个位点；5S rDNA 在位点和数量上表现出一致性。基因组荧光原位杂交结果表
明两色花水仙的染色体有 10 条来自于黄花水仙，22 条来自于白花水仙。根据 rDNA 在这些种质资源上的
分布，结合 GISH 技术的分析，证实两色花水仙是黄花水仙和白花水仙的天然杂交种。
关键词：中国水仙；基因组原位杂交；荧光原位杂交
中图分类号：S 682.2+1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）04-0740-07

Molecular Cytogenetic Analysis of Special Germplasm of Narcissus tazetta
var. chinensis
WU Jing-hua*，ZHANG Zhi-zhong，and Lü Liu-xin
（Horticulture College，Fujian Agricultural and Forestry University，Fuzhou 350002，China）
Abstract：Used florescence in situ hybridization（FISH）and genomic in situ hybridization（GISH）
techniques to analyze the genomic organization in Narcissus tazetta var. chinensis Roem. distributed in
China. Chromosome localization of 45S rDNA and 5S rDNA were studied by means of FISH on
metaphase chromosomes of yellow flower narcissus and two-color flower narcissus. The results showed
that NOR loci of different materials showed polymorphism. There were three 45S rDNA loci in yellow
flower narcissus，while there were five loci in two-color flower narcissus. The distribution of 5S rDNA
appeared similar in the two genomes. Based on GISH analysis，two-color flower narcissus（2n = 3x = 32）
had two genomes of white flower narcissus（2n = 2x = 22）and a single genome of yellow flower narcissus
（2n = 2x = 20）. By comparing the physical location of 45S rDNA and 5S rDNA on chromosomes and the
result of GISH，it was believed that two-color flower narcissus was the result of nature hybridization
between white flower narcissus and yellow flower narcissus.
Key words：Narcissus tazetta var. chinensis Roem.；genomic in situ hybridization（GISH）；
florescence in situ hybridization（FISH）

水仙具有极高的观赏价值和经济价值，但仅有中国水仙（Narcissus tazetta var. chinensis Roem.）
原产我国。福建是中国水仙的主产地，其中以漳州水仙最负盛名，畅销海内外。由于中国水仙栽培

