全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (8) : 1197 - 1202
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 02 - 19; 修回日期 : 2009 - 05 - 21
基金项目 : 国家社会公益研究专项项目 (2005D IB022) ; 湖北省自然科学基金项目 (2004ABA142) ; 林木、花卉遗传育种教育部
重点实验室开放基金项目 (200605212)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: m ingjunmail@yahoo1com1cn)
蜡梅天然群体遗传多样性的 SRAP标记分析
左丹丹 , 赵海涛 , 刘　春 , 穆　鼎 , 王晓武 , 明　军 3
(中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081)
摘 　要 : 在蜡梅 [ Chim onanthus praecox (L. ) L ink ] 分布区内选取 5个天然群体 , 采用筛选出的 7对
SRAP ( sequence2related amp lified polymorphism) 引物进行遗传多样性分析。结果显示 : 多态性条带百分率
为 2314% , 多态位点比率 ( PPL ) 为 83141% , Neipis基因多样性指数 ( h) 为 0121～0125 (均值为 0122) ,
Shannonpis信息指数 ( I) 为 0134, 群体分化系数 (Gst) 为 0117, 群体间总的基因流的估算值 Nm 为 2140。
AMOVA分析显示群体内方差分量的贡献率占 79189% , 而群体间方差分量的贡献率占 20111% , 区域间占
32139% , 区域内为 67161%。Neipis (72) 群体遗传距离的 UPGMA聚类分析显示群体间的遗传距离与群体
的地理距离关系一致 , Mantel分析相关系数为 0189。基于试验分析结果 , 蜡梅种质资源保护和利用策略为
在优先保护现有群体的基础上 , 加强筛选和保存群体内的变异样本。
关键词 : 蜡梅 ; 天然群体 ; 遗传多样性 ; SRAP标记
中图分类号 : S 685117　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0821197206
Genetic D iversity in Na tura l Popula tion s of C h im onan thus praecox ( L . )
L ink Revea led by SRAP M arkers
ZUO Dan2dan, ZHAO Hai2tao, L IU Chun, MU D ing, WANG Xiao2wu, and M ING Jun3
( Institu te of V egetables and Flow ers, Chinese A cadem y of A gricultura l Sciences, B eijing 100081, Ch ina)
Abstract: The genetic diversity and genetic structure of natural populations of Chim onanthus praecox
(L. ) L ink, were analyzed using Sequence2related Amp lified Polymorphism ( SRAP) markers. One hundred
and fifty accessions from 5 natural populations were used in this study. Seven SRAP p rimer combinations
revealed 170 legible bands of which 41 were polymorphic markers. The average p roportion of polymorphic loci
PPL was 83141%. Gene diversity ( h) was from 0121 to 0125 ( average 0122) , Shannonpis Information index
( I) was 0134, coefficient of genetic differentiation ( Gst) was 0117 and the mean of gene flow estimated
(Nm ) was 2140. The results of AMOVA indicated that the variance componentswithin populations and among
populations contributing to total genetic variance were 79189% and 20111% , among regions was 32139%
and within regions were 67161%. There was obvious genetic differentiation among populations and among
regions. UPGMA cluster analysis based on Neipis genetic distance indicated that the genetic distances were
closely related to corresponding geographic distances among populations, 22wayMantel testMatrix correlation r
was 0189. Conservation and utilization strategies for the species should be therefore emphasized on conserving
as many as possible the existing populations, and selecting genetic diversity within populations considering the
current conditions of severe population fragmentation and losses.
