全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 4期
高羊茅胚性悬浮细胞系的快速建立及其单细胞培养
杨帆1, 2 韩烈保 1, 2
( 1北京林业大学草坪研究所暨森林培育与保护省部共建实验室,北京 100083; 2长江大学园艺园林学院,荆州 740025)
摘 要: 本研究采用高羊茅 (M illennium和 H undog )成熟种子为材料,以 MS为基本培养基, 通过添加 25 mg /L Cu
SO4 5H2O,或提高 NH 4NO3浓度至 25 g /L等措施均能明显提高愈伤组织的质量, 经过 3~ 5个月的筛选获得疏松干燥、颗粒
状、生长旺盛、适合悬浮培养的 !型胚性愈伤组织。悬浮培养初期需用 MS∀液体培养基进行一个月的启动培养 ,之后转用 M S
!继代保持, 约 2个月左右即建立起来自高羊茅 2个品种的 3个悬浮细胞系。生长特性测定结果表明, 悬浮培养的初始接种
量以 1 0~ 3 0 m l/40 m l为宜, 生长周期内其 pH值不断波动变化, 最适范围在 5 0~ 57之间。 5~ 8 d为悬浮系的对数生长
期, 此时细胞分裂旺盛,增殖较快,是分离单细胞的最佳时期。单细胞培养方式以悬浮培养效果最好。
关键词: 愈伤组织 胚性悬浮细胞 单细胞培养 高羊茅
Establishm ent of Embryogenic Cell Suspension Cultures andMonocell
Culture ofFestuca arund inacea Shreb
Yang F an
1, 2 H an L iebao1, 2
(
1
Institute of Turfgrass Science of Beijing Forestry University, Beij ing 100083;
2
College of Gardening andH orticulture of Yangtze University, J ingzhou 740025)
Abstrac:t Ster ilized m a ture seeds ofF estuca arundinacea Shreb (M illennium and H undog ) w ere cu ltured for ca llus induction
on MS m ed ium, which con tained 2 5 mg /L CuSO4 5H 2O or 2 5 g /L NH4NO3 A so rt o f nonm uc ilag inous, g rainy tex ture, fast
g row ing ca llus wh ich is suitable for suspension cu lturew as ob tained a fter 3~ 5m onths A fter cu ltured fo r 1 month in MS∀ liquid m ed i
um, and then in MS! liqu id m edium for ma in tenance, three suspension ce ll lines w ere established theOutcom e showed tha t the suit
able concentration of o rig ina l suspension cu lture w as 10~ 30 m l/40 m ,l and the optim um pH value w as betw een 5 0 and 5 7 The
logarithm ic phasew as from the 5th day to the 8th day w hich w as the best tim e to sepa ra te monoce ll Suspension cu lture w as the best
