全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (9) : 1333 - 1338
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 03 - 31; 修回日期 : 2009 - 08 - 11
基金项目 : 中国博士后科学基金项目 (20060400945) ; 江苏省博士后科研计划项目 ( 0602043B ) ; 教育部新世纪优秀人才支持计
划项目 (NCET20620489)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: njteng@ njau1edu1cn)
致谢 : 本研究得到中国科学院植物研究所林金星和母锡金两位研究员的指导和帮助 , 特此致谢 !
甘菊与栽培菊 ‘金陵黄玉 ’种间杂交失败的原因
孙春青 , 陈发棣 , 房伟民 , 刘兆磊 , 侯喜林 , 滕年军 3
(南京农业大学园艺学院 , 南京 210095)
摘 　要 : 二倍体野菊与栽培菊种间杂交常不能结实 , 从而严重影响了野菊优异基因的利用 , 为了揭示
其原因 , 以栽培菊 (D endranthem a grand if lorum ) ‘金陵黄玉 ’为母本 , 二倍体野生菊甘菊 (D. lavandu lifo2
lium ) 为父本 , 开展了种间杂交 , 测定了父本花粉活力 , 研究了授粉后花粉在柱头萌发行为及胚胎发育情
况等。结果发现 , 父本甘菊的花粉活力在授粉时为 1112% , 人工授粉 4 h内未观察到柱头上有花粉萌发 ;
授粉后 8 h时平均每个柱头上只有 715粒花粉萌发 ; 到授粉后 12 h时数量达到最多 , 为 1611粒 ; 随后数量
急剧下降 , 到 24和 48 h时柱头萌发花粉数量分别只有 312粒和 214粒 , 且大部分花粉管生长异常并停留在
柱头表面。此外 , 在授粉 8 d后观察到 1210%子房中含有正常的球形胚 , 但之后就未观察到正常胚胎 , 最
终未获得杂交种子 , 而母本自然开放结实率高达 4213%。以上结果表明 , 受精前、后的生殖障碍 , 即母本
柱头上花粉萌发数量少且萌发异常和受精后胚胎大量败育 , 是引起种间杂交不结实的主要原因。
关键词 : 菊花 ; 人工杂交 ; 结实率 ; 花粉活力 ; 胚胎败育
中图分类号 : S 68211 + 1　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0921333206
Investiga tion on the Factors L ead ing to Infertility in the Cross Between
D endran them a lavandu lifo lium and D. grandif lorum‘J in ling Huangyu’
SUN Chun2qing, CHEN Fa2di, FANG W ei2m in, L IU Zhao2lei, HOU Xi2lin, and TENG N ian2jun3
(College of Horticu lture, N anjing A gricu ltura l U niversity, N an jing 210095, Ch ina)
Abstract: Seeds are seldom obtained in the crosses between chrysanthemum cultivars and dip loid wild
species in D endran them a, which seriously influences utilization of excellent genes from those wild speices. In
the p resent study, with an aim to reveal the factors leading to infertility in the crosses between chrysanthemum
cultivars and wild species, we carried out the interspecific hybridization between D. grand if lorum ‘ J inling
Huangyu’and D. lavandu lifolium , tested pollen viability of male parent, exam ined germ ination behavior of
pollen grains on the stigmas after pollination, and observed embryo development. It was found that pollen
viability of D. lavandu lifolium was 1112% just before pollination, no pollen grains germ inated on the stigmas
during 4 h after pollination and only 715 pollen grains germ inated on each stigma at 8 h after pollination. A t
12 h after pollination, the number reached the highest value, 1611. A t 24 h and 48 h after pollination, the
number was quickly decreased to 312 and 214, respectively. In addition, most pollen grains germ inated
abnormally on the stigmas and many pollen tubes stayed on the stigmaspisurface and failed to enter ovaries. A t
8 d after pollination, normal globular embryos were observed only in 1210% ovaries. Thereafter, only
abnormal embryos were observed in some ovaries, and as a consequence, no seedswere obtained in the cross.
However, seed set of female parent under open pollination conditions was as high as 4213%. These results
suggest that both p re2 and post2fertilization barriers, i. e. only a few germ inated pollen grains on the stigmas
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and abnormal germ ination of most pollen grains before fertilization as well as degeneration of a large number of
embryos after fertilization, may be the main factors resulting in infertility in the cross.
