全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(7)：967—972
Acta Horticulturae Sinica
葡萄 A病毒四川分离物的外壳蛋白基因克隆与原
核表达
王建辉 ，刘 晓 ，席德慧 ，袁 澍 ，蒋 或 ，杨 辉 ，杜俊波 ，张中伟 ，
陈克玲 ，林宏辉
( I~JII大学生命科学学院，生物资源和生态环境教育部重点实验室，成都 610064； I~JI省农业科学院园艺研究所，
成都 610066)
摘 要：葡萄 A病毒 (Grapevine virus A，GVA)是葡萄病毒属 (Vitivirus)的典型种，在世界葡萄产区
广泛分布。采集 l0株 ‘藤稔’葡萄成熟枝条，使用6种葡萄病毒ELISA试剂盒检测发现，l0个样本中有6
个感染 4种不同的葡萄病毒。以GVA的 ELISA阳性植株为材料进行 RT—PCR扩增，首次获得了 GVA四川1
分离物 SLIO的完整外壳蛋白基因 (CP)，该基因全长597 bp。将其与 GenBank收录的l5个 GVA分离物的
CP序列进行比对和构建系统进化树，把不同地理起源的 GVA分离物分成两个变异组，其中 I组包括 3个
分离物 (与Ⅱ组的其他分离物只有75．9％ ～80．1％的序列同一性)；其余的 l3个分离物组成 Ⅱ组 (组内分
离物具有 84．4％ ～99．5％的序列同一性)。构建了GVA CP的原核表达质粒 PET一30一GVAcp并转化 BL21菌
株，经 IPTG诱导，目的基因得到了大量表达。
关键词：葡萄；葡萄 A病毒；ELISA；RT—PCR；外壳蛋白基因；原核表达
中图分类号：S 663．1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2008)07-0967-06
Cloning and Prokaryotic Expression of CP Gene of Grapevine virus A Sichuan
Isolate
WANG Jian．hui 一， LIU Xiao ，XI De．hui ，YUAN Shu ，JIANG Yu ，YANG Hui ，DU Jun—bo ，
ZHANG Zhong．wei ，CHEN Ke．1ing ，and LIN Hong．hui
[ Key Laboratory of口 o—resources and Eco—environment(Ministry of Education)，College of Sciences，Sichnan University，
Chengdu 610064，China； Horticulture Institute，Sichuan Academy ofAgriculture and Sciences，Chengdu 610066，China]
Abstract：Grapevine virus A (GVA)is a typical member in genus Vitivirus．The virus has been broadly
discovered in vineyard around the world．Using an ELISA detection technology，four virus species were identi-
fied in 6 out of 10 shoot samples of Japanese hybrid grape，ev．Fujiminori，reverse transcription-polymerase
chain reaction(RT-PCR)was used to amplify a complete coding sequence of the GVA coat protein(CP)from
the virus-positive shoot samples．The CP gene，specified as the Sichuan isolate“SL1 0”，contains 597 base
pairs in length．The‘SL10”CP gene was compared with other 15 GenBank-collected CP genes，isolated from
different geographic origins．Phylogenetic analysis clearly clustered the 1 6 CP genes into two distinguished
groups．Group I contains only 3 members．The nucleotide identities among the 3 members range from
75．9％ to 80．1％ ：Whereas group Ⅱ holds the rest 1 3 members．The nucleotide identities within the men．