m ethod fo rmonocell cu lture
Key words: Callus Em bryogenic cell suspens ions M onoce ll cu lture Festuca arund inacea Shreb
收稿日期: 20081024
基金项目:国家 # 863∃计划 ( 2006AA10Z132 ), #十一五 ∃国家科技支撑项目 ( 2006BAD01A19, 2006BAC 18B041 ),北京市重点实验室和北京市重
点学科专项
作者简介:杨帆 ( 1984) ,女,汉族,贵阳人,在读硕士研究生,研究方向:植物细胞工程; Em ai:l yangfan8433@ sina com
通讯作者:韩烈保 ( 1965) ,男,汉族,楚天学者,博士生导师,研究方向:草坪科学与管理; Em ai:l han lb@ tom com
植物细胞培养是 20世纪 80年代以后迅速发展
起来的技术。根据培养方式不同可分为悬浮培养、
平板培养和液体静止培养等。其中悬浮培养在液体
状态下便于细胞和营养物质的充分接触与交换,细
胞状态可以相对保持一致, 因此有利于在细胞水平
上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究, 并为
大规模生产细胞次生代谢产物奠定了基础。这一技
术已成为生物技术研究开发的新热点, 并广泛应用
于培育草坪草新品种 [ 1, 2]。
高羊茅 (F estuca arundinacea Shreb )是一种重
要的冷季型草坪草, 具有抗干旱、耐瘠薄、抗病虫害
强、适应性广等特点,已在城市绿化和运动场地的建
设中广泛运用,并且作为一个极具开发潜力的草坪
草种而倍受关注。但高羊茅存在叶片粗糙、没有匍
匐茎、夏季生长缓慢、易遭杂草侵害等不足, 因此,尝
试利用遗传转化手段改良其品质性状成为目前草业
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
工作者研究的热点。由于胚性悬浮细胞系生长迅
速,重复性好,易于控制等, 并且作为分离原生质体
的来源已经被广泛用于体细胞杂交、突变体筛选和
遗传转化等方面的研究。以此为受体获得转基因高
羊茅, 可在短期内在细胞水平筛选出预期突变体,从
而为高羊茅的遗传转化奠定良好的基础 [ 3, 4]。着重
研究了快速建立高羊茅胚性悬浮细胞系的条件和方
法,分析了悬浮培养过程中的生理生化变化,并对单
细胞培养的 3种方法进行了比较。
1 材料与方法
11 试验材料
以高羊茅千年盛世 ( M illenn ium )和猎狗 5号
(Hundog )的成熟种子为材料, 由北京绿冠草业
科技发展中心提供。
12 培养基设计
本实验共设计了 7种以 MS为基础的改良培养
基,其中用于愈伤诱导的固体培养基为 MS1、MS2、
MS3;用于悬浮培养的培养基为 MS∀、MS!、MS%;
用于单细胞培养的培养基为 MS& (表 1)。
表 1 愈伤诱导、悬浮培养及单细胞培养所用培养基组成成分
(单位: m g/L )
培养基类型 MS1 MS2 MS3 MS∀ MS! M S% M S&
大量元素 MS MS MS MS MS M S 1 /2MS
微量元素 MS MS MS MS MS M S M S
有机成分 MS MS MS MS MS M S M S
铁盐 MS MS MS MS MS M S M S
2, 4D 9 9 5 9 5 5 5
KT 01 05 0 01 0 01 01
6BA 0 005 0 0 0 0 0
C uSO 4 5H 2O 25 25 0 0 0 0 0
水解乳蛋白 0 0 0 0 0 0 400
