全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (6) : 873 - 878
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 12 - 20; 修回日期 : 2008 - 04 - 21
基金项目 : 国家青年自然科学基金项目 (30400287) ; 广东省自然科学基金博士启动项目 ( 04300538) ; 广东省自然科学基金项
目 (06023159) ; 广东省科技攻关项目 (2006B20101014) ; 广州市科技计划项目 (2006Z32E0281)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: Huangxl@mail1 sysu1edu1cn)
‘过山香 ’香蕉原生质体培养及植株再生
肖　望 1, 2 , 黄　霞 1 , 魏岳荣 1 , 赵杰堂 1 , 戴雪梅 1 , 黄学林 13
(1 中山大学生命科学学院 , 教育部基因工程重点实验室 , 广州 510275; 2 广东教育学院生物系 , 广州 510303)
摘 　要 : 以 ‘过山香 ’香蕉的胚性悬浮细胞 ( Embryogenic cell suspensions, ECS) 为起始材料分离原
生质体 , 酶解液的组成为 : 315%纤维素酶 R210、1%离析酶 R210、0115%果胶酶 Y223、204 mmol·L - 1
KCl、67 mmol·L - 1 CaCl2和 0141 mol·L - 1甘露醇 , 原生质体产量为 311 ×107 ·mL - 1 PCV ECS ( PCV:
packed cell volume, 细胞密实体积 )。分别以培养基 ‘A’和 ‘B’为培养成分在液体浅层培养和看护培养
两种培养系统中进行原生质体培养。结果表明 : 在液体浅层培养系统中 , 采用培养基 ‘B’比培养基 ‘A’
效果好 , 原生质体的细胞分裂频率和细胞团形成频率分别约是采用培养基 ‘A’的 3倍和 10倍 ; 所获得的
培养物为只能增殖而不能进一步分化的非胚性细胞团。在看护培养系统中 , 采用培养基 ‘A’与培养基
‘B’时 , 细胞分裂频率和细胞团形成频率没有显著差异 ; 所获得的细胞团具有典型的胚性细胞特征。将从
看护培养中获得的细胞团转移到体胚诱导培养基上 , 培养 45 d后 , 从 105个原生质体获得 1 550个体胚。继
续在体胚诱导培养基上培养 30 d, 718%的体胚能萌发。萌发的体胚在 MS + 011%活性炭的培养基中发育成
健壮植株 , 移栽后成活良好。
关键词 : 香蕉 ; 胚性悬浮细胞 ; 原生质体 ; 植株再生
中图分类号 : S 66811　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0620873206
Plan t Regenera tion from Protopla st Culture of M usa AAB S ilk‘Guoshan2
x iang’
X IAO W ang1, 2 , HUANG Xia1 , W E I Yue2rong1 , ZHAO J ie2tang1 , DA I Xue2mei1 , and HUANG Xue2lin13
( 1 The Key L aboratory of Gene Engineering of M inistry of Education, School of L ife Sciences, Zhongshan (Sun Yat2sen ) U niversi2
ty, Guangzhou 510275, Ch ina; 2B iology D epartm en t, Guangdong Educa tion Institu te, Guangzhou 510303, China)
Abstract: A p rotocol for p lant regeneration from p rotop last of M usa AAB Silk‘Guoshanxiang’via so2
matic embryogenesis was developed. V iable p rotop lasts were isolated from embryogenic cell suspension ( ECS)
in a enzyme m ixture of 315% cellulose R210, 1% macerozyme R210, 0115% pectinase Y223 and 0141 mol·
L - 1 manntitol, the yield was 311 ×107 p rotop lasts per mL packed cell volume ( PCV ) ECS. L iquid and feeder
layer culture system swith medium‘A’and medium‘B’were used respectively for p rotop last culture. In liq2
uid culture system, medium‘B’was more efficient for inducing cell division and colony formation which was
about 32fold and 102fold respectively, compared to that with medium‘A’. However, all p rotop last2derived
cell colonies obtained from liquid culture system could not develop further. In feeder layer culture system,
there was no significant difference between medium‘A’and medium‘B’on cell division and colony forma2
tion of the cultured p rotop lasts. Protop last2derived cell colonies from feeder layer culture system were then
transferred onto embryo induction medium for somatic embryogenesis. After forty2five days the cell colonies
were transferred on embryo induction medium , 1 550 mature embryos were obtained from 105 p rotop lasts. Af2
ter another 30 d of culture, 718% of mature embryos germ inated. Normal p lantlets were obtained from MS
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basal medium supp lemented with 011% activated charcoal and the p lantletswere transferred into pots and grew
well.