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品种均为三倍体，故不结籽，无法实生播种繁殖，从而阻碍了群体间的基因交流，并且关于中国水
仙遗传背景研究较少。针对上述情况，福建农林大学园艺学院在 20 世纪 80 年代在福建各地区进行
了水仙资源调查与收集，获得了一些特异中国水仙种质资源，如白花水仙（2n = 2x = 22），白花，雌
雄配子发育较正常，可结籽；黄花水仙（2n = 2x = 20），黄花，可育；两色花水仙（2n = 3x = 32），
两色花类型，花量大，香味浓，生长旺盛，抗病性强。这些水仙种质资源为培育水仙新品种提供了
宝贵的原始材料，对其研究将有助于水仙的育种工作。
荧光原位杂交技术（Florescence in situ hybridization，简称 FISH）是分子生物学和组织化学、
细胞学结合的产物，经过不断发展和完善，现已广泛应用于生物学研究的许多领域。核糖体 RNA
基因（rDNA）是一种多拷贝的串联重复序列，作为一种准确的分子细胞遗传学标记，rDNA 广泛应
用在染色体组型、亲缘关系、多倍体的起源与非整倍体的鉴定、基因组进化与发展趋势等研究中（周
树军 等，2008；Diao et al.，2009；Robledo et al.，2009）。基因组原位杂交（Genomic in situ hybridization，
GISH）作为 FISH 技术的改进技术，被广泛用于鉴别异源多倍体的基因组组成、分析异源多倍体基
因组的起源和进化以及不同基因组相互关系的研究（李淑梅 等，2009；Liu et al.，2009；Nkongolo
et al.，2009）。本研究旨在利用原位杂交技术对这些水仙特异种质进行鉴定，并分析其遗传组成。
1 材料与方法
试验于 2004—2009 年在福建农林大学园艺学院遗传育种实验室完成。供试的中国水仙共有 3
种不同基因型：白花水仙（2n = 22）；黄花水仙（2n = 20）和两色花水仙（2n = 32），由福建农林大
学园艺遗传育种教研室保存提供。
45S rDNA 和 5S rDNA 克隆在大肠杆菌 DH5α的 pUC19 载体上，由中国科学院遗传研究所程祝
宽研究员惠赠。分别以 45S rDNA 和 5S rDNA 为探针与黄花水仙及两色花水仙染色体进行杂交，
rDNA 的荧光原位杂交方法采用吴菁华等（2008）描述的方法；基因组染色体原位杂交参照 Cheng
等（2002）方法进行。染色体标本的制备：黄花水仙及两色花水仙的根尖用到 2%纤维素酶与 0.5%
果胶酶的混合液中，37 ℃酶解 55 min，采用火焰干燥法制片。探针的制备：rDNA、白花水仙和黄
花水仙的基因组 DNA 用地高辛（DIG）-11-dUTP（Roche 公司）通过缺口平移方法进行标记。封阻
DNA 的制备：白花水仙、黄花水仙的基因组 DNA 进行高压灭菌，使其剪切成 200 ~ 500 bp 的短 DNA
片段作封阻。以基因组总 DNA 为探针的 GISH 杂交，首先要使探针与封阻 DNA 进行复性，然后再
进行杂交。其余步骤二者均相同，如下。
原位杂交预处理：每张载玻片加 100 μL RNaseA（100 μg · mL-1），盖上塑料盖片，37 ℃保温 30
min；2 × SSC 漂去盖片，2 × SSC 洗涤 3 × 5 min，37 ℃ 4%多聚甲醛处理 10 min，2 × SSC 洗涤 3 × 5
min，用 70%、90%和 100%乙醇依次脱水，每级 5 min。室温干燥备用。
原位杂交：每张载玻片加 40 μL 杂交液（100%去离子甲酰胺 20 μL；50%硫酸葡聚糖 8 μL；20 ×
SSC 4 μL；10% SDS 1 μL；鲑鱼精 DNA 1 μL；探针 DNA 100 ng；无菌水加至 40 μL），盖上塑料盖
片，放入烘箱中杂交，首先 90 ℃ 5 min；然后缓慢冷却到 37 ℃；37 ℃杂交过夜。
洗脱与信号检测：杂交后的制片用 2 × SSC 在 42 ℃下冲洗脱盖片，后续冲洗过程如下：2 × SSC
42 ℃冲洗 10 min；2 × SSC 室温下冲洗 3 次，每次 3 min；4 × SSC/Tween 20 室温下冲洗 5 min。用
5%的 BSA 封闭 15 min，之后甩干剩余封闭液（载片不见干），每一制片加 20 μL 抗体（Anti-Dig-FITC，
溶于 0.5%的 1 × PBS）染色，加盖片，37 ℃温育 1 h。4 × SSC/Tween 20 中冲洗 3 次，每次 8 min。
用 2 μg · mL-1 溶于 4 × SSC/Tween 20 的 PI 复染 10 min，1 × PBS 洗去浮色，用抗衰剂封片。利用 Zeiss
荧光显微镜观察，Kodak 400 彩色胶卷拍照。
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2 结果与分析
2.1 rDNA 的杂交分析
以地高辛–dUTP 标记 rDNA，分别与黄花水仙和两色花水仙的分裂中期和间期细胞进行杂交，
均观察多个杂交信号清晰明确的中期分裂相。杂交的结果见图 1。带 rDNA 标记的 FISH 核型模式图
见图 2。



