Key words: D endranthem a grandif lorum ; artificial crossing; seed set; pollen viability; embryo abortion
在菊花育种中常采用栽培品种与野菊远缘杂交的方式进行抗性改良。然而已有研究表明 , 在菊花
远缘杂交 , 尤其是低染色体倍性野菊与栽培菊种间杂交中 , 经常遇到结实率低 , 甚至不能获得杂交种
子的问题 , 致使优异基因难以导入栽培品种中以实现其抗性改良 (南汝斌和孙自然 , 1991; 戴思兰
和陈俊愉 , 1996; 唐岱 , 2000; 李辛雷 等 , 2008)。引起被子植物种间杂交失败的原因一般包括 :
(1) 父本花粉活力低或母本雌蕊发育异常 ; ( 2) 父本花粉在母本柱头不能萌发或花粉管生长异常 ;
(3) 花粉管不能穿过花柱将精子带到胚囊完成双受精 ; (4) 受精后幼胚或胚乳发育异常引起胚胎败
育 ( van Tuyl et al. , 1991; 孟金陵 , 1997; W ilcock & Neiland, 2002; 胡适宜 , 2005; Datson et al. ,
2006)。迄今 , 在菊属植物种间杂交中 , 不同组合杂交效果差异很大 , 只有一小部分组合结实率较
高 , 而大部分组合杂交效果很不理想。虽有一些研究认为父本花粉管在母本柱头生长情况可能对杂交
结实率有一定的影响 , 但引起远缘杂交失败或结实率低的具体因素还是不很清楚。
本研究中以二倍体野生菊甘菊为父本 , 以作者近年选育的栽培菊 ‘金陵黄玉 ’为母本 , 开展种
间杂交、传粉及胚胎发育等细胞与生殖生物学研究 , 旨在阐明其杂交失败的原因 , 为今后采取有效措
施将低倍性野生菊中各种优良抗性基因向栽培菊中转移 , 实现菊花品种抗性改良提供理论指导。
1　材料与方法
111　供试材料及父本花粉生活力测定
以栽培菊 (D end ran them a grand if lorum ) ‘金陵黄玉 ’ (2n = 6x = 54) 为母本 , 野生菊甘菊 (D.
lavandu lifolium ) (2n = 2x = 18) 为父本杂交 , 均保存在南京农业大学 “中国菊花种质资源保存中心 ”。
于晴天 10: 00—14: 00每隔 2 h采集父本花粉 , 花粉萌发培养基配方为 ME3 + 200 g·L - 1
PEG4000, 在 20 ℃条件下培养 (赵宏波 等 , 2005)。每隔 1 h在显微镜下检测花粉萌发情况 , 以花粉
管长度大于花粉直径视为花粉萌发 , 随机观察 10个视野进行记录 , 重复 3次。
112　人工杂交
2007年 10月上旬 , 以生长健壮的母本植株为材料 , 选取发育良好的花蕾 , 在舌状花刚露色时去
雄 , 用硫酸纸折成的透明纸袋进行严格套袋。去雄后 3～5 d, 母本柱头开始伸出并呈 “Y”形 , 柱头
表面可见大量黏液 , 此时为最佳授粉时间。收集已套袋的父本新鲜花粉 , 用毛笔将花粉轻轻地均匀地涂
抹在母本柱头 , 立刻套袋。当花梗开始变黄枯萎时采集授粉花序 , 晾干后进行脱粒和统计结实率。此
外 , 将 40朵已去雄的花序在开放条件下自然授粉 , 统计其结实率以了解人工授粉前母本雌蕊发育状况。
113　授粉后花粉萌发情况观察
在人工授粉后 015、1、2、4、8、12、24和 48 h时各取 3个花序 (20～30雌蕊 /花序 ) , 用 FAA
进行固定 , 保存在 4 ℃冰箱中备用。室温下将样品用去离子水清洗 3次 , 浸于 1 mol·L - 1 NaOH溶液
中软化 8 h左右 , 然后用离子水清洗 3次 , 置于载玻片上 , 滴上数滴 0101%苯胺蓝溶液 ( 011 mol·
L - 1 K3 PO4 + 18%甘油 ) 后盖上盖玻片并轻轻挤压。大约 5 m in后在荧光显微镜 ( Zeiss Axioskop 40)
下观察 , 记录每个雌蕊柱头上的花粉粒数 , 每个采样时期观察 30个左右雌蕊 ( Teng et al. , 2006)。
由于样品经历了多次清洗 , 没有萌发仅是附着在柱头的花粉将被洗掉 , 因此最终在柱头上观察到的花
粉可视为萌发的花粉 , 有的花粉看不到花粉管是因为实验技术本身所致 (王钦丽 等 , 2002)。
114　授粉后胚胎发育研究