酸水解酪蛋白 0 0 0 0 0 0 0
蔗糖 30 000 30 000 30 000 30 000 30 000 30 000 30 000
琼脂 7 000 7 000 0 0 0 0 0
植物凝胶 0 0 3 000 0 0 0 0
13 方法
131 高羊茅胚性愈伤组织的诱导和继代培养
外植体消毒 将种子置于 50m l离心管中,加入 1~
2滴表面活性剂 Tw een20和 40m l次氯酸钠原液 (有
效氯∋ 100% ),放置在 901双向磁力搅拌器上消
毒 1 h, 用无菌水清洗 3~ 5次后再加入 40 m l无菌
水于双向磁力搅拌器上搅拌 15~ 20 m in以去除种
皮, 无菌水清洗 3~ 5次后接种。
经消毒处理过的种子接种于 MS1诱导培养基
上, 培养条件为 ( 28 (1) ) , 黑暗培养。接种 5 d后拔
芽,接种 4周后诱导出的愈伤组织多为水渍状,不适
合挑选,直接将其转接于 MS2筛选培养基上继代一
代, 此后选取结构致密, 黏液少, 颜色鲜艳的愈伤组
织于 MS3培养基上进行继代保持。
132 高羊茅胚性悬浮系的建立 从经继代改造
后的愈伤组织中, 选取生长旺盛的胚性愈伤转移到
250 m l三角瓶中,加入 100 m lMS∀液体培养基, 置
于转速为 90~ 100 r/m in的全温震荡培养箱 (型号
为 HZQF)中黑暗振荡培养,温度条件为 ( 28 (1) ) 。
每隔 3 d换液继代一次, 条件培养基与新鲜培养基
的比例控制在 1∗2左右。 1个月后改用 MS!液体
培养基,间隔 2~ 3个培养周期用 MS%液体培养基
继代一次以保持细胞分裂能力。
133 悬浮系的优化及其生长特性的测定 在所建
立的 3个悬浮细胞系中选取悬浮系∀(M illenn ium )测
定其生长特性,实验均取 3次重复的平均值。 ( 1)悬
浮系生长曲线的测定:取 20 m l悬浮培养物置于含
40m lMS!液体培养基的 100m l三角瓶中,每 2 d测
定一次细胞密实体积 ( packed cell vo lume, PCV) ; ( 2)
细胞起始密度、生长速率、pH之间的相互关系: 在含
40m lM S!液体培养基的 100m l三角瓶中,分别接种
悬浮培养物 10、20、30、40、50 m ,l在其生长周期
内每 2 d测定一次悬浮培养物的 PCV值和上清培养
液的 pH值; ( 3)肌醇浓度对悬浮系生长量的影响:在
100m l三角瓶中加入 40 m l含不同肌醇浓度 ( 100、
300、600及 800 mg /L )的 MS!液体培养基, 取 20m l
悬浮培养物置于培养基中,培养 4个继代周期后测定
PCV及其光密度值。用 200目细胞筛过筛后,培养液
用 UV7504C紫外分光光度计在 600nm下测其光密
度值,光密度值与细胞浓度成正比。
134 培养方式对单细胞培养的影响 选取处于
对数生长期的悬浮培养物,经 200目过筛后滤液置
于离心管中, 1 500 g下离心 5m in,将得到的单细胞
用 MS&培养基悬浮、离心、洗涤 2次;调整细胞密度
为 2 + 105个 /m ,l选用 3种不同的培养方式进行培
养, 分别为浅层静止培养、悬浮培养和平板培养, 培
养条件为 ( 28 ( 1) ) ,黑暗。
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2009年第 4期 杨帆等:高羊茅胚性悬浮细胞系的快速建立及其单细胞培养
135 实验参数指标 细胞密实体积 ( PCV ) =调
查时的细胞体积 /总培养液体积
细胞生长量 = (调查时的细胞总数 /接种时的
细胞总数 ) + 100%
细胞 PCV增长率 = [ (最终 PCV -初始 PCV ) /
初始 PCV ] + 100%