图 1 45S rDNA 和 5S rDNA 在不同倍性水仙染色体上的分布
A1、A2. 45S rDNA 在黄花水仙染色体上的分布。A1. 中期染色体；A2. 间期细胞。B1、B2. 45S rDNA 在两色花水仙染色体上的分布。
B1. 中期染色体；B2. 间期细胞。C1、C2：5S rDNA 在黄花水仙染色体上的分布。C1. 中期染色体；C2. 间期细胞。
D1、D2：5S rDNA 在两色花水仙染色体上的分布。D1.中期染色体；D2. 间期细胞。
Fig. 1 FISH localization of 45S rDNA and 5S rDNA on chromosomes of different ploidy narcissus
A1，A2. FISH localization of 45S rDNA on chromosomes of yellow flower narcissus. A1. Metaphase chromosomes；A2. Interphase cell.
B1，B2. FISH localization of 45S rDNA on chromosomes of two-color flower narcissus. B1. Metaphase chromosomes；B2. Interphase cell.
C1，C2. FISH localization of 5S rDNA on chromosomes of yellow flower narcissus. C1. Metaphase chromosomes；C2. Interphase cell.
D1，D2. FISH localization of 5S rDNA on chromosomes of two-color flower narcissus.
D1. Metaphase chromosomes；D2. Interphase cell.
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2.1.1 45S rDNA的杂交分析
黄花水仙：45S rDNA 在黄花水仙上有 3 个信号（图 1，A1 和图 2，A），较强的一对位于 7 号
染色体短臂末端；在第 8 号染色体上只有一条染色体短臂末端具有较弱的杂交信号（箭头所示），而
另一个第 8 号染色体上则没有信号。同样，间期细胞核中（图 1，A2）有 3 个信号。
两色花水仙：45S rDNA 在两色花水仙上有 5 个信号（图 1，B1），其中 2 个分别在第 6 号染色
体上（箭头所示），信号较弱；有 3 个在第 7 号染色体上，信号较强，所有信号都位于染色体的短臂
的末端。间期细胞核亦看见 5 个清晰的杂交信号（图 1，B2 和图 2，B、C）。
2.1.2 5S rDNA的杂交分析
5S rDNA 与黄花水仙和两色花水仙的分裂中期和间期细胞进行杂交，结果如下。
黄花水仙：杂交信号检出 1 对，位于第 2 号源染色体的长臂上（图 1，C1；图 2，A）。间期细
胞核亦看见 2 个杂交信号（图 1，C2）。
两色花水仙：杂交信号检出 3 个，分布在第 2 号染色体长臂的端部（图 1，D1；图 2，B、C）。
间期细胞核同样出现 3 个杂交信号（图 1，D2）。根据核型模式图分析，这 3 个杂交信号应该 1 个分
布在 x = 10 的染色体组的第 2 号染色体上，另 2 个应该分布在 x = 11 染色体组的第 2 号染色体上。



图 2 两类水仙中期染色体 FISH-rDNA 核型模式图
A. 黄花水仙；B. 两色花水仙（x = 10）；C. 两色花水仙（x = 11）。
Fig. 2 Karyo-idiograms of two species in narcissus showing FISH based localization of the two rDNA sites
（45S and 5S rDNA）on metaphase chromosomes
A. Yellow flower narcissus；B. Two-color flower narcissus（x = 10）；
C. Two-color flower narcissus（x = 11）.

2.2 基因组原位杂交分析
以黄花水仙的基因组总 DNA 作探针，用白花水仙的基因组总 DNA 为封阻 DNA，与两色花水
仙根尖细胞染色体进行原位杂交，结果见图 3，A。在荧光显微镜下，用 PI 复染的染色体呈红色荧
光，染色体的常、异染色质片段清晰可辨，地高辛–dUTP 标记的探针经用抗地高辛抗体–荧光剂
FITC 检测之后呈现的绿色荧光，与染色体背景的红色组合而成黄绿色。从图中可以清晰地看到有
10 条染色体上有较强的杂交信号（箭头所示）。这一结果说明两色花水仙中包含了黄花类型的一
套 x = 10 的染色体组。
以白花水仙的基因组总 DNA 为探针，用黄花水仙的基因组总 DNA 为封阻 DNA，与两色花水
仙根尖细胞染色体进行原位杂交，结果（图 3，B）其中有 22 条染色体上有较强的杂交信号，其余
10条染色体的信号较弱（箭头标示弱信号染色体）这可能是由于封阻DNA处理得不够好或封阻DNA
的浓度过小，使得探针中的重复序列能够和非目标染色体上的重复序列进行杂交而产生弱信号。此
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结果说明两色花水仙中包含了两套 x = 11 的染色体组。


