全 文 ：园 艺 学 报 2009, 36 (2) : 227 - 232
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 07 - 20; 修回日期 : 2008 - 11 - 17
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30571276) ; 国家 ‘863’计划项目 (2006AA10Z1A8)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: xuyong@nercv1com)
西瓜抗病毒基因 zym 2CH的比较图谱定位
徐向丽 1 , 郭绍贵 2 , 宫国义 2 , 许 勇 23 , 卢向阳 1 , 彭振兴 1 , 张海英 2
(1 湖南农业大学生物科技学院 , 长沙 410128; 2 国家蔬菜工程技术研究中心 , 北京 100097)
摘 要 : 以西瓜抗 ZYMV2CH (小西葫芦黄花叶病毒中国株系 , Zucchini yellow m osaic virus2CH INA ) 野
生种质 P1 I1595203和感病自交系 98R为试材构建 F2群体和 F2: 3群体 , 采用 BSA法筛选与抗病基因 zym 2CH连
锁的分子标记 , 并利用以 F2 S8群体 ( P1 I12963412FR ×97103) 构建的西瓜参考遗传图谱进行 zym 2CH的比较
定位。试验结果表明 : 在参考遗传图谱已经定位的 RAPD和 SSR标记中 , RAPD标记 b1321400与 zym 2CH的
遗传距离为 2516 cM; SSR标记 MCP I214和 MCP I226与 zym 2CH的遗传距离分别为 57 cM和 87 cM , 比较分析发
现这些标记在两个图谱上的分布呈共线性关系。根据 zym 2CH与标记 b1321400、MCP I214和 MCP I226之间的遗传
关系 , 将西瓜抗病毒病基因 zym 2CH初步定位在西瓜参考遗传图谱 3号连锁群 105 cM处。
关键词 : 西瓜 ; zym 2CH; BSA法 ; 共线性 ; 比较定位
中图分类号 : S 651 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2009) 0220227206
Com para tive M app ing of V irus Resistan t Gene zym 2CH in W a term elon
XU Xiang2li1 , GUO Shao2gui2 , GONG Guo2yi2 , XU Yong23 , LU Xiang2yang1 , PENG Zhen2xing1 , and
ZHANG Hai2ying2
(1 College of B ioscience and B iotechnology, Hunan A griculture U niversity, Changsha 410128, Ch ina; 2N ational Engineering Re2
search Cen ter for V egetables, B eijing 100097, China)
Abstract: The watermelon germp lasm P1 I1595203 resistant to ZYMV2CH ( Zucch in i yellow m osa ic virus2
CH INA ) and 98R suscep tible to ZYMV2CH were used as the parents to construct F2 population and F2∶3 popu2
lation. The markers linked to the resistant gene zym 2CH were filtered by BSA strategy. The reference genetic
map constructed basing on the F2 S8 population ( P1 I12963412FR ×97103) was used for comparative mapp ing
of zym 2CH gene. The results showed that b1321400 , MCP I214 and MCP I226 were linked to zym 2CH gene with the
genetic distance of 2516 cM , 57 cM and 87 cM respectively. The resistant gene zym 2CH was located on 105
cM of the linkage group 3 by the collinearity relationship of zym 2CH , b1321400 , MCP I214 and MCP I226 in the two
linkage map s.
Key words: watermelon; the resistant gene for Zucch in i yellow m osa ic virus; bulked segregant analy2
sis; collinearity relationship; comparative mapp ing
西瓜病毒病日渐成为世界性病害 , 严重影响西瓜的产量和品质。目前已鉴定能侵染葫芦科作物的