圆细胞率 = (视野中圆细胞数 /视野中细胞总
数 ) + 100%
细胞分裂率 = (视野中分裂的细胞数 /视野中
细胞总数 ) + 100%。
2 结果与分析
21 初生愈伤组织的继代改良
高羊茅成熟种子诱导出的愈伤组织可分为 3种
类型: ∀型愈伤组织为柔软水渍状, 形状不规则,颜
色淡白的非胚性愈伤组织; !型愈伤组织为结构致
密,疏松干燥,颜色乳白至浅黄色的胚性愈伤组织;
%型愈伤组织为质地坚硬, 颜色鲜黄的胚性愈伤组
织 (图 1a~ c)。继代过程中选取 !型和 %型胚性愈
伤组织进行继代改良, 并在继代过程中根据愈伤组
织的形态适时调整培养基配比。
Cu
2 +作为许多植物酶的激活因子, 对植物生长
和发育具有重要的作用, 高浓度的 Cu2+对大麦、小
麦、烟草和水稻的愈伤组织生长和植株再生具有显
著的促进作用 [ 5]。胡张华等 [ 3]以 25 mg /L的 Cu
SO4 5H2O处理高羊茅初生愈伤组织, 从中筛选疏
松颗粒状的胚性愈伤组织, 并以此快速建立胚性悬
浮细胞系。用相同方法处理高羊茅初生愈伤组织后
发现, Cu2+对愈伤组织具有良好的筛选作用, 能使
松脆胚性愈伤组织保存下来,从而快速建立胚性悬
浮细胞系。而其它类型愈伤组织褐化死亡。
此外,提高 NH4NO3的浓度也有利于适合悬浮
培养的愈伤组织的生成。曹毅等 [ 6 ]在玉米悬浮培
养中发现, 调整培养基中硝态氮 ( NO 3 - )和铵态氮
(NH4
+
)的比例, 获得的高水平氮素培养基有利于
形成生长迅速、松脆的 !型胚性愈伤组织。本试验
将 NH4NO3浓度增加至 25 g /L,愈伤质量有明显提
高,多为颗粒状!型胚性愈伤组织,为悬浮系的快速
建立提供了适宜的材料。
22 悬浮细胞系的建立
挑选淡黄色、疏松颗粒状、生长旺盛的!型胚性
愈伤组织进行悬浮培养。初期培养时每 3 d继代一
次, 每次继代时弃去大块愈伤组织或用 30目网筛过
滤, 滤液悬浮培养约 2个月左右即建立起了稳定的
悬浮细胞系,此后可 5~ 7 d换液继代一次。建成的
悬浮系浅黄色,生长旺盛, 分散性好, 颗粒大小均一
(多为 1~ 2 mm )。显微观察发现,悬浮初期多为长
形或不规则的细胞, 细胞中空、内含物不丰富, 经多
次继代后,细胞逐渐变为圆形或椭圆形,内含物逐渐
增多。建成的悬浮系中可见大部分细胞呈圆形, 多
为几个至几十个细胞组成的小细胞团, 且胞质浓厚,
细胞分裂旺盛 (图 1d~ f)。本试验已成功建立起来
自高羊茅 2个品种的 3个悬浮细胞系。
221 悬浮细胞系生长曲线的测定 悬浮培养细
胞的扩增生长曲线呈 S形。由图 2可以看出, 高羊
茅 M illenn ium悬浮系 ∀的细胞在继代初期很少分
裂,生长较为缓慢, 大约会经过 4 d左右的延迟生长
期, 之后 4~ 12 d为细胞生长的高峰期,其中 5~ 8 d
为细胞的对数生长期, 细胞分裂迅速, 其 PCV增殖
很快,此时也是分离单细胞的最佳时期。 8 d后进
入细胞增殖减慢的缓慢生长期, 12 d之后进入静止
期, 细胞停止生长, 到第 14 d时培养物已出现严重
的褐化现象, 培养液混浊, PCV有所下降。这可能
是由于培养基中营养成分已耗尽, 细胞出现饥饿状
态, 且分泌出某些有毒物质抑制细胞的生长,部分细
胞死亡解体。由实验结果可知,在换液继代后的 8 d
内悬浮细胞系的营养及环境条件最为适宜, 建立后
处于稳定状态的悬浮系一般 5~ 7 d继代一次,若一
次继代周期过长,悬浮培养物增殖缓慢,营养供应不
足, 容易发生褐化死亡。
222 细胞起始密度、生长速率、pH之间的相互关
系 悬浮细胞的生长速率与初始接种时的细胞密度
有很大关系,如接种物密度低于最适量时,细胞生长
较慢或不生长;反之, 细胞的对数生长期缩短, 悬浮
培养物的生长速率较早降低且停止生长 [ 1]。因此,