在人工授粉后 6、8、10、12、15、18和 22 d时各取 10个花序用 FAA固定 , 保存在 4 ℃冰箱中
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备用。常规石蜡制片 , 切片厚度 8～10μm, 铁矾苏木精染色 , 在 O lympus显微镜下观察并拍照。
2　结果与分析
211　杂交结实率与父本花粉活力
二倍体野生菊甘菊与栽培菊花 ‘金陵黄玉 ’杂交结实率为 0, 而母本在人工去雄后开放结实率却
高达 4213% (共收取花序 40个 , 得到种子 406粒 )。培养基上花粉活力测定结果表明 , 父本甘菊的
花粉活力为 1112% , 并且在 10: 00—14: 00不同时间取的花粉的活力没有显著差异 (图 1)。从母本
开放结实率来看 , 大部分雌蕊在授粉前发育正常 , 对结实率没有太大影响。
212　花粉在柱头萌发情况
观察和统计授粉后不同时间每个柱头上的萌发花粉数量 (图 2) 和花粉萌发情况 (图版 Ⅰ) , 发
现在人工授粉 4 h内在母本雌蕊柱头上没有萌发的花粉 ; 在授粉后 8 h时 , 平均每个柱头上有 715粒
花粉萌发 ; 到授粉后 12 h时萌发的花粉量达到最多 , 为 1611粒 , 随后柱头上萌发的花粉数量急剧下
降 , 到授粉后 24和 48 h时平均每柱头上萌发的花粉分别只有 312和 214粒 , 并且大部分花粉管由于
出现了弯曲、倒长等生长异常现象 , 而最终停留在柱头表面 , 难以进入子房完成受精 (图版 Ⅰ, 4)。
因此 , 花粉在柱头萌发异常且数量少可能是引起杂交失败的一个重要原因。
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213　授粉后胚胎发育
通过大量子房组织切片的观察 , 统计了授粉后胚胎发育情况 (表 1) , 发现在授粉后 8 d时 , 大
部分胚囊内没有胚胎 , 即未完成受精作用 , 只在 1210%的子房内形成了正常的球形胚 (图版 Ⅱ, 1、
2) ; 到授粉后 10 d时 , 只在 917%的子房内观察到胚胎 , 此时胚体体积有所增大但不能形成子叶原基
(不能形成心形胚 ) (图版 Ⅱ, 3、4) ; 到授粉后 12 d, 在子房内未观察到正常胚胎 , 只是在 816%的
子房内观察到了胚体已退化为一群散乱的细胞核已降解的细胞团 (图版 Ⅱ, 5) ; 到授粉后 15 d时 ,
仅在 1111%的子房内观察到胚体降解的痕迹 (图版 Ⅱ, 6) , 可判断此时胚体已全部降解。
表 1　‘金陵黄玉’ ×甘菊授粉后胚胎发育情况
Table 1　Em bryogenesis after pollina tion in D. grandiflorum‘J in ling Huangyu’×D. lavandu lifolium
授粉后天数 / d
Day after pollination
观察子房总数
Number of ovary
正常胚体
Normal embryo
胚体败育
Embryo abortion
胚体败育比例 /%
Percentage of embryo abortion
8 108 13 0 0
10 113 0 11 917
12 105 0 9 816
15 117 0 13 1111
图版Ⅱ说明 : 1、2. 授粉后 8 d形成的球形胚 ; 3、4. 授粉后 10 d, 少数胚体继续分裂 , 但不能形成子叶原基 ; 5. 授粉后 12 d, 胚体
开始降解 (箭头所示 ) ; 6. 授粉后 15 d, 胚体已降解 (箭头所示 )。
Explana tion of pla teⅡ: 1, 2. Globular embryo at 8 d after pollination; 3, 4. A t 10 d after pollination, a few embryos continued to grow, but
failed to initiate cotyledons; 5. A t 12 d after pollination, embryos were degenerating ( arrow showing) ; 6. A t 15 d after pollination, embryos
had been degenerated ( arrow showing) .
