全 文 ：园 艺 学 报 ， （ ）： – 2011 38 7 1365 1370 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2010–08–27；修回日期：2011–05–30
基金项目：浙江省自然科学基金项目（Y3080184）；杭州市科技创新项目（20070232H07，20091133B07）
发根农杆菌K599 对菊花活体转化及其高效再生
向太和*，王 琳，蒋 欢，田璟鸾
（杭州师范大学生命与环境科学学院，杭州 310036）
摘 要：发根农杆菌 K599 侵染菊花无菌苗刻伤的叶片形成转基因不定根，生根频率为 88.0%；不定
根经过诱导培养形成愈伤组织，并再生完整植株，愈伤组织诱导率和分化率分别为 75.0%和 63.3%。诱导
的不定根和再生植株经过 PCR 鉴定含有 K599 Ri 质粒中的 rolC 基因，qRT-PCR 检测显示 rolC 基因在再
生转基因植株中实现了正常表达。再生植株表现出矮缩、多毛状根特征，并能正常开花。建立的利用活
体材料直接作为发根农杆菌 K599 侵染的受体诱导不定根的遗传转化体系，能克服假阳性不定根的出现；
同时，利用不定根繁殖过程中顶端生长点区域无菌的特点，通过截取不定根顶端靠近生长点区域进行继
代培养，结合使用头孢霉素杀菌，能达到有效抑制和杀灭农杆菌的目的，在随后的不定根诱导愈伤及分
化过程中无须再使用抗生素杀菌，提高了转基因再生效率，为菊花的矮化育种和目标基因的转移提供了
良好的试验体系。
关键词：菊花；发根农杆菌；不定根；诱导；再生
中图分类号：S 682.1+1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）07-1365-06

Hairy Roots Induced by Agrobacterium rhizogenes K599 in Chrysanthemum
in Vivo and Plant Regeneration from Hairy Roots
XIANG Tai-he*，WANG Lin，JIANG Huan，and TIAN Jing-luan
（College of Life and Environment Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China）
Abstract：The transgenic hairy roots were formed on cut leaves of chrysanthemum plantlet by
Agrobacterium rhizogenes K599 with frequencies of 88.0%. The calli were induced from hairy roots and
plantlets were regenerated from calli at rates of 75.0% and 63.3% respectively. The transgenic hairy roots
and plantlet were confirmed by PCR analysis with primers from K599 Ri plasmid rolC gene. Quantitative
RT-PCR（qRT-PCR）analysis showed that rolC gene was normally expressed in the regenerated transgenic
plants. Regenerated plants harbored a character of dwarf，more hairy roots and flowering normally.
Organism in vivo directly as a receptor for infection by Agrobacterium rhizogenes K599，it overcame the
emergence of false-positive transgenic hairy roots. In addition，using the process of hairy roots propagation
characteristics of the top growing point region sterile and the interception of adventitious roots near the
growing point to the top for subculture，combined with cefotaxime sterilization，it can inhibit and kill the
Agrobacterium effectively. In the subsequent callus induction and redifferentiation from hairy roots，it is no
antibiotics added to medium for killing Agrobacterium. It genetically enhanced efficiency of plant regeneration.

* E-mail：xthcn@163.com；Tel：0571-28865327
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The transgenic hairy roots were induced by Agrobacterium rhizogenes K599 in chrysanthemum in vivo and
plant regenerated from hairy roots highly efficiently in the study. It is useful to dwarf breeding and the
target gene transformation of chrysanthemum.
