全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(7)：1011—1016
Aeta Horticuhurae Sinica
吉 日
同 Irm
分析
胁迫下番茄叶片差异表达基 因的 cDNA—AFLP
刘志勇 ，杜永臣 ，王孝宣 ，
(’中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；
国艳梅 ，高建昌
。上海市农业科学院园艺研究所，上海 201 106)
摘 要：为鉴定番茄高温胁迫响应基因，应用 cDNA—AFLP技术，以番茄耐热品系 Saladette幼苗为研究
对象，对高温胁迫早期叶片基因表达进行了 mRNA指纹分析。通过 768对引物组合的筛选，共分离得到
187个差异表达的转录衍生片段 (TDF)，其中增强表达或高温胁迫下特异性表达 TDF153条，抑制表达 34
条。对其中47个 TDF进行了克隆、测序和序列分析。结果表明：34个 TDF与 NCBI或 TIGR已有序列同源
(E—Value<10。)，功能涉及信号传导、转录调控以及逆境诱导蛋白等 ，另有 l3个 TDF无同源序列或同源
性低，预测是一些未知功能基因。
关键词 ：番茄；高温胁迫 ；cDNA—AFLP；差异表达基因
中图分类号 ：S 641．2 文献标识码：A 文章编号：0513—353X (2008)07—1011-06
Identifcation of Diferentially Expressed Genes by cDNA-AFLP Approach
During Heat Stress in Tomato Leaves
LIU Zhi．yong · ，DU Yong．chen ，WANG Xiao．xuan ，GUO Yan．mei ，and GAO Jian．chang
(’Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy ofAgricultural Sciences，Beijing 10008 1，China； Horticultural Research
Institute，Shanghai Academy ofAgricultural Sciences，Shanghai 201106，China)
Abstract：In order to identify genes involved in heat shock responses in tomato．cDNA-AFLP approach
was employed to identify genes differentially expressed in tomato leaves at high temperature。Seven hundred
and sixty-eight primer combinations were used for selective amplification．One hundred and eighty-seven TDFs
were selected for their diferential expression under heat stress．Among the 1 87 TDFs，153 TDFs were up．reg．
ulated and 34 TDFs were suppressed．Forty-seven TDFs were cloned and sequenced．Compared with the pub-
licly available databases，34 TDFs presented some signifcant similarity with known plant sequences，whose
functions are involved in gene regulation，transcription factor，signal transduction，stress defense，etc．Thir-
teen TDFs with low identity and no match to known genes may represent novel tomato genes．
Key words：tomato；Solanum lycopersicum；heat stress；cDNA-AFLP；differentialy expressed genes
番茄 (Solanum lycopersicum)作为喜温性蔬菜作物，最适宜温度范围为20～25℃，适应温度范
围为 15～33℃。生产中环境温度往往会超过这一温度范围，达到35℃以上，甚至超过40℃，高温
胁迫成为番茄生产中产量和品质提高的主要限制因素之一 (杜永臣 等，1999)。改良番茄耐热性是应
对高温胁迫这一世界性难题的重要途径。目前，在转录水平上对植物外界非生物胁迫应答机制的研究
主要集中在拟南芥、水稻等模式植物上，以番茄为试材的研究相对较少；研究的胁迫类型以干旱、冷
害、盐胁迫为主，以高温胁迫为研究对象的则很少，对植物高温胁迫应答机制的研究也很有限，尚
未见到关于高温胁迫下番茄基因表达谱动态变化的报道 (Sim~es．Arat~jo et a1．，2002：Rensink et
收稿日期：2008—03—05；修回日期：2008—05—26