3　讨论
授粉前母本雌蕊或胚珠发育情况与结实率关系极为密切 , 较高比例的雌蕊或胚珠败育往往会导致
较低的结实率 (W iens et al. , 1987)。例如在羊草 (L eym us ch inensis) 和日本木瓜 ( Chaenom eles ja2
pon ica) 中 , 较低的结实率主要是由于在授粉前大量雌蕊发育异常所致 ( Kaufmane & Rumpunen,
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2002; Teng et al. , 2006)。在本研究中 , ‘金陵黄玉 ’与二倍体甘菊杂交结实率为 0, 但母本 ‘金陵
黄玉 ’的自然开放结实率却高达 4213% , 对菊花而言 , 该结实率已非常高。因此推断授粉前母本雌
蕊发育状况基本正常 , 不是引起野菊与栽培菊种间杂交失败的因素。
传粉过程始于花药开裂和成熟花粉的散出 , 花粉必须在具有活力时到达适宜的接受柱头 , 并且花
粉与柱头、花粉管与花柱之间能够正常识别才能保证受精过程的顺利进行。任何一个部位不能正常识
别从而导致花粉在柱头上的萌发异常都会降低受精成功率而影响结实率 (徐恒平和曾宗巽 , 1995;
W ilcock & Neiland, 2002; 胡适宜 , 2005)。本研究发现 , 父本甘菊的花粉活力为 1112% , 如果花粉
能够在柱头上正常萌发 , 就能够满足受精的需要。理论上只要有一条花粉管进入柱头 , 将精子送入胚
囊中使其与卵核和极核结合 , 就能达到双受精的目的 (胡适宜 , 2005)。但研究中发现 , 授粉后 8 h
时柱头上仅有几粒花粉萌发 , 到 12 h时虽然萌发花粉数量达到最大 , 但也只有十几粒 , 并且大部分
花粉管出现了弯曲、倒长等异常现象而停留在柱头表面。由此可推断 , 花粉与雌蕊柱头相互识别作用
过程中雌蕊柱头上可能存在抑制因子 , 阻碍了花粉的正常萌发而引起较少的花粉能够在柱头萌发
(W atanabe, 1977; van Tuyl et al. , 1991)。因此 , 柱头上花粉萌发数量少且萌发异常大大增加了受精
失败的概率 , 可能是引起二倍体甘菊与 ‘金陵黄玉 ’种间杂交不结实的一个重要因素。
受精后胚胎在发育过程中异常降解或败育也是引起结实率低的一个重要因素 (Lester & Kang,
1998; W ilcock & Neiland, 2002; 胡适宜 , 2005; Datson et al. , 2006)。例如 , Datson等 (2006) 在
进行 N em esia strum osa与 N. fru ticans种间杂交时 , 虽然观察到了父本大量花粉管进入母本子房和胚
珠 , 但由于授粉后子房并没有膨大 , 而最终没有获得杂交种子 , 由此认为该杂交组合中不存在受精前
障碍 (p re2fertilization barriers) , 但存在受精后障碍 (post2fertilization barriers) , 即可能是受精后胚乳
降解和胚胎败育而导致杂交失败。在本研究中 , 通过大量组织切片 , 发现只是在授粉后初期能观察到
一定比例的正常球形胚 , 但之后并未观察到正常胚胎 , 由此可以推断在种间杂交中有一定的胚珠成功
地进行了受精并形成合子 , 合子在胚胎发育早期即球形胚之前都基本能正常分裂 , 只是到了球形胚后
期由于某些未知因素而导致胚胎败育。关于胚胎在发育过程中败育的原因还并不清楚 , 可能是合子与
胚乳细胞在分裂过程中不协调所致 , 也可能是胚乳未能提供足够的营养供胚胎发育所需等 (Buitendi2
jk et al. , 1995; Lester & Kang, 1998; Sebuliba et al. , 2006)。因此 , 引起二倍体甘菊与 ‘金陵黄
玉 ’种间杂交不结实的另外一个重要因素是受精后障碍 , 即杂种不活 ( hybrid inviability) (孟金陵 ,
1997)。
总之 , 本文通过对二倍体甘菊与 ‘金陵黄玉 ’种间杂交、传粉前父本花粉活力和母本雌蕊发育
状况、花粉在柱头萌发情况及授粉后胚胎发育等深入系统的研究 , 发现引起甘菊与栽培菊种间杂交失
败的主要原因是 : 种间杂交过程中存在受精前障碍和受精后障碍 , 即母本柱头上花粉萌发数量少且萌
发异常和受精后胚胎大量败育。本研究结果也表明如能采取有效措施 , 如采用多次授粉、柱头切割后
授粉及幼胚拯救等方法 , 很有可能获得二倍体野菊与栽培菊的杂交后代。但引起二倍体野菊与栽培菊
种间杂交生殖障碍的机理还不清楚 , 因此 , 今后有必要从分子生物学、蛋白质组学等方面开展相关研
究。
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