全 文 ：分子植物育种，2010年，第 8卷，第 3期，第 542-546页
Molecular Plant Breeding, 2010, Vol.8, No.3, 542-546
研究报告
A Letter
野生阿宽蕉胚性细胞悬浮系原生质体分离及植株再生
刘代 1,2 魏岳荣 1* 胡家金 2 易干军 1 邓夫平 1
1广东省农业科学院果树研究所,广州, 510640; 2湖南农业大学生物科学技术学院,长沙, 410128
*通讯作者, weid18@163.com
摘 要 本研究以野生阿宽蕉(Musa itinerans Cheesman)未成熟种子诱导的胚性细胞悬浮系为材料，对其
原生质体的分离和植株再生进行研究。结果表明：胚性悬浮细胞在酶组合：3.0%纤维素酶 R-10、1.0%离析
酶 R-10、0.2%果胶酶 Y-23、1.52% KCl 、0.78% CaCl2、0.01% MES和 11%甘露醇中，酶解 8 h，原生质体的
产量和活力达到最大值，分别为 19.46×106个 /mL和 92.17%。采用看护培养法对原生质体培养 60 d后，可
获得大量增生的小细胞团，细胞团悬浮培养 15 d后转至体胚诱导培养基上培养约 30 d，其体胚萌发率为
45.97%，然后转至生根培养基上培养 35 d，其再生植株率为 54.76%。
关键词 阿宽蕉,胚性悬浮细胞,原生质体,植株再生
Protoplast Isolation from Somatic Embryogenic Cell Suspension Cultures
of Musa itinerans Cheesman and Plant Regeneration
Liu Dai 1,2 Wei Yuerong 1* Hu Jiajin 2 Yi Ganjun 1 Deng Fuping 1
2 Institute of Fruit Tree Research, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou, 510640; 2 College of Biological Science and Technology,
Hunan Agricultural University, Changsha, 410128
* Corresponding author, weid18@163.com
DOI: 10.3969/mpb.008.000542
Abstract In this research, we employed embryogenic cell suspension (ECS) induced from immature seeds of
Musa itinerans Cheesman to be as materials for studying the protoplast isolation and plant regeneration. The re-
sults showed that enzyme concentrations of embryogenic suspension cell contained 3.0% cellulose Onozuka R-10,
1.0% macerozyme R-10, 0.2% pectinase Y-23, 1.52% KCl, 0.78% CaCl2, 0.01% MES and 11% mannitol, and en
zymes solution for 8 hours, then the yield and viability of protoplasts reached the highest, 19.46×106 protoplasts/mL
and 92.17%, respectively. Feeder layer culture systems were used for protoplast culture, and a great deal of cell
aggregate clusters were obtained after 60 days culture, and then transferred onto embryo induction medium for
somatic embryogenesis. 30 days after cultured 15 days later, germination rate of somatic embryos was 45.97%,
finally, the germinated somatic embryos were transferred to rooting medium for 35 days, the rate of plant regenera-
tion reached 54.76%.