确定适宜的细胞起始密度是快速获得胚性悬浮系的
关键。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
a∀型愈伤组织; b!型愈伤组织; c%型愈伤组织; d已建成的悬浮系; e~ f已建成悬浮系的细胞形态; g细胞第一次分裂; h细胞第二次分裂
图 1 高羊茅愈伤组织、悬浮细胞及细胞分裂的形态
图 2 高羊茅悬浮细胞系生长曲线
由图 3,图 4可知,各培养体系的 PCV随着培养
天数的延长均有不同程度的增长。进入缓慢生长期
之后, 各体系 PCV基本稳定在 03~ 04 m l之间。
培养第 14 d时, 体系 a、b、c的培养液浑浊,细胞浓
度高,而体系 d和体系 e已出现褐化现象。由 PCV
增长率曲线可以看出, 体系 a的增长速率显著高于
其它 4个体系,培养第 14 d其生长量仍呈直线上升
趋势, 到第 16 d才开始减缓;体系 d和体系 e增长
平缓,较早进入缓慢生长期,并在第 12 d时生长量
就有回落趋势;体系 b和体系 c介于两者之间。说
明随着培养物起始密度的增加, 悬浮体系进入缓慢
生长期越快,其培养周期越短。PCV达到 04m l时
悬浮系基本达到稳定状态, 超过此临界值悬浮系很
快进入生长停滞期,随着营养物的消耗,细胞很快解
体死亡。因此,高羊茅胚性悬浮细胞系较适宜的细
胞起始密度在 10~ 30m l/40 m l之间。
在生长周期内, 5个悬浮系的 pH值均呈现波状
动态变化,最适宜的 pH范围在 50~ 57之间。在
培养的前 8 d 5个悬浮系的 pH值先下降后上升, 之
后随着培养物浓度的增加, pH值又逐渐下降, 培养
第 16 d各体系的 pH值均明显攀升,培养液呈碱性。
Am ino和 Tazaw a[ 7]曾报道在水稻悬浮细胞中早期蔗
糖的快速水解会导致培养液的 pH值相应下降, 本
试验结果与此相符。之后 pH值的上升基本与培养
物的增长呈正相关。在培养的第 8 d 5个体系的 pH
值达到一个峰值后又有较大幅度的回落,可能是由
于悬浮系中培养物过多,细胞浓度过大,且营养物逐
渐消耗,产生了大量的酸性物质所致。 16 d后悬浮
系大都进入生长的缓慢期或静止期,这时体系的 pH
值骤然上升,且上升幅度很大。分析原因可能是体
系在缺失营养、饥饿的状态下,一部分细胞死亡后会
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2009年第 4期 杨帆等:高羊茅胚性悬浮细胞系的快速建立及其单细胞培养
产生碱性物质,从而致使体系的 pH值上升。
图 3 不同体系 PCV增长率的变化
a起始密度为 10m l/40 m l的悬浮体系; b起始密度为 20 m l /40
m l的悬浮体系; c起始密度为 30 m l /40 m l的悬浮体系; d起始密
度为 40 m l/40m l的悬浮体系; e起始密度为 50m l /40 m l的悬浮
体系
折线表示悬浮系 pH值,柱状图表示悬浮系的 PCV值
图 4 不同体系生长量及 pH值的变化
223 肌醇浓度对悬浮系生长量的影响 由图 5
可以看出,当 MS!培养基中其他因素不变时, 随着
肌醇浓度的增加, 悬浮系的 PCV和 OD600 nm值均有
不同程度的提高。但方差分析表明各处理间并无显
著差异,肌醇浓度为 300mg /L时悬浮系的生长量稍
高于其他处理。因此,对于高羊茅悬浮细胞系来说,
肌醇浓度对其生长影响并不显著。
224 培养方式对单细胞培养的影响 显微观察高
羊茅单细胞大小约为 50~ 100 m,因此悬浮培养物
用 200目 ( 75 m)镍丝网过滤后即可得到由单细胞组
成的悬浮液。经 3种方式培养发现,大部分细胞在培
养的第 1 d即可观察到第一次分裂相, 2 d后出现第二
次分裂相, 3~ 4 d明显可见多数小细胞团 (由 4个以上