植物病毒约有 50 多种 , 其中能侵染西瓜的有 10多种 , 西瓜花叶病毒 (W aterm elon m osa ic virus,
WMV )、小 西 葫 芦 黄 花 叶 病 毒 ( Zucch in i yellow m osa ic virus, ZYMV )、番 木 瓜 环 斑 病 毒
( Papaya ring spot virus, PRSV) 是侵染葫芦科作物的主要病毒 (Boyhan et al. , 1992; Kabelka et al. ,
1997)。2004年许勇等首次发现了对西瓜的 3种主要病毒病 ( ZYMV2CH、 PRSV2W、WMV ) 均具有
抗性的西瓜野生种质 P1 I1595203, 并证实 P1 I1595203对 ZYMV2CH的抗性由单隐性基因 zym 2CH控制
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(Xu et al. , 2004)。马少芹等 (2006) 利用 ZYMV2CH抗性 F2分离群体 ( P1 I1595203 ×98R ) 获得一
个与抗 ZYMV 2CH基因紧密连锁的 RAPD标记 AK132644 , 并成功地转化成 SCAR标记。但由于只有一
个单独存在的标记 , 不能确定其在遗传图谱上的相应关系 , 因而无法进行基因精细定位和图位克隆等
研究。比较基因组学策略为单一基因的快速定位和图位克隆提供了可能。徐建飞等 (2007) 利用比
较基因组学将马铃薯抗晚疫病主效基因 R10定位于已克隆的抗晚疫病基因 R3a的近端粒区。作者在
前人的基础上利用 F2和 F2∶3 ZYMV2CH抗性分离群体 ( P1 I1595203 ×98R ) 和国家蔬菜工程技术中心
西瓜课题组已构建的西瓜参考遗传图谱 , 结合集团分离分析法 ( bulked segregant analysis, BSA )
(M ichelmore et al. , 1991) 进一步筛选与 zym 2CH基因连锁的分子标记 , 进行 zym 2CH的比较图谱定
位 , 以期为分子标记辅助育种提供技术指导 , 为 zym 2CH基因的精细定位与克隆奠定基础。
1 材料与方法
111 材料
11111 西瓜 ZYMV2CH抗性分离群体及病原
抗病亲本 P1 I1595203由美国康奈尔大学纽约农业实验站植物病理系的 Provvidenti教授赠送 , 是
利用单株选择法经多代抗病筛选得到的纯合自交系 , 兼抗 ZYMV2CH、 PRSV2W、WMV 病毒 ( Xu
et al. , 2004)。感病亲本 98R是国家蔬菜工程技术研究中心提供的纯合自交系。用 P1 I1595203与
98R配制杂交组合 , 得到的 F2代群体用于连锁标记的筛选验证 ; 通过单粒传 ( single seed descent) 进
一步获得 96个 F2: 3群体 , 每个株系保证 60个单株作为抗病鉴定材料 , 用于 F2代单株的基因型
( genotype) 分析。
病原 ZYMV2CH由康奈尔大学纽约农业实验站 Provvidenti教授 1989年采自国家蔬菜工程技术研究
中心西瓜大棚内 , 并在美国鉴定纯化后提供。
试验于 2006年 4月在国家蔬菜工程技术研究中心温室进行。
11112 西瓜参考遗传图谱的构建
P1 I12963412FR为野生西瓜 [ C itru llus lana tus ( Thunb. ) Mansfeld var1citroides ] 种质 , 由美国
Clem son大学 Rhodes教授赠送 , 是目前国际上惟一高抗枯萎病 3个生理小种的材料 ; 97103为感枯萎
病的普通西瓜 [ C itru llus lana tus ( Thunb1) Mansfeld var1 lana tus ] 自交系 , 由国家蔬菜工程技术中心
提供。以 P1 I12963412FR为父本 , 97103为母本配制杂交组合 , 以单粒传的形式连续自交 , 最终获得
117个 F2 S8株系用于西瓜参考遗传图谱的构建。
112 方法
11211 ZYMV2CH抗性鉴定及 F2代单株抗 (感 ) 病基因型的推测
参考本实验室马少芹等 (2006) 的研究方法 , 进行 ZYMV2CH抗性鉴定及 F2代单株抗 (感 ) 病
基因型的推测。
参照 Murry和 Thomp son (1980) 的方法 , 用 CTAB法提取 DNA。根据 F2代单株抗 (感 ) 病基因
型的推测结果 , 利用 BSA法分别取 5株纯合抗病和 5株纯合感病 F2代单株的 DNA, 等量混合构建抗
病池 ( resistant bulk, RB ) 和感病池 ( suscep tible bluk, SB )。
11212 zym 2CH基因连锁标记的筛选
PCR反应及多态性标记的筛选 : 利用本实验室以西瓜重组自交系 F2 S8群体 ( P1 I12963412FR ×
97103) 构建的分子标记连锁图 , 结合目前筛选的 68个 SSR标记 , 用 JoinMap 310重新构建了一张西
瓜参考遗传图谱 , 该图谱包括 22个连锁群 , 394个标记 , 覆盖基因组长度 834 cM , 标记平均间隔
2112 cM , 从中挑选出 62个 RAPD标记和 66个 SSR标记 , 利用 P1 I1595203、98R和 F1进行多态性标
记的筛选。将获得的多态性标记以 ZYMV2CH抗池和感池进行初步验证 , 然后利用 ZYMV2CH抗性 F2