Key words: banana; p rotop last; somatic embryogenesis; p lant regeneration
香蕉 (M usa spp. ) 是世界上重要的热带、亚热带水果。目前香蕉产业面临着严重的病虫害、台
风、冷害等的袭击 , 尤其是香蕉枯萎病 ( Fusarium oxysporun f. sp. cubense) 对香蕉产业造成的危害最
大 , 现已成为我国乃至全世界香蕉产业的毁灭性病害 (卓国豪 等 , 2005)。因此尽快培育出具有抗
香蕉枯萎病的香蕉新品种 , 是解决当前问题最根本的措施。但大多数香蕉栽培种属于三倍体 , 果实无
种子 , 难于采用传统的杂交育种来进行品种改良。体细胞杂交育种为香蕉种质的遗传改良提供了一条
有效途径 , 目前关于香蕉体细胞杂交的研究还处于初步探讨阶段。
自从 Bakry (1984) 分离获得第一个活的香蕉原生质体以来 , 已陆续有关于香蕉原生质体培养成
功的报道 (Megia et al. , 1993; Panis et al. , 1993; Matsumoto & Oka, 1998; A ssani et al. , 2001, 2002,
2006; 魏岳荣 等 , 2007; Xiao et al. , 2007)。研究结果表明 , 香蕉原生质体培养的成功除取决于以胚
性悬浮细胞 ( Embryogenic cell suspensions, ECS) 为分离原生质体的材料外 , 采用看护培养方法也是
一个重要的因素。由于所需要的技术复杂以及培养基试剂的昂贵 , 限制了香蕉原生质体培养的推广应
用。
‘过山香 ’香蕉 (M usa AAB Silk‘Guoshanxiang’) 是我国特有的优良香蕉种植品种 , 但植株易感
枯萎病 (黄秉智 等 , 2005) , 需要进行品质改良以适应日益严峻的环境。
作者以 ‘过山香 ’的 ECS为外植体分离原生质体 , 通过比较液体浅层培养和看护培养以及改良
培养基成分的研究 , 采用简化配方的培养基 ‘B’, 通过体细胞胚胎发生途径获得了 ‘过山香 ’香蕉
的原生质体再生植株。
1　材料与方法
111　材料
‘过山香 ’香蕉的 ECS由本实验室通过多芽体途径建立 (魏岳荣 等 , 2005a) , 用于原生质体分
离与培养 ; 贡蕉 [M usa acum ina ta cv. Mas (AA ) ] ECS由本实验室通过雄花序途径获得 (魏岳荣 等 ,
2005b) , 用作原生质体培养的看护细胞。
所有的 ECS都在 M2液体培养基中 , 每 15 d继代一次 , 接种密度为 115%。
M2培养基 (CÉte et al. , 1996) 组成为 : MS基本培养基 (Murashige & Skoog, 1962) + 100 mg·
L - 1麦芽水解物 + 680μmol·L - 1谷氨酰胺 + 411μmol·L - 1生物素 + 415μmol·L - 1 2, 42D + 130
mmol·L - 1蔗糖。除另有说明外 , 文中所有的培养过程都在黑暗 (27 ±2) ℃条件下进行。
112　原生质体的分离
取继代培养 4个月的 ‘过山香 ’ECS用于原生质体分离。在最近继代的 4～7 d时取样 , ECS用
200μm的筛网过滤后 , 取 015 mL细胞密实体积 (packed cell volume, PCV ) 的 ECS加入到 10 mL酶
液进行酶解 , 酶液组成为 315%纤维素酶 R210、1%离析酶 R210、0115%果胶酶 Y223、204 mmol·
L - 1 KCl、67 mmol·L - 1 CaCl2、0141 mol·L - 1甘露醇 , pH 516～518。酶解 8～11 h后 , 采用过滤离心
法进行原生质体的洗涤和纯化 (Xiao et al. , 2007) , 然后采用荧光素双醋酸酯染色法进行原生质体活
力检测 (W idholm , 1972)。
113　原生质体的培养
将原生质体分别用培养基 ‘A’和 ‘B’悬浮 , 密度调整到 1 ×105个 ·mL - 1 , 采用以下两种方法
进行培养。
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(1) 液体浅层培养 : 取 2 mL原生质体悬浮液加入直径 6 cm培养皿 , 用 Parafilm密封 , 刚开始
1～2 d经常轻轻摇动 , 避免原生质体分布不均匀并帮助通气。
(2) 看护培养 : 以贡蕉 ECS作看护培养细胞 , 看护培养基的制作参考 Xiao等 (2007) 所描述的
方法 , 在制作好的看护培养基上覆盖混合纤维素滤膜。将 1 mL原生质体悬浮液转移到混合纤维素滤
膜上进行培养。