基金项目：国家自然科学基金资助项目 (30571274，30771474)；农业部蔬菜遗传与生理重点开放实验室项目
通讯作者 Author for corespondence(E-mail：yongchen．du@mail．caas．net．Cr1)
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园 艺 学 报 35卷
a1．，2005；Zhang et a1．，2005)。
DNA．AFLP是近年来发展起来的重要的转录基因组学研究工具，具有高效、灵敏、重复性强等
特点 (Bachem et a1．，1996；Vandenabeele et a1．，2003)。本研究中采用 cDNA-AFLP技术研究了高温
胁迫早期耐热性番茄品系叶片基因差异表达，以期为深人了解番茄的热应激反应奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
试材为番茄耐热品系Saladete(美国番茄遗传中心，编号 LA2662)。种子催芽后播种于育苗盘，
幼苗长至一叶一心时移人育苗钵中。以草炭、蛭石、鸡粪 (6：3：1)为培养介质，培养于日光温室，
自然光照，温度保持在 l5～30℃，常规管理。
当幼苗长至三叶一心时转人人工气候箱 (PRX-450，中国赛福)，适应生长3 d，昼／夜温度25／20
℃，光照强度500 Ixmol·m～·s～，光周期 14 h／lO h，湿度 75％～85％。高温处理当日，给予光照
2 h后，38℃高温处理 24 h。分别在胁迫处理后0、6、12、18和24 h取第 3片真叶，液氮速冻后保
存于 一80℃备用。每时间点设2次重复，每重复5株。
1．2 总 RNA提取和双链 eDNA合成
利用 TRizol(Invitrogen)提取番茄叶片总 RNA，用 RNase-Free DNAse I (天根公司，中国)处
理总 RNA，去除残留的基因组 DNA，浓度调至 l g· ～。第 l链 cDNA合成按 Invitrogen公司 su-
perScript1试剂盒操作说明进行。第 2链 cDNA合成采用以下反应体系进行 (所用酶均为 TakaRa产
品)：10 L 10×NEB bufer 2，5 IxL E．coli DNA Polymerase I，l L RNase H，3 L dNTP(10 mmol·
L each)，20 L第 l链 cDNA产物，补充超纯水至 100 L。16℃反应2．5 h后，80℃ 15 min灭活
酶活性。反应产物经抽提、沉淀和洗涤后溶于20 L TE中，浓度调至20 ng· L～。
1．3 cDNA-AFLP分析
cDNA．AFLP体系及程序参照 Bachem等 (1996)所述的方法略加修改。以EcoR I和 Mse I为酶
切组合，取200 ng双链 cDNA一步法酶切连接，制备预扩增模板。EcoR I预扩增和选择性扩增引物
分别为：5 ．GACTGCGTACCAA1丫rC．3 ，5 ．GACTGCGTACCAAn℃NN-3 ；Mse I预扩增和选择性扩增引
物分别为：5 ．GACGATGAGTCCTGAGTAA．3 ，5 -GACGATGAGTCCTGAGTAANNN-3 (N为任何一种碱
基)。预扩产物稀释40倍后，用于选择性扩增。选择性扩增产物在 4％聚丙烯酰胺凝胶上70 w功率
进行电泳分离 (Sequi-Gen GT，Bio．rab)，银染法显示条带 (Sanguineti et a1．，1994)。
1．4 差异表达 TDF (transcripts delved fragments，TDF)回收、序列测定与分析
切下目的差异片段放人 1．5 mL离心管，加人400 L高盐 Bufer(20％乙醇，l mol·L～LiC1，
10 mmol·L s)，室温放置24 h。65℃水浴 2 h，13 000 g离心 15 min，取上清，沉淀、洗涤微量
DNA，溶于20 TE中，取5 用作二次扩增模板。
PCR产物经纯化后连接 Promega公司的T-easy载体，转化 Top10感受态细胞，通过蓝白菌落挑选阳
性克隆，委托北京三博远志生物技术有限责任公司进行 DNA序列测定。功能分析：首先在 GenBank中
进行BlastX比对，对无同源性的 TDF继续进行 BlastN分析；仍无同源性序列的在 TIGR (htp：／／
www．tigr．or#)番茄基因索引数据库中进行 Blast分析。
1．5 差异表达基因的半定量 RT-PCR验证
设计 TDF7、TDF26、TDF34和TDF35的基因特异性引物 (表 1)，以延伸因子 EF1-Ot为内标基
因，进行半定量 RT．PCR验证。利用 1．2方法提取高温处理后0、6、12、18和24 h叶片总 RNA，逆
转录合成 cDNA第 1链，用作 RT．PCR模板。PCR扩增条件为：94℃ 3 min；94℃ 30 S，58℃ 30 S，
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7 期 刘志勇等 ： 高温胁 迫下 番茄 叶片差 异表达基 因的 cD N A — A F L P 分析 1013
72 qC 30 S ， 24 ～ 30 个循环 ； 72 oC 延 伸 5 m in 。 P C R 扩增产物经 2． 5 ％ 琼脂糖凝胶 电泳分离 ， B io ． R A D