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2期 徐向丽等 : 西瓜抗病毒基因 zym 2CH的比较图谱定位
分离群体 ( P1 I1595203 ×98R) 对可能连锁的标记做进一步验证。
RAPD分析 : 扩增体系共 1315μL, 包括 10 ×buffer (含 Mg2 + ) 1125μL, dNTP ( 215 mmol·
L - 1 ) 110μL, 引物 (15 ng·μL - 1 ) 210μL, 模板 DNA (30～50 ng·μL - 1 ) 210μL, Taq DNA聚合
酶 (215 U·μL - 1 ) 014μL。
RAPD2PCR反应在 DNA PTC2100 (美国 ) 上进行。反应条件 : 94 ℃预变性 5 m in, 94 ℃变性
30 s, 37 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 1 m in, 35个循环 ; 72 ℃延伸 7 m in, 4 ℃保存。扩增产物在 115 %
琼脂糖凝胶上电泳分离。利用 Kodak EDAS2120凝胶分析仪进行分析 , 确定 DNA片段在胶上的相对位
置和片段大小。
SSR分析 : 扩增体系共 1215μL, 包括 10 ×buffer (含 Mg2 + ) 1125μL, dNTP (215 mmol·L - 1 )
110μL, 引物 ( 15 ng·μL - 1 ) 210μL, 模板 DNA ( 30～50 ng·μL - 1 ) 210μL, Taq DNA聚合酶
(215 U·μL - 1 ) 012μL。扩增条件 : 94 ℃预变性 5 m in, 94 ℃变性 1 m in, 52 ℃退火 1 m in, 72 ℃延
伸 2 m in, 35个循环 ; 72 ℃延伸 5 m in, 4 ℃保存。扩增产物在 6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。
恒定功率为 70 W , 预电泳 30 m in后上样 , 上样量为 5μL。采用银染法进行显色分析。
数据记录与标记命名 : 根据 F3各株系群体的抗感分离情况推测出 F2代单株的抗感基因型。按照
Kosambi函数 ( Kosambi, 1944) 的规定进行命名。推测基因型为 aa (抗病亲本基因型 ) 和 A a的 F2代
单株记作 a; 推测基因型为 AA (感病亲本基因型 ) 的 F2代单株记作 b。F2群体中扩增带型与抗病亲本
表现一致的单株记作 a, 反之记作 b, 模糊不清或丢失的带型记为 ∃ 。RAPD标记的命名采用引物加
上其片段大小 , SSR标记采用引物组号。
遗传连锁分析 : 采用 Kosambi函数计算获得的 RAPD标记、SSR标记、 zym 2CH和 AK132644标记间
的遗传距离 , 分析这些标记与抗病基因的之间的连锁关系 , 绘制 F2群体中 zym 2CH所在区域的遗传连
锁图谱。
zym 2CH在西瓜参考图谱中的比较定位 : 将 F2群体中 zym 2CH所在区域的遗传连锁图谱与已构建
的西瓜参考图谱中对应的连锁群进行比对 , 分析图谱中分子标记间的线性排列关系。通过比较定位将
zym 2CH基因和 AK132644标记定位于西瓜参考图谱上。
2 结果与分析
211 与 zym 2CH 连锁的 RAPD标记 b1321400的获得
用已定位在西瓜参考图谱中的 62个 RAPD标记对 P1 I1595203、98R、 F1和抗感基因池进行扩增
和筛选 , 其中 17个 RAPD引物在亲本之间可扩增出稳定可重复的标记 , 占总 RAPD引物的 2714%。
将以上 17个引物对 96个 F2代单株进行扩增并进行连锁分析 , 发现 RAPD引物 b13扩增出的 1 400 bp
大小的片段与 zym 2CH呈现连锁关系 (图 1)。多态性条带清晰稳定。
统计结果表明 : 在 78个纯合抗病和杂合植株上 63株有带 , 11株无带 , 4株缺失 ; 在 18个纯合
感病植株中 , 5株无带 , 10株有带 , 3株缺失 ; 经 Kosambi函数计算其连锁距离为 2516 cM , 将该标
记定名为 b1321400。
212 zym 2CH 基因附近 SSR锚定标记的获得
选取西瓜参考图谱中 b1321400标记所在的 3号连锁群上的 5个 SSR标记以 P1 I1595203、98R、F1及
抗感池进行多态性筛选 (图 3, A ) , 发现 SSR标记 MCP I214和 MCP I226在抗病亲本和感病亲本间表现
出稳定可重复的多态性。将 MCP I214和 MCP I226在 F2分离群体上扩增 (图 2) , 分别统计两个标记 ( a,
b) 的扩增带型 , 通过 Kosambi函数计算 , 发现 MCP I214和 MCP I226标记与 zym 2CH基因的遗传距离分别
为 57 cM和 87 cM (图 3, B )。
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213 zym 2CH 基因在 F2分离群体上的初步定位
利用筛选获得的标记 b1321400、MCP I214和 MCP I226与马少芹等 (2006) 已报道的与 zym 2CH基因紧
密连锁的 AK132644标记 , 通过 Kosambi函数计算各位点间的遗传连锁关系 , 初步绘制 zym 2CH基因所