Keywords Musa itinerans Cheesman, Embryogenic cell suspension,Protoplast, Plant regeneration
www.molplantbreed.org/doi/10.3969/mpb.008.000542
基金项目：本研究由国家科技支撑项目(2008BAD92B06)、科技部国际合作项目(2009DFA31470)、国家 948项目(2008-G1)和
广东省科技计划项目(2008B050100043)共同资助
香蕉(Musa spp.)是世界上最重要的热带、亚热带
水果之一。目前全球香蕉产业正面临着严重的病虫、
台风、低温等灾害的侵袭，尤其镰刀菌枯萎病对世界
香蕉产业更是造成毁灭性灾害(魏岳荣等, 2005)。高
抗性新品种的培育是解决此问题的根本途径。然而，
大多数香蕉栽培种为三倍体，果实无种子、具有高度
不育性，传统的杂交育种方法很难获得理想的优良
新品种。原生质体培养、融合和转化已经成为植物细
胞改良创造新种质的新途径，并已在改变植物遗传
性的应用研究和基础研究中得到广泛应用，Matiheij
和 Puite (1992)用电融合的方法获得了高产量的马铃
苗四倍体体细胞杂种，开辟了马铃薯商业化育种的
新途径，邓秀新和章文才(1995,自然科学进展, 5(1):
35-41)通过柑桔体细胞杂交得到了抗寒、抗高温和抗
病的杂种植株，但在香蕉上原生质体培养和融合的
研究尚处于初步阶段，取得的成功非常有限。
野生阿宽蕉(Musa itinerans Cheesman)具有抗病、
抗寒等优良性状，广泛分布于我国云南省和海南省，
是市场销售香蕉种类的“亲戚”，能够为培育新的抗
病品种提供研究资源。但是随着热带丛林被开发用
于农业生产，阿宽蕉的生存面临着日益严峻的威胁。
利用体细胞杂交技术可以有针对性地进行有效基因
和优良性状的转移，而体细胞杂交技术必须以原生质
体高效再生体系为前提。因此，本实验以野生阿宽蕉
未成熟种子诱导愈伤组织建立的胚性细胞悬浮系为
材料，研究了影响原生质体分离、培养和再生的主要
因素，旨在建立高效的原生质体再生体系，为香蕉细
胞工程育种研究提供优质的原生质体和技术参考。
1结果与分析
1.1原生质体分离
1.1.1不同酶液浓度及组合对原生质体分离的影响
酶是影响原生质体分离产量和质量的最主要的
外在因素。本试验以继代 7 d的悬浮细胞为材料,在
酶解时间为 8 h条件下，比较分析了纤维素酶 R-10、
离析酶 R-10 和果胶酶 Y-23 三种酶在不同浓度组
合时对分离香蕉原生质体产量和活力的影响。从表 1
可以看出，不同酶液浓度及组合对分离的原生质体
产量和活力具有很大的影响。
当纤维素酶浓度为 2.0%时，随着果胶酶浓度的
升高，原生质体产量和活力增高；当纤维素酶浓度为
3.0%、4.0%时，随着果胶酶浓度的升高，原生质体产
量和活力先升高后下降。其中，当纤维素浓度为
3.0%，离析酶浓度为 1.0%，果胶酶浓度为 0.2%时，原
生质体产量和活力值最大，分别为 19.46×106个 /mL
和 92.17%。
1.1.2不同酶解时间对原生质体分离的影响
在酶液组成为：3.0%纤维素酶 R-10+1.0%离析
酶+0.2%果胶酶 Y-23条件下，本实验在酶解 4 h后，
每 2 h取样镜检，测定原生质体的产量和活力，分析
不同酶解时间对原生质体分离的影响。结果如表 2
所示，酶解 4 h时，只观察到少量原生质体，且原生质
体个体小。6 h后可观察到大量原生质体，酶解 8 h
后，具有活力的原生质体产量达到最高值，产量达到
18.42×106个 /mL，活力达到 86.5%。酶解 10 h后，随
着酶解时间的继续增长，原生质体开始破裂，其产量
和活力都呈下降趋势。
1.1.3不同渗透压对原生质体分离的影响
在酶液组成为：3.0%纤维素酶 R-10+1.0%离析
酶+0.2%果胶酶 Y-23条件下，以甘露醇作为渗透压
调节剂，比较研究了不同浓度甘露醇对原生质体分离
的影响。结果表明(表 3)：随着甘露醇浓度的逐渐升高，
原生质体产量和活力提高。当渗透压为 0.55 mol/L (百
表 1酶液成分对原生质体分离的影响
Table 1 Effects of enzyme solution compositions on protoplasts isolation
纤维素酶(%)
Cellulase R-10 (%)
2.0
2.0
2.0
3.0
3.0
3.0
4.0
4.0