Key words：chrysanthemum；Agrobacterium rhizogenes；hairy root；induction；regeneration

植物转基因技术在改良菊花（Dendranthema morifolium）品质中起着重要作用。邵寒霜等
（1999）、Petty 等（2000）、Zheng 等（2001）先后报道利用转基因技术将 lef、phyA、phyB-1 等基
因转入菊花，使菊花的形态和花期等发生了改变。目前，常用来自发根农杆菌 Ri 质粒的 rol 基因改
变观赏植物的株形（Zuker et al.，2001）。Kiyokawa 等（1996）将发根农杆菌 rolA、rolB、rolC 基因
转入了球根秋海棠中，结果观察到植株矮化，延迟开花，叶和花瓣均变皱。Handa 等（1995）将 rol
基因导入龙胆属植物草原龙胆（Eustoma grandiflorum）中，除了观察到转基因植株矮化，叶变皱外，
还观察到花冠呈杯状变化。Zuker 等（2001）用基因枪和根癌农杆菌相结合的方法，将 rol 基因导入
香石竹中，减少了香石竹腋芽的产生，增强了发根能力。Dolgov 等（1997）将 rolC 基因导入菊花
品种‘White Snowdon’中，获得两个转化系，其中有一个转化系与对照相比表现为丛生、矮化，并
且叶多分裂。此外，有研究报道利用农杆菌介导法将不同功能的目的基因转入菊花（傅荣昭和刘敏，
1998；王关林 等，2004；洪波 等，2005，2006；孙磊 等，2008；姜丹 等，2010），但上述报道中
菊花的再生效率偏低。
本研究中利用发根农杆菌 K599 活体侵染菊花组织培养的无菌苗，获得了转基因不定根，并由
转基因不定根高效再生植株。现将研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 农杆菌菌株与菊花材料
试验用菌种为本实验室保存的野生型发根农杆菌K599。将–80 ℃保存的菌种在LB + Str（链霉
素）50 mg · L-1的固体培养基上划线，28 ℃过夜培养；挑取单菌落在LB + Str 50 mg · L-1的液体培养
基中，230 ~ 250 r · min-1、28 ℃过夜培养。用生长旺盛的菌液进一步试验。
以本实验室获得的菊花品种‘小紫菊’的组培苗（向太和，2006）作为发根农杆菌 K599 侵染
诱导毛状不定根的受体材料。
1.2 毛状不定根的诱导、培养和再生
将过夜培养生长旺盛的发根农杆菌K599 用LB培养基离心清洗两次后重悬于LB培养基中，调光
密度（OD600）到 0.5 左右。将‘小紫菊’组培苗植株中部以上的叶片用解剖刀划出伤口，用微量进
样器吸取 20 μL农杆菌菌液滴加于叶片伤口处继续培养。
当生出不定根并生长到约 2 cm后，从顶端剪取不定根约 0.5 cm，转入不添加任何植物激素的
MS + 500 mg · mL-1 Cef（头孢霉素）上繁殖，每隔 15 ~ 20 d剪取 0.5 cm左右的不定根顶端转入新培
养基，培养 2 ~ 3 代后剪成 1 ~ 2 cm长的两段，再转入不含头孢霉素的MS + 6-BA 0.5 mg · mL-1 + NAA
1 mg · mL-1诱导培养基上诱导愈伤组织，30 d后将诱导出的愈伤组织转入MS + 6-BA 2 mg · mL-1培养
基上进行分化，最后将分化出的苗转入MS + IAA 0.5 mg · L-1培养基上形成带根的完整植株。待植株
长至 5 cm左右，打开瓶盖炼苗 3 d，移栽到含泥炭︰砻糠灰︰珍珠岩（体积比为 3︰1︰1）的盆钵中，
在自然条件下生长。
7 期 向太和等：发根农杆菌 K599 对菊花活体转化及其高效再生 1367
1.3 农杆菌K599 质粒、毛状不定根和再生植株DNA的提取
农杆菌 K599 质粒 DNA 的提取同前文（向太和 等，2001），参照向太和等（2005）的方法提取
毛状不定根和再生植株叶片的 DNA。
1.4 转基因毛状不定根和再生植株的PCR鉴定
根据 Furner 等（1986）发表的 rolC 基因序列，设计并合成扩增 rolC 的 PCR 引物。rolC-P1：
5′-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3′；P2：5′-TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3′。PCR 扩增参数如下：