图 3 两色花水仙基因组组成的分子细胞学鉴定
A. 以黄花水仙总 DNA 为探针与两色花水仙的根尖细胞染色体的 GISH；B. 以白花水仙总 DNA 为探针与两色
花水仙的根尖细胞染色体的 GISH。
Fig. 3 Molecular and cytological identification of genomic components of the two-color flower narcissus
A. GISH of two-color flower narcissus with genomic DNA probe of yellow flower narcissus；
B. GISH of two-color flower narcissus with genomic DNA probe of white flower narcissus.
3 讨论
3.1 45S rDNA 和 5S rDNA 在不同染色体基数水仙上的分布
构成核糖体亚基的主要成分是核糖体 RNA（rRNA）与蛋白质的复合物。其中 rRNA 有 4 种类
型，编码这几种 rRNA 的基因有两种，一种为 45S rDNA，另一种为 5S rDNA。其中 45S rDNA 是串
联重复序列，其功能与核仁的形成直接相关。rDNA 编码区的保守性和非编码区的多态性是研究动
植物系统发育与进化的一个重要标记。rDNA 在染色体上分布的数目和具体定位可用于分析多倍体
物种的进化过程（Jiang & Gill，1994），同时也可根据 rDNA 在染色体上位置对传统核型的分析进行
校正。在以前对中国水仙的核型研究中认为黄花水仙没有随体的存在，而两色花水仙只有 1 对随体
（吕柳新，1990），但本试验中发现在黄花水仙上有 1 对杂交信号，而在两色花水仙上有 2 对杂交信
号。Taketa 等（1999）也认为多种植物 rDNA 的物理定位发现该基因除了在次缢痕及随体位置外，
在其它染色体上还有数量不等的位点分布，其起源尚不清楚。45S rDNA 则在不同染色体基数的水
仙上表现出数量和分布的多态性，在白花水仙中 4 个杂交信号分别位于第 6、7 号染色体上（吴菁华
等，2008），在黄花水仙上的 3 个杂交信号，位于第 7、8 号染色体上，两色花水仙中 5 个杂交信号
分别位于第 6、7 号染色体上。本试验中发现了 rDNA 位点丢失的现象，这可能是由于易位或与其他
DNA 序列融合所造成的。在芍药属中也发现了同源染色体之一具两个在不同染色体臂的位点，而另
一个没有位点这种现象（Zhang & Sang，1999）。一般来说，45S rDNA 位于长臂的情况较为少见，
但本试验发现 5S rDNA 在所有水仙上都是位于第 2 号染色体的长臂末端，表现出一致性。在葫芦科
植物中，5S rDNA 在染色体的末端、中部和靠近着丝粒的地方都有分布（李琦 等，2007）。Torrell
等（2003）在蒿属（Artemisia）7 个种中，通过 rDNA 的定位并结合荧光分带分析，确定了其种属
间的分类关系。本试验发现分析 45S rDNA 和 5S rDNA 在黄花水仙和两色花水仙染色体上的分布，
也可推断出它们的关系，这也表明 rDNA 可为研究中国水仙多倍体起源提供线索。
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3.2 两色花水仙的起源
基因组原位杂交是鉴定异源多倍体、远缘杂交种及远缘种染色体渐渗系或添加系的有效方法之
一，Xiong 等（2006）认为它在研究稻属不同基因组的起源与进化有着重要的作用。吕柳新（1990）
对不同品种多花水仙进行了核型分析，认为两色花水仙（2n = 32）中包含了白花水仙的两套 x = 11
的染色体组和黄花水仙一套 x = 10 的染色体组。本试验中利用黄花水仙基因组 DNA 和白花水仙基
因组 DNA 为探针，分别与两色花水仙根尖染色体杂交，在两色花水仙细胞分裂中期观察到分别有
10 条和 22 条杂交信号的染色体，表明在两色花水仙中，有 10 条来自于黄花水仙，22 条来自于白花
水仙，因此可以认为两色花水仙可能是黄花水仙和白花水仙的天然杂交种，黄花水仙提供了 n 配子，
白花提供的 2n 配子。
多倍体基因组的形成主要起源于 3 种不同的途径，即：体细胞染色体加倍、未减数配子的融合
和多精受精。自然界大多数多倍体是通过未减数（2n）配子的融合而产生的（Thompson & Lumaret，
1992；Ramsey & Schemske，1998）。在减数分裂过程中染色体偶然不减数的现象已在很多植物中观
察到（Tavoletti et al.，1991；de Haan et al.，1992）。通过未减数的 2n 雌配子与 1n 雄配子杂交形成
天然三倍体（李锁平，1992）。所以推测两色花水仙起源可能也是通过白花卵细胞未减数的 2n 配子
与黄花 1n 雄配子杂交而来。

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