Key words: Chim onanthus praecox (L. ) L ink; natural population; genetic diversity; sequence2related
amp lified polymorphism ( SRAP)
园 　　艺 　　学 　　报 36卷
蜡梅 [ Chim onanthus praecox (L. ) L ink ] 属蜡梅科蜡梅属 , 是第三纪孑遗植物 , 中国特有的落叶
灌木 , 自然分布区大致为长江流域中下游地区 , 四川东部以东 , 湖南吉首以北 , 河南伏牛山以南 , 东
到江苏、浙江 , 现有天然群落仅存在于川东、重庆东北部、湘西北、鄂西北 (李烨和李秉滔 ,
2000)。经大范围野外调查发现 , 湖南吉首矮塞乡以及湖北保康、四川万源等地尚保留部分相对完好
的蜡梅天然群落 (左丹丹 , 2007)。蜡梅是世界上珍稀的冬季开花冷香型园林绿化植物 , 切花自然瓶
插寿命可超过 3周 , 自然变异丰富 , 现代园林中应用的大多数品种均直接来源于自然变异 (明军和
明刘斌 , 2004)。鉴于该种类的重要性以及资源状况 , 急需对其野生资源进行收集、整理和评价研
究 , 制定资源收集、保护、保存及利用策略。
相关系列扩增多态性 ( sequence2related amp lified polymorphism, SRAP) 又称基于序列扩增多态性
( sequence2based amp lified polymophism, SBAP) , 是一种基于不同物种甚至个体的内含子、启动子与间
隔区长度不等而产生多态性的特异扩增标记方法 (L i & Quiros, 2001; Ruiz et al. , 2005)。该标记具
有简便、稳定、产率中等、易测序、便于克隆目标片段的特点 , 已被应用于遗传多样性分析、比较基
因组学、遗传图谱构建、重要性状标记、基因克隆以及种质资源的鉴定评价 (Budak et al. , 2004;
Ferriol et al. , 2004)。国内外未见采用 DNA分子标记方法研究蜡梅群体结构和遗传多样性的相关报
道。作者采用 SRAP标记对所收集到的 5个保存相对完好的蜡梅天然群体进行遗传多样性分析 , 拟从
分子水平上揭示蜡梅现有群体的遗传多样性 , 为其种质资源的收集、保存和品种选育提供参考。
1　材料与方法
111　试验材料
2006—2007年 , 在湖南、湖北和四川蜡梅分布区内选取 3组 , 共计 5个天然群体 : 第 1组群体包
括湖北保康学生沟群体 (HBX) , 在水源保护区隔离状态良好 ; 湖北保康茨滩沟保护区群体 (HBC) ,
为我国文献报道最早的天然群体 , 已建立保护区。第 2组群体包括湖南吉首矮寨乡 1 (HNA1) 群体
和湖南吉首矮塞乡 2 (HNA2) 群体 , 为海拔高度差异群体。第 3组群体是四川万源青龙沟 ( SWQ )
群体 , 保存状态良好 (表 1)。每个群体分别选取 30个相互间隔不低于 5倍树高的单株 , 分别采集幼
叶 , 冻干备用。
表 1　蜡梅采样群体的地理位置
Table 1　Sam ple size, geograph ic loca tion, tem pera ture and ra infa ll of the sam pled popula tion s
群体
Population
样本数
Number
of samp le
经度 /E
Longitude
纬度 /N
Latitude
海拔 /m
A ltitude
年均温 /℃
Mean annual
temperature
年均降水量 /mm
Mean annual
rainfall
湖北保康茨滩沟 (HBC) Hubei Baokang Citangou 30 111°04′ 31°57′ 534 1618 1 132
湖北保康学生沟 (HBX) Hubei Baokang Xueshenggou 30 111°15′ 31°52′ 349 1610 823
湖南吉首矮塞乡 1 (HNA1) Hunan J ishou A isaixiang 1 30 109°34′4116″28°20′4615" 400 1610 1 200～1 600
湖南吉首矮塞乡 2 (HNA2) Hunan J ishou A isaixiang 2 30 109°34′3210″28°20′4517" 624 1610 1 200～1 600