凝胶成像系统显 示 结果 。
表 1 半定 量 R T - P C R 引物
T able 1 P rim ers and their sequences used in se m i- qu antity R T ? P C R
2 结果 与分析
2． 1 cD N A - A F L P 结 果分析
利用 768 对 E coR I 和 M se I 引物组 合进行选 择性扩增 。 为 了提高谱带统计 的准确性 ， 根据 5 人 目
测结果判断 T D F 的表达模式 (组 成型 表达 、 诱导或增强 表达 以及 抑制表达 )。 结果表明 ， 同一 取样时
间的两 次重 复之 间显 影结果高度 一 致 (图 1 )。 平
均每对 引物 组 合扩 增 出 15 ～ 30 条 T D F ， 长 度 在
20 ～ 700 bp 之 间 。 绝大部分 T D F 在试 验 设计 时 间
范围内 (0 — 24 h) 呈 组 成 型 表 达 (图 1 ， A 、 B
和 C )。 768 对 引物组 合共检测 到 187 条差异表达
T D F ， 约 占总条带数 的 1％ 。 其 中 ， 增强 表达或高
温胁迫下特异性表达 T D F 153 条 ， 抑 制表达 的 34
条 ， 差异 表 达 T D F 的 具 体 表 达 模 式 呈 现 多 样 化
(图 1 )。 在诱导表达 基 因 中 ， 一 些 T D F 只在 特定
的处理 时间内出现 ， 可 能 是 具 有特殊 作用 的调 控
因子 ， 发挥作用后 迅 速 降解 (图 1 ， E )； 另 外 一
些诱导 表达基 因在高温 处 理 过程 中均有 表达 (图
l， D )。 一 些 基 因在 高温 处 理 初 期 表 达 ， 处 理 后
期 已经 检测不 到其表达 ， 表 现 为 明显 的高温 抑 制
(图 1 ， F )。
2． 2 差异 片段功能分析
图 1 不 同表达模式 T D F
A 、 B 、 C 为组 成 型表达 ； D 和 E 为诱导 表达 ； F 为抑制表达 。
F ig． 1 T D F s w ith diferentexpression patterns
A ， B and C expressed constitutively； D and E w ere
up? regulated； F w as suppressed．
从 187 条差异表达 T D F 中 ， 挑选 61 条带 回收进行二 次 P C R 扩增 ， 共得 到 4 7 个有效序列 ， T D F 3 、
T D F 7 、 T D F 21 、 T D F 4 2 、 T D F 4 4 和 T D F 4 5 等 6 个 T D F 为下调表达 ， 其余 4 1 个为上 调 表达 。 34 个 T D F
可 以找 到较 高 同源性 的序列 (0 < E 值 < 10 1 5 )， 剩余 13 个 在 NC B I 和 T IG R 中均无 同源 序列 (包括
E S T )， 这些 T D F 可能代表番茄未知功能基 因 (表 2)。
根据生 物过程 (biologicalprocess) 对 34 个可 以 找到较 高同源性 序列 的差 异 T D F 进行功 能 归类 ，
其中 15 个 分 别 涉 及 代 谢 (T D F 4 、 T D F 7 、 T D F 25 、 T D F 3 I 、 T D F 34 、 T D F 38、 T D F 4 0 )、 信 号 传 导
(T D F l6 、 T D F 27 )、 转 录调 控 (T D F l)、 D N A 结 合 (T D F l0 )、 逆 境 响应 (T D F l3 、 T D F 24 、 T D F 26 、
T D F 35 )， 剩余 19 个功能未知 。 T D F l8、 T D F 20 、 T D F 28、 T D F 33 、 T D F 4 1 等 T D F 与 NC B I 已公布 的番
茄表达序列 (m R N A 或 E S T ) 相 同 ， 但功能未知 。
F A E B D C
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1014 园 艺 学 报 35卷
注：x代表 BlastX分析；N代表 BlastN分析；T代表在TIGR中进行 Blast分析。
Note：X and N represented similarity analyses of TDF sequences using BlastX and BlastN，respectively；T represented the Blast in TIGR
2．3 半定量 RT-PCR分析
为了保证试验结果的可信度，对部分差异表达 TDF进行了半定量 RT．PCR验证。结果表明，RT-
PCR与cDNA-AFLP的结果吻合 (图 2)。在 25 cI二下，TDF26(热激蛋白90)和 TDF35(热激蛋白
70)均维持低水平表达，高温处理后上调表达，TDF26转录高峰出现在6 h，TDF35出现于 12 h；常
温下，编码钠／锂抗性蛋 白的 TDF34转录水平很低，高温处理能明显增强其表达；在 RT．PCR和