起始变性 94 ℃、5 min 后，进行 35 个循环，每个循环包括 94 ℃变性 45 s，56 ℃退火 45 s 和 72 ℃
延伸反应 90 s，最后在 72 ℃延伸 10 min。扩增产物采用 1.0%琼脂糖凝胶电泳，120 V，1 h，溴化乙
锭染色，用凝胶成像系统（Bio/Rad 公司）进行拍照记录和分析。
1.5 再生植株qRT-PCR分析
用 RNA 提取试剂盒（TaKaRa 公司）提取转基因植株和对照亲本非转基因植株叶片 mRNA，用
SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TaKaRa 公司）进行 RT-PCR 扩增。根据菊花 actin 基因序列
（GenBank 登记号 AB205087）设计引物，actin-P1：5′-ACAACTGGCATTGTGTTGGA-3′和 actin-P2：
5′-CAGGACATCTGAAACGCTCA-3′，扩增结果作为内参。根据 rolC 基因序列（GenBank 登记号
X03432）设计引物，rolC-qP1：5′-AAGAAAGTGCGGCGAAGTAA-3′和 rolC-qP2：5′-ATCTCAGGG
TCAAGGACGTG-3′，进行 rolC 基因的定量分析，用 Strategene 公司 MX3000P 型荧光定量 PCR 仪
进行扩增。荧光定量 PCR 条件是起始 95 ℃ 2 min，随后 95 ℃ 30 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s 进行 40
循环，结束后在 4 ℃保存。参考 Schmittgen 和 Livak（2008）的方法计算 rolC 基因相对表达量。
2 结果与分析
2.1 发根农杆菌对菊花毛状不定根的诱导
发根农杆菌 K599 侵染‘小紫菊’叶片伤口处，在 10 d 左右形成肉眼可见的毛状根（图 1，A）。
在侵染的 50 处中有 44 处诱导出转基因不定根，诱导率为 88.0%（44/50）。在形成毛状根的过程中，
叶片伤口处未见明显的愈伤组织，这与 K599 侵染黄瓜、大豆和凤仙花子叶时在伤口处出现明显的
愈伤组织（向太和 等，2005）不同。而未滴加 K599 菌液的对照叶片伤口处均未出现生根现象。
2.2 毛状不定根的培养和植株再生
从顶端剪取长 0.5 cm左右不定根，在MS + 500 mg · L-1Cef培养基上能快速增殖，15 ~ 20 d可生
长到 2 cm以上，从顶端剪取快速增殖的不定根 0.5 cm左右转入新的培养基上，经过 2 ~ 3 代培养后
可达到有效除菌效果。选取生长状态良好的 40条不定根剪成 2段，转入MS + 6-BA 0.5 mg · L-1 + NAA
1 mg · L-1诱导培养基上，7 d后可看到根的切口处膨大突起，形成黄绿色愈伤组织，结构紧密，共获
得 60 块，诱导率为 75%（60/80）。30 d后选取 30 块进行分化，共分化出 19 株绿色苗，形成具有根
的完整植株，分化率为 63.3%（19/30）。再生植株经过炼苗后移栽成活，并能正常开花（图 1，B ~ D）。
再生植株形态与亲本（图 1，E）相比有较大差异，表现为矮缩，具有毛状根等，与前人报道（Handa
et al.，1995；Kiyokawa et al.，1996；Dolgov et al.，1997）一致。




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图 1 发根农杆菌 K599 对菊花活体侵染形成转基因不定根及转基因不定根的再生植株
A：无菌苗叶片被 K599 活体侵染生根；B：转基因不定根形成愈伤组织；C：再生植株；D：移栽成活的转基因植株；E：对照亲本。
Fig. 1 Hairy roots induced by Agrobacterium rhizogenes K599 in chrysanthemum in vivo and plant regeneration from hairy roots
A：Hairy roots induced from leaves by K599；B：Calli induced from transgenic hairy roots；C：Transgenic regenerated plantlet；
D：Transgenic plantlet survival in soil；E：Control parental plant.