四川万源青龙沟 ( SWQ) Sichuan W anyuan Q inglonggou 30 108°03′ 32°05′ 840 1818 1 093
112　SRAP2PCR扩增
DNA提取采用 CTAB方法 , 试验选用了 8个正向引物和 7个反向引物 (表 2)。PCR反应体系 :
DNA 60 ng, 10 ×Buffer (Mg2 + ) 2μL, dNTPs 4 mmol, 正向引物与反向引物各 5 pmol, Taq酶 1 U , 总
体积 20μL, 不足部分用无菌水补足。 PCR扩增在 MJ2PTC2100上进行 , 反应程序和引物参照 L i &
Quiros (2001) , 扩增产物采用 6%的变性聚丙烯酰胺凝胶银染检测。室内试验分析在中国农业科学院
蔬菜花卉研究所的农业部园艺作物遗传改良重点开放实验室完成。
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　8期 左丹丹等 : 蜡梅天然群体遗传多样性的 SRAP标记分析 　
表 2　本试验所用的引物序列
Table 2　The sequences of pr im ers used in the exper im en t
正向引物 Forward p rimer 序列 (5′—3′) Sequence 反向引物 Reversed p rimer 序列 (5′—3′) Sequence
me1 TGAGTCCAAACCGGATA em1 GACTGCGTACGAATTGAC
me2 TGAGTCCAAACCGGAGC em2 GACTGCGTACGAATTGCA
me3 TGAGTCCAAACCGGAAT em3 GACTGCGTACGAATTCAA
me4 TGAGTCCAAACCGGACC em4 GACTGCGTACGAATTCTG
me5 TGAGTCCAAACCGGAAG em5 GACTGCGTACGAATTCGA
me6 TGAGTCCAAACCGGTAA em6 GACTGCGTACGAATTCAG
me7 TGAGTCCAAACCGGTCC em7 GACTGCGTACGAATTCCA
me8 TGAGTCCAAACCGGTGC
113　数据分析
每个样品的扩增电泳谱带按有 (1) 和无 (0) 记录 , 构成原始数据矩阵 , 不同胶板以 DNA电泳
分子量标准、特征带和公共带对应 , 找到相应大小的对应条带。用 POPGENE version 1132和 NT2
SYSpc211 t (Rohlf, 2000) 等软件计算 : 多态带数 N P、多态位点百分率 PPL ; 等位基因平均数 N a、有
效等位基因数 N e; Neipis基因多样性指数 h ( gene diversity) ; Shannonpis信息指数 I; Neipis (72) 的遗传
距离 D、遗传一致度 , 并进行 UPGMA (非加权算术平均聚类 ) 分析。应用 Nei基因多度法计算遗传
分化系数 Gst, Gst =D st /HT , 其中 HT = HS +D st, HT为总遗传多样性 , HS为群体内的遗传多样性 , D st
为群体间遗传多样性 (Nei, 1973) ; 计算反映基因流强度的群体每代迁移数 (Nm ) , Nm = 015 ( 1 -
Gst) /Gst。利用 AMOVA (Analysis of molecular variance) version 1155 ( Excoffler et al. , 1992) 软件对
SRAP的 PCR扩增的 0 /1数据进行分子方差分析 , 统计群体间和群体内的方差、方差分量及贡献率 ,
依此量化评价基因多样性在群体间和群体内的差异和贡献。
2　结果与分析
211　SRAP2PCR引物的筛选与扩增结果
从 56对引物组合中筛选出 7对扩增条带清晰、重复性好且稳定多态的引物组合用于本分析 , 共
得到 170条带 , 其中 41条为多态性条带 , 平均多态性条带为 23140% (表 3)。
表 3　7对 SRAP引物组合扩增条带的统计
Table 3　Sta tistics of am plif ied bands using the seven SRAP pr im er com b ina tion s for 5 popula tion s of C1 praecox
序号
No.