培养 14 d时统计原生质体细胞分裂频率 , 28 d时统计细胞团形成频率。细胞分裂频率 ( % ) =分
裂一次或一次以上的原生质体数 /原生质体接种总数 ×100; 细胞团形成频率 ( % ) =含 4～6个以上
细胞的细胞团 /原生质体接种总数 ×100。
培养基 ‘A’的组成参考文献 (A ssani et al. , 2001) : N6盐 (Chu et al. , 1975) + KM维生素、
有机酸、糖醇 ( Kao & M ichayluk, 1975) +Morel维生素 (Morel & W etmore, 1951) + 119 mmol·L - 1
KH2 PO4 + 015 mmol·L - 1 MES + 019μmol·L - 1 2, 42D + 514μmol·L - 1 NAA + 213μmol·L - 1 ZT +
117 mmol·L - 1蔗糖 + 014 mol·L - 1葡萄糖 , pH 517, 过滤灭菌。
培养基 ‘B’的组成为 : MS基本培养基 + 100 mg·L - 1麦芽水解物 + 680μmol·L - 1谷氨酰胺 +
411μmol·L - 1生物素 + 015 mmol·L - 1 MES + 415μmol·L - 1 2, 42D + 117 mmol·L - 1蔗糖 + 014 mol·
L - 1葡萄糖 , pH 517, 过滤灭菌。
114　体胚发生与植株再生
将获得的细胞团转到体胚诱导培养基 (Xiao et al. , 2007) , 培养 45 d时统计体胚数。所获得的
体胚转移到新鲜的体胚诱导培养基上 , 一个月后统计体胚萌发频率。将萌发出芽 2～3 cm的体胚转移
到 MS基本培养基 + 011%活性炭的培养基中 , 促进植株发育。体胚萌发和植株发育在 16 h /8 h光周
期下进行。再生苗长至高 10～15 cm时移到温室种植。
2　结果与分析
211　原生质体的分离和培养
21111　原生质体分离 　
刚分离的原生质体球形 , 细胞质浓厚 , 内含物丰富 , 细胞大小不一 (图版 , 1)。原生质体产量
为 311 ×107个 ·mL - 1 PCV ECS, 活力 85%以上。
21112　液体浅层培养 　
进行液体浅层培养时 , 不同培养基对细胞形态和细胞分化过程的影响没有明显差异。培养 4～5 d
后 , 一些原生质体开始膨大变为椭圆形 ; 培养 10 d左右 , 原生质体出现第 1次分裂 (图版 , 2) ; 继
续培养 20 d后 , 可见到 4～6个细胞组成的小细胞团 (图版 , 3) ; 所获得的细胞团表现为中空 , 内含
物少 , 失去明显的胚性特征 (图版 , 3)。这些细胞团只能增殖 , 转移到体胚诱导培养基上不能进一
步分化。
不同培养基对细胞分裂频率和细胞团形成频率的影响有明显差异 , 采用培养基 ‘B’培养 14 d
时 , 细胞分裂频率约是采用培养基 ‘A’的 3倍 ; 培养 28 d时 , 细胞团形成频率约是采用培养基
‘B’的 10倍 (表 1)。
21113　看护培养 　
进行看护培养 (图版 , 4) 时 , 培养基 ‘A’或 ‘B’对细胞形态和细胞分化过程的影响没有明
显的差异。经过 3 d的培养 , 原生质体变成椭圆形的细胞 , 细胞质浓厚 , 内含物丰富 (图版 , 5 - a)。
经过 7 d左右的培养 , 原生质体开始第一次分裂 (图版 , 5 - b) , 随后进行第二次分裂。15 d后 , 分
裂形成为 8～10细胞组成的细胞团 (图版 , 5 - c)。经过 20 d的培养 , 成为肉眼可见的细胞团 , 45 d
时可见大量的肉眼可见的细胞团。
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由于细胞分裂是不同步的 , 因此在同一时期可看到单个细胞、二细胞、四细胞以及多细胞团。所
形成的细胞团细胞质浓厚 , 球形 , 具有典型的胚性细胞特征 (图版 , 5) , 转移到体胚诱导培养基上
能进一步分化。
采用培养基 ‘A’和培养基 ‘B’对细胞分裂频率和细胞团形成频率的影响没有显著差异 (表 1)。
图版说明 :
1. 刚分离的原生质体 , 标尺 = 50μm; 2. 在液体浅层培养系统中发生的第一次细胞分裂 , 标尺 = 50μm; 3. 液体浅层培养系统中形
成的细胞团 , 标尺 = 50μm; 4. 看护培养装置 , 标尺 = 215 cm; 5. 看护培养时 , ( a) 原生质体复壁变成椭圆形的细胞 , ( b) 第一次
分裂 , ( c) 细胞团 , 标尺 = 100μm; 6. 体胚 , 标尺 = 215 mm; 7. 体胚萌发 , 标尺 = 1 cm; 8. 温室驯化成活的原生质体再生苗 , 标
尺 = 10 cm。
Explana tion of pla tes:
1. Freshly isolated p rotop lasts, bar = 50μm; 2. First division of the p rotop lasts in liquid culture system, bar = 50μm; 3. Cell colonies derived
from p rotop lasts in liquid culture system, bar = 50μm; 4. Protop lasts cultured on feeder layer, bar = 215 cm; 5. Protop last became large and oval
in shape ( arrow a) , the first division ( arrow b) and cell colonies ( arrow c) in feeder layer culture system, bar = 100μm; 6. Somatic embryos,
bar = 215 mm; 7. Germ inating embryos, bar = 1 cm; 8. Regenerated p lants after transfer to soil, bar = 10 cm.
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表 1　培养方法和培养基对 ‘过山香’原生质体培养的影响
Table 1　Effects of culture m ethods and culture m ed ia on protopla st culture of
M usa AAB S ilk‘Guoshanx iang’
培养系统
Culture system s
培养基
Culture media
培养 14 d时分裂频率 /%
D ivision frequency after 14 days of culture
培养 28 d时细胞团形成频率 /%
Colony formation frequency after 28 days of culture
液体浅层培养 ‘A’ 1216 ±2134b 018 ±0117b
L iquid culture system ‘B’ 3412 ±5122a 813 ±2119a
看护培养 ‘A’ 5117 ±5146a 4212 ±4177a
Feeder layer culture system ‘B’ 5415 ±4176a 4516 ±3193a
　　注 : 数据表示 3次重复的平均值 ±标准差。在同一培养系统内 , 采用邓肯氏多重分析法进行数据分析 , 数据后面的相同字母表示
在 P = 0105水平上差异不显著。
Note: Data rep resent average ±S. E. of three rep licates. Means followed by the same letters are not significantly different by Duncanpismulti2
p le2range test ( P = 0105) in the same culture system.
212　体胚发生与植株再生
经看护培养获得的细胞团在体胚诱导培养基上培养 20～25 d左右 , 可见到长椭圆形、直径大约
110～115 mm的发育成熟的体胚 (图版 , 6)。
经过 45 d的培养 , 由 105个原生质体总共获得 1 550个左右的体胚。这些体胚在新鲜的体胚诱导
培养基上再经过 30 d的培养 , 718%的体胚萌发 (图版 , 7)。
萌发的体胚在 MS + 011%活性炭的培养基上 , 30 d后发育为 10～12 cm高的幼苗。这些幼苗在温
室驯化培养 3个月后长成健壮的植株 (图版 , 8)。
3　讨论
到目前为止 , 香蕉原生质体培养还没有通过液体培养获得原生质体再生细胞团以及再生植株。
采用看护培养是取得香蕉原生质体培养较易成功的方法 , 但看护培养操作复杂 , 容易污染 ; 现有
的培养基 ‘A’中有些成分价格昂贵 , 如维生素 A、维生素 D3、维生素 B12和玉米素等。这些都是
制约香蕉原生质体培养及其应用进展的因素 , 因此有必要进一步研究培养方法以及对培养基成分进
行改良。
在本研究中 , 采用改良的培养基 ‘B’与目前文献报道的培养基 ‘A’相比 , 成本下降了约
30% , 同时不影响 ‘过山香 ’香蕉原生质体看护培养的效果。特别是采用改良的培养基 ‘B’通过液
体浅层培养首次获得了频率为 813%细胞团 , 尽管目前没有获得再生植株 , 但液体浅层培养方法在香
蕉的原生质体培养上应该是有潜力的 , 值得进一步研究。
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