细胞组成 )形成 (图 1g~ h)。培养 5 d后调查细胞分裂
率、圆细胞率和细胞生长量,用血球计数板计数。
A肌醇浓度为 100 mg /L; B肌醇浓度为 300 m g /L; C肌醇浓度为
600 mg /L; D肌醇浓度为 800m g /L
图 5 肌醇浓度对悬浮系生长量的影响
由图 6可以看出,悬浮培养的细胞生长量、圆
细胞率和细胞分裂率均高于另两种培养方式, 在
培养第 3 d即有针尖大小的愈伤组织生成, 5 d后
愈伤组织约为 01~ 05 mm。浅层静止培养的细
胞在第 5 d出现针尖大小的愈伤组织, 稍滞后于悬
浮培养。分析原因可能是悬浮培养能够提供较好
的通气状况, 且细胞分散均匀, 与培养液充分接
触,为细胞分裂创造了良好的条件, 而浅层静止培
养的细胞多聚集在瓶底, 细胞间发生粘连, 对其快
速生长有一定的抑制作用。平板培养的优势在于
可以定点观察细胞的生长状况,在培养的第 5 d虽
未出现肉眼可见的愈伤组织, 但镜检可观察到已
有多半细胞分裂增殖为小细胞团,第 9 d出现肉眼
可见的愈伤组织, 大小为 02 mm左右。 3种培养
方式均能再生愈伤, 以悬浮培养的细胞生长速度
最快, 浅层静止培养次之。
图 6 培养方式对单细胞培养的影响
75
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
3 结语与讨论
良好的液体悬浮系是细胞培养的根本保证 [ 9]。
快速建立高质量的高羊茅胚性悬浮细胞系的关键是
选择并改造初生愈伤组织 [ 3]。大多数情况下,疏松易
碎的愈伤组织不能直接由外植体诱导获得, 而是在愈
伤组织继代过程中通过筛选获得 [ 6]。为获得适合悬
浮培养的!型胚性愈伤组织,本试验根据愈伤组织的
生长状况,适时调整培养基配方,对愈伤组织的状态
进行调控。结果表明,在培养基中加入 25mg /L Cu
SO4 5H2O或增加 NH 4NO3浓度至25 g /L均能明显
提高高羊茅!型胚性愈伤组织的发生率。
在悬浮培养过程中, 先进行一段时间的高羊茅
悬浮启动培养能大大缩短悬浮系建立的时间。选用
MS∀液体培养基为启动培养基, 一个月后再转用
MS!继代培养,约 2个月左右即可建立起稳定的胚
性悬浮细胞系。高羊茅的组织培养没有一套固定的
系统,因此显微观察尤为必要。悬浮培养初期每次
换液继代时都要进行显微观察,有意识的弃去形状
不规则的中空的细胞,保留比重较大、圆形或椭圆形
的细胞或小细胞团。建成的悬浮系细胞表现为大小
均一、细胞质浓厚、圆形或椭圆形。
细胞起始密度是影响悬浮体系生长周期和生长
量的关键因素。对高羊茅胚性悬浮系来说, 10 ~
30m l/40 m l为较适宜的起始密度。随着起始密度
的继续增加,细胞的对数生长期随之缩短,培养物的
生长速率较早降低且停止生长。 pH值为 50~ 57
时较为适宜悬浮细胞的分裂增殖, 悬浮培养物的
PCV增长较快。 5~ 8 d为悬浮细胞系的对数生长
期,此时细胞分裂旺盛,是分离单细胞的最佳时期。
本试验选取处于对数生长期的悬浮系 200目过筛后
进行单细胞培养,发现悬浮培养的细胞分裂增殖较
快,第 3 d即可形成肉眼可见的愈伤组织,其圆细胞
率和细胞分裂率均高于浅层静止培养和平板培养。
本试验中仍存在一些问题。例如在悬浮培养过
程中,悬浮系的 pH值不断波动,这与已有相关报道
不甚符合。曹毅 [ 6]、向太和 [ 8]的试验结果表明培养
液 pH值在继代 3 d内有较大幅度的下降,随后稍有
上升或维持在相对稳定的水平。而本试验中, 高羊
茅细胞系在悬浮培养过程中培养液 pH值经历了两
个下降和上升的过程,推测可能与细胞生长状态密
切相关,具体原因仍有待今后进一步研究。
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