引物组合
Primer combination
条带数
Total number of bands
多态性条带数
Polymorphic bands
多态性条带百分率 /%
Proportion of polymorphic bands
1 em7 /me5 20 6 30100
2 em5 /me6 24 8 33133
3 em7 /me3 30 10 33133
4 em7 /me8 26 4 15138
5 em1 /me2 18 2 11111
6 em5 /me8 23 3 13104
7 em7 /me1 29 8 27159
平均 Mean 2413 519 23140
212　群体内遗传多样性
蜡梅 5个群体的总遗传多样性 ( HT ) 均值 , 群体内遗传多样性 ( HS ) 和群体间遗传多样性
(D st) 分别为 012597, 012149 和 010448。遗传分化系数 Gst均值为 011725, 表明总遗传变异的
17125%存在于群体间 , 82175%存在于群体内 ; 群体间总的基因流的估算值 Nm 为 213982 (表 4)。
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园 　　艺 　　学 　　报 36卷
表 4　群体的遗传多样性水平
Table 4　Sta tistics ana lysis of genetic var ia tion for 5 na tura l popula tion s of C1praecox ba sed on SRAP markers
群体
Population
多态性条带数
N P
多态位点比率 /%
PPL
观测等位基因
N a
有效等位基因
N e
基因多样性
h
信息指数
I
HBX 31 75161 117561 113484 012104 013275
HBC 40 97156 119756 114014 012532 013996
HNA1 36 87180 013313 013200 011656 012260
HNA2 29 70173 118780 113451 012187 013478
SWQ 35 85137 118537 113894 012424 013785
平均 Mean 34120 83141 115589 111609 012181 013359
213　群体遗传变异的 AMO VA分析
群体遗传变异的 AMOVA分析 (表 5) 表明 : 群体间和群体内差异均极显著 ( P < 01001)。群体
的遗传多样性主要分布在群体内 , 群体内方差分量的贡献率占 79189% , 而群体间方差分量的贡献率
占 20111% , 区域间分量占 32139% , 蜡梅群体的 Фst值为 01201, 与表型差异相似 (左丹丹 , 2007。)
表 5　群体遗传变异的 AMO VA分析
Table 5　Ana lysis of m olecular var iance ( AMO VA) for 5 popula tion s of C1praecox detected by SRAP da ta
变异来源
Source of variance
自由度
df
平方和
SS
均方差
M SE
方差分量
Variance component
方差分量百分率 /%
Total variation
PH Ist系数
Фst
显著性检测
P2value
群体间 Among populations 4 18112413 451310 113690 201113 3 01201 < 01001
群体内 W ithin population 145 78814139 51632 514373 791893 3
区域间 Among regions 2 12217080 611354 214563 321393 3
区域内 W ithin regions 147 79715808 51426 511264 671613 3
　　注 : 3 3 01001显著水平。
Note : 3 3 01001 significance level.
214　群体间的聚类分析
基于蜡梅样本间的遗传距离 Neipis ( 72) 进行 UPGMA聚类分析 , 可进一步直观分析群体间遗传
关系 , 5个群体的聚类图见图 1。Neipis (72) 群体间遗传距离与群体的地理距离关系一致 , Mantel分
析相关系数为 0189。
图 1　基于 7对 SRAP引物数据的 5个群体间 Neipis遗传距离的 UPGM A聚类图
F ig11　D endrogram of UPGM A cluster ana lysis ba sed on Neipis genetic d istances of
SRAP da ta genera ted by the 7 pr im er com b ina tion s