在区域的连锁图谱 , 确定这些标记和 zym 2CH基因在该区域的线性排列关系 (图 3, B )。AK132644标
记定位在 zym 2CH基因和 b1321400标记之间 , AK132644标记与 b1321400标记遗传距离为 18 cM。b1321400标
记与 MCP I214标记的遗传距离为 31 cM。
214 zym 2CH 基因在参考图谱上的比较定位
将 zym 2CH基因所在区域的连锁图谱与西瓜参考图谱进行比较分析 , 发现标记 b1321400、MCP I214
和 MCP I226在两张图谱上的排列顺序完全一致 (图 3, A、B )。这一结果表明 , zym 2CH基因所在区域
的连锁图谱与西瓜参考图谱中标记 b1321400、MCP I214和 MCP I226所在的 3号连锁群所在的区域存在共线
性关系。根据这一结果进行比较定位 , 将 zym 2CH基因初步定位在西瓜参考图谱 3号连锁群 105 cM的
位置 , 并将马少芹等 (2006) 报道的与 zym 2CH基因紧密连锁的 AK132644标记初步定位在西瓜参考图
谱 3号连锁群 97 cM处 (图 3, B、C)。
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2期 徐向丽等 : 西瓜抗病毒基因 zym 2CH的比较图谱定位
图 3 西瓜 zym 2CH 基因连锁图谱及其与西瓜参考图谱的比较
A. 西瓜 F2 S8群体 ( P. I. 2963412FR ×97103) 参考图谱 ;
B. 西瓜 F2群体 ( P. I. 296341 ×98R) zym 2CH基因遗传图谱 ;
C. zym 2CH基因在参考图谱上的的比较定位。
F ig. 3 L inkage map of zym 2CH gene and com par ison w ith the wa term elon reference map
A. The watermelon reference map basing on F2 S8 population ( P. I. 2963412FR ×97103) ;
B. L inkage map of zym 2CH gene basing on F2 population ( P. I. 296341 ×98R) ;
C. Comparative mapp ing of zym 2CH gene in the watermelon reference map.
3 讨论
比较作图 ( comparative mapp ing) 的分子基础是利用同种或不同植物种类之间的基因组结构上存
在的同线性 ( synteny) 或共线性 ( collinearity) 和功能上的保守性关系 ( Fulton et al. , 2002) , 找出
相同的 DNA分子标记 , 在相关物种之间进行遗传或物理作图 ( Sankoff & Nadeau, 2000) , 比较这些标
记在不同物种基因组中的分布特点 , 揭示染色体或其片段上的基因及其排列顺序的相同或相似性。比
较基因组学研究可以充分利用已有的研究结果 , 快速增加参考图谱的标记密度 , 进行重要基因的精细
定位 , 而无需为每个重要基因的定位单独构建一张分子遗传图谱 (Lu et al. , 1996; Huang et al. ,
2005)。通过比较作图可以将多个重要基因定位于同一张图谱中 , 便于研究这些基因之间的遗传关
系。这对于利用已有模式植物和近缘植物的研究结果加速遗传背景较薄弱的植物种类在图谱定位与克
隆方面的研究具有重要意义。
马少芹等 (2006) 利用西瓜 ZYMV2CH抗性 F2分离群体 ( P1 I1595203 ×98R ) 筛选获得了一个与
zym 2CH基因连锁的分子标记 AK132644 , 但是作为一个单独存在的分子标记 , 所提供的信息十分有限 ,
无法进行图谱定位与进一步的图位克隆研究。本研究以比较图谱定位方法 , 利用本实验室以西瓜 F2 S8
群体 ( P1 I12963412FR ×97103) 构建的参考遗传图谱 , 将 zym 2CH基因初步定位于西瓜参考图谱 3号
连锁群的 105 cM处。通过比较作图 , 快速实现西瓜 zym 2CH基因的图谱定位 , 初步获得了 zym 2CH基
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因所在连锁群的位置及附近标记分布情况等重要信息。
本研究获得的距离 zym 2CH基因座位最近的锚定标记为 b1321400 , 遗传距离为 2516 cM , 分析标记
b1321400、MCP I214和 MCP I226与 zym 2CH基因的相对位置关系 , 发现这些标记均位于 zym 2CH基因的同一
侧 , 而且由于两张图谱作图亲本的不同 , 这些标记在两张图谱上的遗传距离也有所变化 , 所以仅将
zym 2CH基因初步定位于西瓜参考图谱 3号连锁群的 105 cM处。目前本实验室已经开发了大量西瓜
SSR分子标记 , 将利用这些 SSR标记进一步增加西瓜参考图谱的标记密度 , 筛选位于 zym 2CH基因另
一侧的锚定标记和连锁更为紧密的锚定标记 , 以实现 zym 2CH基因在西瓜参考图谱上的精细定位 , 从
而为西瓜 ZYMV2CH抗性分子标记辅助聚合育种与 zym 2CH基因的图位克隆奠定基础。
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