bers in this group vary from 84．4％ to 99．5％ ．The isolated CP gene was cloned into a prokaryotic expression
收稿日期：2008—01—14；修回日期：2008—05—09
基金项目：教育部新世纪优秀人才基金项 目 (NET-0876)；教育部博士点基金项 目 (20070610172)；四川I省科技攻关项 目
(07KJT-08)；四川省应用基础项 目 (07JY029-068)；四川大学青年基金项目 (XQ06039)
}通讯作者 Author for corespondence(E—mail：honghuilin@vip．sina．com)
致谢：衷心感谢意大利海外农业研究所提供部分酶联检测试剂盒和美国 Oklahoma大学 Lj Jia教授对本文的审阅。
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园 艺 学 报 35卷
vector and transformed into an E．coli strain BL2 1．After induced by IPTG，the CP gene was highly expressed
in the E．coli．
Key words：grape；Grapevine virus A；ELISA；RT—PCR；coat protein gene；prokaryotic expression
葡萄带毒种苗与昆虫介体传播常造成病毒病广泛流行，严重影响其产量和品质。目前国内文献记
载的葡萄病毒主要包括葡萄卷叶伴随病毒、葡萄扇叶病毒和葡萄病毒属病毒。葡萄病毒属是一个新建
的病毒属 (Marteli et a1．，1997)，包括葡萄 A病毒和葡萄 B病毒等。
葡萄 A病毒 (GVA)为线状，全长 800 nm，基因组为正链 RNA分子，共编码5个开放阅读框
(ORF)。GVA是一种韧皮部限制性病毒，被多种粉蚧传播 (Boscia et a1．，1993)。很多研究证明
GVA紧密伴随克勃葡萄茎沟病 (KSG)，表现典型的葡萄粗皮病症状 (RW)。目前国际上正在开展
GVA基因功能的研究，Galiaparov等 (1999)成功构建了GVA侵染性克隆，利用 ORF插入突变对病
毒基因功能进行了研究。病毒共侵染技术证明病毒 ORF5蛋白有结合 siRNA与 microRNA的能力和抑
制转录后基因沉默的效应 (Zhou et a1．，2006)。迄今国内鲜有 GVA的研究报道。本研究中，首次克
隆了GVA四川分离株SL10的外壳蛋白基因 (c尸)，与其他 GVA分离株的 CP序列进行多重比对和系
统进化树的探讨，把目前已知的 GVA分离株分成两个变异组，构建了pET30一GVAcp重组表达载体，
在合适的诱导条件下 CP融合蛋白得到过量表达，为制备多克隆抗血清打下了基础。
1 材料与方法
1．1 材料
采集四川省农业科学院园艺研究所葡萄园中没有明显卷叶、粗皮症状的欧美杂交鲜食品种 ‘藤
稔’葡萄 1年生成熟枝条。共计 1O株待测样本，分别装入标记的塑料袋中，带回实验室并保存在
一 2O℃冰箱中。
1．2 ELISA检测
购买商业试剂盒 (Agritest，Italy)。参考 Clark和 Adams(1977)的方法，对 1O株葡萄样本检测
葡萄卷叶伴随 2型病毒 (Grapevine leafrol1．associated virus-2，GLRaV．2)、葡萄卷叶伴 随 3型病毒
(Grapevine leafrol1．asociated virus．3，GLRaV．3)、葡萄卷叶伴随 7型病毒 (Grapevine leafrol associated
virus一7，GLRaV-7)、葡萄扇叶病毒 (Grapevine如nle virus，GFLV)、葡萄 A病毒 (Grapevine virus A，
GVA)和葡萄 B病毒 (Grapevine virus B，GVB)。
1．3 RT-PCR检测
分别取上述 ELISA检测呈 GVA阳性、阴性材料的绿色韧皮部组织，共计 4个样本。改进硅胶颗
粒吸收法 (Foissac et a1．，2000)，提取每个样本的总核酸 (TNA)。利用软件 (DNAMAN 5．2．2，
Lynnon Biosoft，Canada)和美国生物技术信息中心 (NCBI)核酸数据库中两个已知 GVA全长序列
(DQ855088，X75433)设计 CP上游简并引物 A．1：TCCATGGS(C／G)W (A／T)CAS(C／G)Tw
(A／T)CGCM (C／A)AR (A／G)G和其下游简并引物A．2：CTATATCTCR (G／A)ACAGCY (C／T)
TGY (C／T)TC。参照 Wang等 (2006)的方法，进行 RT．PCR检测。
1．4 CP克隆和序列分析