cDNA．AFLP分析中，高温胁迫均能抑制 TDF7(原叶绿酸氧化还原酶)的表达，只是抑制程度稍有不
同，在 RT．PCR中，高温处理 12 h后其转录水平明显降低，而在 cDNA．AFLP分析中已经检测不到其
转录。由此看出，本研究所得结果是可靠的，而且 cDNA．AFLP用于番茄的基因差异表达分析是完全
可行的。
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7 期 刘志勇等 ： 高温胁迫下 番茄叶片差异表达 基 因的 cD N A — A F L P 分析
T D F 7
T D F 26
T D F 34
T D F 35
E F l． Ⅱ
图 2 差 异 片段 的 R T - P C R 检测
F ig． 2 A nalysis ofR T - P C R for diferentialfragm ents
3 讨论
蛋 白磷酸化被认 为是胁迫信号传递过程 中的关键或中心 环节 ， 蛋 白激酶则是蛋 白磷酸化过程 中的关
键酶 。 在真核细胞 内 ， 促分裂原 活化蛋 白激酶 (M A P 激酶 ) 家族组 成 M A P 激酶级联 途径 。 植物在机械
压 力 、 创伤 、 盐害 、 低温 、 干旱等不 同的逆境条件下 ， 均能诱导和激活 M A P K 链 ， 将信号不断放大并传
递下去 (刘强 等 ， 2000)。 植物热激信号传导 同样存在 M A P 激酶级联途径 。 热激 因子 (heat shock fac —
tor ， H S F ) 直接调控热激蛋 白基 因的表达 (Nover et a1． ， 2001 )， 一 种热诱导番茄 M A P K 可 以选择性地磷
酸化 H S F A 3 ， 对 H S F A l却不起作用 (V inzenz et a1． ， 2002)。 本研究也表明 ， 番茄存在受热诱导 的 M AP
激酶 (T D F 27 )， 但高温胁迫激活的 M A P 激酶级联途径 同其他逆境是否相同 ， M A P 激酶级联途径在热激
信号传导途径 中所处地 位如何 ， 尚不 清楚 。 14 — 3 — 3 作为多效应蛋 白 ， 通 过包括磷酸化在 内的多种机 制调
控信号传导途径不 同组 分的状 态和功能 ， 参与胁迫信号的传导 (R oberts et a1． ， 2002 ； X u & S hi， 2006 )。
T D F l6 的诱导表达预示着 14 - 3 - 3 蛋 白也可能参与了番茄的热激信号传导 。
植物热激反应 的重要表现之 一 是产生 热激蛋 白。 大部分 的热激蛋 白行使分子伴侣功能 ， 参与生物
体内新生肽 的运输 、 折叠 、 组 装 、 定 位 以 及 变 性 蛋 白的复性 和 降解 (S oil， 2002 )。 T D F l3 、 T D F 26 、
T D F 35 和 T D F 24 分别来 自 H S P l01 、 H S P 90 、 H S P 70 和 H splO O ／C lp (C aseinolytic protease ) 编码 基 因 ，
且 均受高温诱导 。 植物胞质 H S P l01 在植 物耐热 ， 特别 是 “ 获得 耐热 性 ” 方 面 起 重 要 作用 (H o ng &
V ierlin g， 2001 ； 杨金莹 等 ， 2006)。 C lp 可 以 及 时 清除细胞 内 一 些 具 有潜在毒性 的不 可 逆 损 伤蛋 白 ，
协助其他分子修复受损蛋 白 (Nakashim a et a1． ， 1997 ； S jogren et a1． ， 2006 )。 一 些研究证 明 H S P 的过
量表达确实提高了植物的耐热性 (S u ng & G uy， 2003 )， 也 有研 究表 明 H S P 70 过量表 达并不 会 显 著提
高植物的耐热性 (V itale et a1． ， 1995 )， 因此 不 同 H S P 70 家族成员可 能在植物耐热 中的作用 不 同 。 番
茄 H S P 70 家族成员 的亚 细胞定位 以及在番茄热应激反 应 中的功能 ， 有待于进 一 步研究 。
细胞 色素 P 4 50 、 锌指蛋 白 、 R ab 蛋 白等在抵 抗 非 生 物胁 迫 方 面 具 有重 要 作用 (T akem oto et a1． ，
1999 ； M azeleta1． ， 2004 ； M ukhopadhyay et a1． ， 2004 ； Q iet a1． ， 2006 )， 但与植 物耐热之 间 的关 系则
少有报道 。 此 类高温诱导 的 T D F ， 可 以 利用 R A C E 或 电子 克隆的方法 获取其全长基 因 ， 进 一 步研 究与
植物耐热性之 间的关 系 。 在下 调 表达 的 7 个基 因 中 ， 只有 T D F 7 的基 因功 能是 明确的 ， 编码 原 叶绿 酸
氧化还 原酶 (prolochlom phyllide oxidoreductase ， P O R ， E C 1 ． 3 ． 1 ． 33 )， 该 酶是 叶绿 素合成 和 叶绿 体发
育的关键酶 。 高温胁迫抑制 P O R 的表达 ， 可能是造成高温胁迫下 叶绿素合成减少 的重要 原 因之 一 。
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