3　讨论
国内外有关蜡梅属研究多集中于园艺品种选育和系统演化方面 (明军和明刘斌 , 2004) , 未检索
0021
　8期 左丹丹等 : 蜡梅天然群体遗传多样性的 SRAP标记分析 　
到蜡梅及其相近属群体遗传多样性分子标记方面研究报道 , 因此缺乏可以直接比较的相关研究结论。
311　蜡梅群体遗传多样性和群体分化水平
本试验显示 : 蜡梅总遗传多样性 (HT ) 为 012597, 与 AFLP标记的蒙古栎的 01246 (李文英 等 ,
2003) 相当 , 低于 AFLP标记的紫丁香的 013522 (明军和顾万春 , 2006) , 在木本植物中属偏低水
平 , 与广布种的水平符合 (葛颂 , 1994)。
蜡梅群体 Фst值为 01201, 遗传分化系数 Gst为 011725, 与 Nybom (2004) 统计的 RAPD标记的
长命多年生植物、分布方式为广泛分布、交配系统为异交、种子传播方式为动物摄食类型的 Фst和
Gst值 (Фst = 0125, Gst = 0119) 相近。
312　蜡梅群体遗传结构和地理分布
AMOVA分析表明群体遗传多样性主要分布在群体内 , 而区域间方差分量高于群体间方差分量 ,
区域间群体的缺失可能是造成区域间差异加大的因素之一 , 表型分析也显示 , 区域间形态差异显著
(左丹丹 , 2007)。
Ham rick等 (1995) 认为基因流 Nm 大于 1, 就足以抵制遗传漂变的作用 , 也同时防止了群体分
化的发生。本试验结果显示群体间基因流的估算值 Nm 为 213982, 表明遗传漂变未成为群体遗传结构
的主导因素之一。
蜡梅群体的较高水平的基因流与其传粉方式有关 , 蜡梅具有强烈的香味 , 为典型的虫媒传粉植
物 , 同时 , 历史上广泛的分布使该物种基因交流具有较大的可能性 , 从而在一定程度上阻止了群体分
化。周莉花等 (2006) 研究认为蜡梅繁育系统属于兼性异交型 , 同朵花内的雌雄蕊在时间和空间上
都有花期不遇的趋势 , 栽培条件开放状态下的结实率为 9185% , 其中异花授粉 54133%、自花授粉
17128%。试验群落均为密度较大的群体 , 连续两年观测其结实和种子圃地萌发良好 , 显示其传粉和
种子散布正常 , 也在一定程度上反映现有群落片段化的发生历史较短 , 在遗传上的漂变和隔离还没有
改变其种群繁育结构和能力。群体遗传距离聚类关系显示与群体的空间距离关系基本一致。而在有文
献记载的鄂西南分布区未找到天然植株 , 出现一个缺省区域 , 可能与该地区曾经为古湖泊 , 现有植被
形成时期较晚以及长江阻隔有关。由此推断 , 试验群体的区域间应有天然群体遭到破坏而缺失。
313　蜡梅种质资源保护和利用
蜡梅为虫媒传粉 , 但是开花期的冬季低温、降雨雪等影响可能造成昆虫少 , 活动范围有限 , 自交
几率增加 , 从而影响其群体间的基因交流 , 即影响其更新与传播。由于蜡梅具有沿沟谷生长的特殊生
境 , 分布上存在断性 , 因此使群体在空间上相对隔离 , 形成 “岛式 ”分布 , 在个体、种子、花粉等
迁移能力不变的情况下 , 基因流将降低 , 隔离距离越大 , 群体间的基因流减小 , 从而导致群体间遗传
分化增大。
上述分析结果表明蜡梅的遗传多样性真实存在 , 并且群体内和区域内变异分量大于群体间变异分
量 (表 5)。由此信息 , 可以指导我们在蜡梅种质资源的保护和利用时宜采取以下措施 : 在目前分布
残缺 , 群体严重丢失的情况下 , 群体保护应首先给予重视。即在全分布区内 , 保护现有全部群体。异
地保存需要在保存尽量多群体数量的同时 , 各群体内需要保存较多的个体样本数量。在蜡梅的遗传改
良和变异筛选工作中 , 在原有居群数量的基础上 , 适当增加居群内的家系筛选 , 即在群体内进行优良
变异单株的选择。
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征文通知
　　　第八届国际梅花蜡梅学术研讨会征文　　　
由中国花卉协会梅花蜡梅分会和上海市绿化管理局主办的第八届国际梅花蜡梅学术研讨会将于 2010年 2月在上
海与第十二届全国梅花蜡梅展览会同期召开。本届研讨会首次成立了由 15位国内外梅花、蜡梅和园艺专家组成的学
术委员会 , 负责论文的征集、审定和研讨会的议程。以梅花、蜡梅为主要研究对象 , 在种质资源、遗传育种、生物技
术、繁殖栽培、应用、产业化、花卉文化等各个方面 , 未在国内外公开发表过的研究论文、研究报告、文献综述和问
题讨论均在征稿之列。投稿请按照 《北京林业大学学报 》论文格式撰写 , 于 2009年 11月 15日之前发送至 liuql@
cau1edu1cn。通过审定的论文将在北京林业大学学报 2009年增刊 (中国期刊网收录 ) 上于会前正式发表。 (刘青林 )
2021