参考 xi等 (2006)的方法，把上述第 1O号样本的RT．PCR产物回收连接 pMD18(TaKaRa)，转
化 E．coli DH5c~(实验室保存)感受态；随机选择3个克隆 (pMD．GVAcp)测序并分析。于NCBI核
酸数据 库 中进行 BLAST分析，获得其 它 15个 GVA外壳 核酸序 列 (AF007415、AY340581、
DQ855083 DQ855087、 AF441234 DQ787959 DQ855084、 DQ855088 AF441235 DQ855081
DQ855085、AY2445 1 6、DQ855082、DQ855086和X75433)。用 DNAStar软件包中的 MegAlign多重比
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7 期 王 建辉等 ： 葡萄 A 病毒 四川分离物的外壳蛋 白基 因克隆与原核表达 969
对 (C lustalW 方法 )， 分析不 同分离株之 间的核酸序列 比对 的 同 一 性 和 差异性大小 。 M ega3 采用邻接
法 (N eighbor． J oining) 并设定 1 000 重 复值的 bootstrap 评估遗传距 离分枝 的可信度 ， 构建不 同地 理 起
源分离株的 系统进 化树 。
1 ． 5 表达载体 的构建 和质粒 的转化
将上 述 获得 的 G V A C P 基 因 的克隆质粒 pM D — G V A cp 和 实验 室 保存 的 P E T - 30 (N ovagen ， U S A )，
分别用 Nco I 和 E coR I 双 酶切 。 分别 回收相应大小的酶切 片段进行连接 ， 把连接 产物转化 到 B L 21 感
受态 中 (实验 室保存 )。 小量提取质粒 (P E T 一 30 - G V A cp)， 用 N co I 和 E coR I 双 酶切 检测 。
1 ． 6 重 组 质粒在大肠 杆菌中的诱导 表达与检测
将转化重组 质粒 P E T 一 30 一 G V A cp 的表达菌株 B L 21 接种于 含有 50 Ixg ? m L 。 。卡那霉素的 L B 液体培
养基 中 ， 37 ℃ 培养过 夜 。 然 后 按 l％ 的接 种 量 转 接 到 新 鲜制 备 的 L B 培 养液 中 ， 37 ℃ 继 续 培 养 至
0 D ㈣ 达 到 0． 3 ～ 0． 5 时加入 不 同浓 度 的 (1 、 3 m m ol ? L 。 。) IFq

G ， 在 不 同的 温 度 (28、 30 、 37 ℃ )
下进行诱导表达 ， 0 、 0． 5 、 1 、 2 h后分别取样 ， 裂解液裂解并用超声 波破碎细胞 ， 离心 取上 清液用 于
S D S — P A G E 检测 ， 以选 择最佳诱导条件 。 参考 xi等 (2007 ) 的方法进行 W estern 杂交 ， 检测蛋 白条带
的免疫特异性 。
2 结果 与分析
2． 1 E L IS A 和 R T - P C R 检测
E L IS A 检测结 果表 明 ， 随 机 采 集 的 10 株 ‘ 藤 稔 ’ 葡萄分别被感 染 了 4 种 葡萄病 毒 ： G L R aV - 2 ，
G L R aV 一 3 ， G V A 和 G V B (表 1 )。 感 染 率最 高 的 是 G L R aV ． 3 ， 达 到 60％ ； 其 次 是 G V A ， 达 到 4 0％ ；
G L R aV - 2 和 G V B 的感染率都是 20％ 。 8 号样本混 合感染 了 G L R A V 一 3 和 G V A 两 种病 毒 ； 6 和 10 号样
本均混合感染 4 种病毒 ； 而 3 、 5 、 9 号样本经 E L IS A 检测呈 阴性 ， 占检测样 品量 的 30％ 。
R T — P C R 分别检测 了其 中 7 、 8、 9 、 10 号样本 ， 其中 7 、 8、 10 号 (E L IS A 检测呈 阳性 的样本 ) 中
均扩增 出约 600 bp 大小的片段 ， 而 9 号 (E L IS A 检测呈 阴性 的样本 ) 中没 有扩增 片段 (图 1 )。
表 1 E L IS A 检测 10 株 ‘ 藤稔 ’ 葡萄的病 毒 感 染情况
T able 1 Infection status of10 sam ples of
‘ F ujim inori’ detected by E L IS A
编 号 N o ． G F L ~
’
G L R a＼
’
- 2 G L R aV ． 3 G L R aV - 7 G V A G V B
平均感染率／％
A verage infection
— - — —
— - — -
— - — -
— - — ●
— - — -
一 +
— - — -
— - — —
— - — -
一 +
O 20
bp
2 027 —
1 5 84 —
9 4 8 - ． ． 一
83 1 — ?