2.3 毛状不定根以及再生植株中rolC基因的PCR扩增检测
从诱导形成的毛状根以及再生植株 DNA 中均扩增到期望的 770 bp 左右的特异性 DNA 片段，
该片段与从发根农杆菌 K599 的 Ri 质粒 DNA 中扩增出的特异性片段大小相同，而非转化根和非转
化叶片未扩增出任何条带（图 2）。表明转化植株为 PCR 阳性，由不定根再生的植株为转基因植株。
图 2 转基因毛状根和再生植株的 PCR 扩增结果
M：Marker；1 ~ 3：转基因毛状不定根；4：非转基因根；5 ~ 7：转基因再生植株 T01、T02 和 T03 叶片；
8：非转基因植株叶片；9：发根农杆菌 K599 Ri 质粒。
Fig. 2 PCR analysis on transgenic hairy roots and regenerated plantlets
M：Marker；1–3：Transgenic hairy roots；4：Non-transgenic root；5–7：Leaves from transgenic regenerated plantlets of T01，T02 and T03；
8：Leaves from non-transgenic plantlet；9：Agrobacterium rhizogenes K599 Ri plasmid.


2.4 再生植株rolC基因的qRT-PCR分析
以 actin 基因作为内参对照，荧光定量 PCR
（qRT-PCR）分析显示，rolC 基因在转基因植
株（T01、T02、T03）中实现了高效表达，而
在野生型的亲本非转基因植株（WT）中未检
测到表达信号（图 3）。 图 3 rolC 基因在菊花野生型（WT）和转基因植株（T01、T02 和
T03）叶片中的表达分析
Fig. 3 Expression of the rolC in leaves from wild-tpye（WT），rolC
transgenic chrysanthemum lines of T01，T02 and T03
7 期 向太和等：发根农杆菌 K599 对菊花活体转化及其高效再生 1369
3 讨论
已有的研究表明发根农杆菌 K599 对于大豆、黄瓜、凤仙花的子叶具有较高的转化效率（Savka
et al.，1990；Cho et al.，2000；向太和 等，2001，2005）。本研究中，发根农杆菌 K599 对菊花叶
片同样具有较高的侵染转化率。发根农杆菌 K599 不仅可以侵染子叶，还可以侵染正常生长植株的
叶片；这表明发根农杆菌 K599 对不同科属、不同生理状态的植物器官具有广泛的侵染性。
不少研究报道，在含有植物生长调节剂的培养基上，离体的叶片和茎在培养过程中会产生非转
基因的不定根（Nolan et al.，2003；林娅 等，2006），而利用生长状态下的菊花叶片活体作为农杆
菌侵染的对象，获得的不定根经过PCR检测为转基因不定根，可有效克服假阳性转基因不定根的出
现。此外，在农杆菌转基因过程中，外植体与农杆菌共培养后必须使用抗生素抑制直至杀灭农杆菌，
通常使用 250 ~ 1 000 mg · L-1的头孢霉素。Yepes等（1999）观察到头孢霉素对菊花的外植体再生有
毒害作用，会抑制植株的分化。本研究中利用不定根繁殖过程中顶端生长点区域无菌的特点，通过
截取不定根顶端靠近生长点区域进行继代培养 2 ~ 3 次，结合使用头孢霉素杀菌，能很好地抑制和
杀灭发根农杆菌，因此，在随后的不定根诱导愈伤及分化过程中无须再使用抗生素（头孢霉素）杀
菌，从而有效提高了转基因再生效率。
虽然目前已经有报道利用农杆菌介导法以及基因枪法获得了转基因菊花，但其转化效率仍然不
高（傅荣昭和刘敏，1998；邵寒霜 等，1999；Petty et al.，2000；Zheng et al.，2001；王关林 等，
2004；洪波 等，2005，2006；孙磊 等，2008；姜丹 等，2010）。本研究中利用发根农杆菌 K599
对菊花切割的叶片进行活体侵染生根，其生根频率达 88.0%，而不定根的愈伤组织诱导率和愈伤组
织再生率分别达 75.0%和 63.3%。并且获得的转基因植株实现了来源于 K599 Ri 质粒的外源 rolC 的
高效表达，这为进一步进行菊花矮化育种和目标基因的转移提供了一个良好的试验体系。

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