4.0
果胶酶(%)
Pectinase Y-23 (%)
0.1
0.2
0.3
0.1
0.2
0.3
0.1
0.2
0.3
离析酶(%)
Macerozyme R-10 (%)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
产量(×106/mL)
Yield (×106/mL)
2.70
3.34
3.84
16.84
19.46
18.46
15.56
17.42
16.72
活力(%)
Viability (%)
81.34
82.17
82.92
84.11
92.17
87.34
74.32
77.96
67.45
表 2酶解时间对原生质体分离的影响
Table 2 Effects of enzyme dissolve time on protoplasts isolation
酶解时间(h)
Enzyme dissolve (h)
4
6
8
10
12
产量(×106/mL)
Yield (×106/mL)
8.86
15.28
18.42
17.88
16.74
原活力(%)
Viability (%)
89.39
87.62
86.56
83.43
76.37
野生阿宽蕉胚性细胞悬浮系原生质体分离及植株再生
Protoplast Isolation from Somatic Embryogenic Cell Suspension Cultures of Musa and Plant Regeneration 543
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
分比浓度为 10%)和 0.65 mol/L (百分比浓度为 11%)
时活力和产量分别达最大值，为 92.34%和 18.98×106
个 /mL。随渗透压进一步升高，产量和活力下降。
1.2原生质体培养
在本实验中，观察比较了液体浅层培养与看护
培养两种方法对香蕉原生质体培养的效果。结果表
明，采用液体浅层培养原生质虽然体能分裂 1~3次，
但培养一段时间后，原生质体不能继续分裂，细胞变
得更透明，形状成絮状，最后褐化死亡。采用看护培
养法效果较好，原生质体在培养 1~3 d后开始新生细
胞壁，3~5 d开始进行第一次分裂(图 1E)，10 d左右
进行第二次分裂(图 1F)。随后原生质体持续分裂,细胞
质逐渐变得浓厚。20 d后形成肉眼可见的小细胞团，
60 d后形成大量的细胞团(图 1G)。当细胞团直径为
0.5 mm左右时，转入 M2培养基中，27℃，110 r/min
的摇床上黑暗条件下进行悬浮增殖培养(图 1I)。
1.3体胚发生与植株再生
细胞团悬浮培养 15 d后转移到体细胞胚诱导培
养基上培养 15 d后形成肉眼可见的体细胚，30 d后，
体细胞胚的体积明显增大，颜色开始变白并呈半透
明状。经过体细胞胚继代培养 30 d后，体细胞胚发育
图 1野生阿宽蕉原生质体的培养和植株再生
注: A:胚性愈伤组织; B:胚性细胞悬浮系; C:分离的原生质体; D:活力检测; E:原生质体第一次分裂; F:原生质体第二次分裂;
G:培养 60 d后长成的细胞团; H:原生质体看护培养; I:愈伤组织进行悬浮增值; J:体胚诱导; K:体胚萌发; L:再生植株
Figure 1 Protoplast culture and plant regeneration of Musa itinerans Cheesman
Note: A: Embryogenic callus; B: Embryogenic cell suspension; C: Freshly isolated protoplasts; D: Viability testing; E: First cell divi-
sion of protoplasts; F: Second cell division of protoplasts; G: Colony formed after 60 days of culture; H: Protoplasts cultured on feeder
layer; I: Embryogenic cell suspension from protlplast; J: Somatic embryos induced; K: Germinating embryos; L: Regeneration plant
表 3甘露醇浓度对原生质体分离的影响
Table 3 Effects of mannitol concentrations on protoplast isolation
甘露醇浓度( %)
Mannitol concentration (%)
8
9
10
11
12
13
产量(×106/mL)
Yield (×106/mL)
12.90
16.26
17.86
18.98
18.24
15.72
活力(%)
Viability (%)
79.82
84.92
92.34
92.10
85.76
81.04
www.molplantbreed.org
DOI: 10.3969/mpb.008.000533544
为白色的、直径约 1.0 mm大小的球状形胚(图 1J)。
成熟的体细胞胚在M4培养基中培养 10 d后体
胚的茎端开始转绿，30 d后 45.97%的体胚能萌发，体
细胞胚萌发率 (%)=萌发的体胚数 / 总体胚数×100
(图 1K)。
萌发的体胚在生根培养基上 5 d 后开始生根，
30d后发育成健康的植株，植株再生率为 54.76%，植
株再生率(%)=再生植株数 /总体胚数×100 (图 1L)。
2讨论
在香蕉原生质体分离和培养中，起始材料的类
型、生理状态和基因型选择非常重要，直接影响到原
生质体的产量和质量。从现有的研究报道看，仅仅从
香蕉 ECS分离的原生质体才能培养成功(Panis et al.,
1993; Megia et al., 1993; Assani et al., 2006; 肖望等 ,
2008)。因此，高质量 ECS的获得是原生质体分离培
养及植株再生的重要前提，野生蕉在长期的自然选
择过程中形成了许多优良的特性，蕴藏着高效优质、
耐寒抗旱、抗病虫害等基因、是香蕉遗传改良的重要
基因库。本实验通过野生阿宽蕉未成熟种子为材料，
通过诱导出的愈伤组织获得稳定的野生阿宽蕉的
ECS，为野生阿宽蕉原生质体再生体系的建立提供了
重要材料。
最佳的酶液组合和酶解时间一直是研究的重
点，直接决定着分离的原生质体产量和活力，渗透
压也是影响原生质体分离效率的一个重要因素，本
试验采用野生阿宽蕉的 ECS为分离原生质体的试
验材料，确定在最佳酶液组合：3.0%纤维素酶
R-10、1.0%离析酶 R-10、0.2%果胶酶 Y-23、1.52%
KCl、0.78% CaCl2、0.01% MES和 11%甘露醇中，酶
解 8 h，原生质体产量和活力达到最大值，分别为
19.46×106个 /mL，92.17%，能为体细胞杂交提供理
想的村料。到目前为止, 香蕉原生质体培养一般可
通过看护培养获得原生质体再生细胞团以及再生
植株 (Panis et al., 1993; Megia et al., 1993; Assani et
al., 2006;肖望等, 2008)。本实验通过液体培养和看
护培养两种方法培养香蕉原生质体，仅从看护培养
方法获得原生质体持续分裂、再生细胞团。看护培
养方法在原生质体分裂和胚性的保持起着重要作
用，其根本的原理可能是生长迅速的 ECS可能给原
生质体提供生长因素和未知的化学物质。在香蕉的
原生质体培养和再生体系中，再生周期长、体胚萌
发率低为影响原生质体高效再生体系建立的关键
因素，而在本实验建立的野生阿宽蕉原生质体再生
体系中，体胚萌发率 45.97%、植株再生率 54.76%，
再生周期 150 d相比其它几个香蕉再生体系都较为
理想，建立了稳定高效的香蕉原生质体再生体系，
为香蕉细胞工程、基因工程育种以及种质改良奠定
了材料基础，并提供了技术参考。
3材料与方法
3.1材料
野生阿宽蕉(Musa itinerans CheesmanABGroup)
取自广东省农业科学院果树研究所建立的“国家果
树种质——广州香蕉圃”。
3.2胚性细胞悬浮系的建立和继代培养
参照魏岳荣等(2006)的方法，选取野生阿宽蕉未
成熟种子为外植体，诱导获得胚性愈伤组织，继代保
持在M2培养基中(C觝te et al., 1996)，M2培养基的组
成为：MS盐(Murashige and Skoog, 1962)+100 mg/L麦
芽提取物+100 mg/L谷氨酰胺+100 mg/L肌醇+1 mg/L
生物素+1 mg/L 2,4-D+45 g/L蔗糖，pH 5.3，高温高压
灭菌。27℃, 110 r/min的摇床上震荡暗培养，按照
1.5% (v/v)浓度每 15 d继代培养一次，3个月后获得
稳定的胚性细胞悬浮系，并在同样条件下进行继代
培养，为原生质体的培养提供材料。
3.3原生质体分离和纯化
取继代培养 15 d、生理状态稳定的胚性细胞悬
浮系，经 200 μm细胞筛过滤，将培养液中匀质的小
细胞团置于 M2液体培养基中再培养 7 d，静置沉淀
后吸掉部分上清液，经 600 r/min离心 3 min，吸走上
清液后加入少量 M2液体培养基悬浮，调整密度为
0.5 mL细胞密实体积(packed cell volume, PCV)，加入
到 10 mL酶液中进行酶解，酶液组成(表 1)。酶采用
酶溶解液(15.2 g/L KCl、7.8 g/L CaCl2、100 mg/L MES)
进行溶解，以甘露醇作为渗透压调节剂，pH 5.7，经
直径 0.22 μm微孔滤膜过滤灭菌。在 50 r/min的摇
床上 27℃黑暗条件下酶解。采用过滤离心法进行原
生质体的洗涤和纯化(Xiao et al., 2007)。最后用原生质
体培养基洗涤一次。原生质体培养基组成为：MS盐+
100 mg/L麦芽提取物 +100 mg/L谷氨酰胺+Morel and
Wetmore维生素(Morel and Wetmoel, 1951)+100 mg/L
肌醇+1 mg/L 生物素+2 mg/L 2,4-D+40 g/L 蔗糖+
80 g/L葡萄糖，pH 5.7，过滤灭菌。
3.4原生质体产量和活力的测定
采用血球计数板计算原生质体产量，用荧光素
双醋酸酯(FDA)染色法进行原生质体活力检测(Wid-
野生阿宽蕉胚性细胞悬浮系原生质体分离及植株再生
Protoplast Isolation from Somatic Embryogenic Cell Suspension Cultures of Musa and Plant Regeneration 545
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
holm, 1972)。每个样品重复 3次，每重复统计 5个视
野，取平均值。
3.5原生质体培养
原生质体采用液体培养和看护培养两种方法进
行培养，液体培养：将调整好密度为 5×105个 /mL的
原生质体 2 mL加入到 6 cm 培养皿中 27℃黑暗条
件下培养。看护培养参考 Assani等(2001)的方法进
行。将野生阿宽蕉胚性悬浮系细胞经 300 μm的金属
筛过滤，吸取约 2 mL PCV的 ECS加入到 9 cm培养
皿中，加入 10 mL双倍浓度的看护培养基。看护培养
基组成：MS盐+ Morel and Wetmore 维生素+2 mg/L
2,4-D+250 mg/L 葡萄糖+72 g/L 麦芽糖+20 g/L 蔗
糖+2 mL/L椰乳，pH 5.7，过滤灭菌。将 1.2 g琼脂糖
溶解于 100 mL蒸馏水，调 pH 5.7，高温高压灭菌，当
琼脂糖溶液温度下降到 35℃左右时，吸取 10 mL加
入到培养皿中，充分摇匀冷却后在培养基上铺上一张
直径 60 mm，孔径 0.45 μm的混合纤维素滤膜，取密
度调整为 5×105个 /mL的原生质体悬浮培养液 1 mL
均匀加入到滤膜上，27℃黑暗条件下培养。
3.6体胚发生与植株再生
取悬浮培养 15 d后的细胞团，转入到体细胞胚
诱导培养基 M3中诱导体细胞胚的发生，定期观察
体细胞胚的诱导情况。M3的组成成分包含：SH培养
基(Schenk and Hildebrandt, 1972)中的大量元素、微量
元素和铁盐+MS 中的维生素+4.5 μmol/L 生物素+
680 μmol/L 谷氨酰胺+2 mmol/L 脯氨酸+100 mg/L
麦芽提取物+1 g/L肌醇+1.1 μmol/L NAA+0.5 μmol/L
Kt+29 mmol/L 乳糖+130 mmol/L 蔗糖+7 g/L 琼脂
粉，pH 5.8。培养 30 d后转入相同的培养基中继续培
养 30 d，以促进体细胞胚的成熟。之后转入体胚萌
发培养基 M4 中进行体胚萌发，M4 的组成为：MS
盐+4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+130 mmol/L蔗糖+
7 g/L琼脂粉，pH 5.8。30 d后统计体胚萌发率。将长
至 2~3 cm的再生苗移至 MS基本培养基+250 mg/L
活性炭+1 mg/L盐酸硫胺素+100 mg/L肌醇+30 g/L
蔗糖的生根培养基中生根，进一步发育成完整植株。
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