564 — ?
图 1 不 同藤稔葡萄样本的 R T - P C R 检测 结 果
F ig． 1 D iagnosis ofG V A from differentsam ples
of ‘ V ujim inori’ w ith R T ? P C R
M ： h／E co R I + 州 ，，d Ⅲ ．
600 bp
2． 2 G V A - S L l0 分 离株 C P 克隆和序 列分析
选择 lO 号样本的 P C R 产物克隆和测序 。 序列分析得到 G V A 的全 长 cP ， 并命名 ： G V A 四 川分离
株 S L l0 全长 C P (NC B I 登 录号 ： D Q9 1 1 14 5 )。 G V A 四 川 S L l0 分离株 的 cP 全长 597 bp。 将其分别与
其他 15 个不 同地理 起源 的分离株 C P 序列进 行多重 比对 ， 在核 酸 水平上 同 一 性 为 77 ． 2％ ～ 97 ． 0％ ，
差异 性 为 3 ． 1％ ～ 30． 0％ 。 其 中 D Q 787959 、 D Q 85 5081 和 D Q 855 084 都 是 从 当地 同 一 个 栽 培 品 种
1 2 3 4 5 6 7 8 9
●
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‘shiraz’分离得到的 (Goszczynski&Jooste，2003a)，但是系统进化树 (图2)和多重序列比对同一
性分析 (表2)表明这 3个分离株之间的聚类关系与地理起源没有明显联系；DQ855088(南非分离
株 P163。1)、DQ787959(南非分离株 GTR1—1)、DQ91 1 145(四川分离株 SL10)反而聚在一起。
巴西 Brazil
南非 SouthAfrica
甫非 South,Mrica
意大利 Ita1v
南非 South,Mriea
意大利 Ita1v
南非 South,Mriea
南非 SouthAfrica
南非 South Africa
南非 South Africa
南非 South Africa
甫非 SouthAfrica
南非 South,Mrica
中国四』_1 Siehuan．China
南非 SouthAfrica
南非 South,-kfriea
图2 GVA分离株的系统进化树
NCBI登录号和分离地点对应各树枝；DQ855088(南非分离株 P163—1)．DQ787959(南非分离株 GTR1—1)．
DQ911145(四川分离株 SL10)聚类在一起，用方框标注。
Fig．2 Unrooted phylogeneflc tree of GVA CP constructed by the neighbour-joining method
Isolates were designated with accession number and the country origins behind；
The Siehuan isolate SL10(D09I I I45)and two South Africa isolate P163一I and
GTRI一1(DQ855088 and DQ787959)were clustered together with a box．
表2 GVA不同分离株 CP序列比对同一性与差异性值列表
Table 2 Nucleofide idenfity and divergence analysis of the CP sequences of various GVA isolates ／％
注：对角线以上数据为序列同一性 (％)；对角线以下数据为序列差异性 (％)。
Note：Th e data above diagonal are sequence identity．The data below diagonal are sequence divergence．
1．D0911145；2．D9855088：3．DQ787959；4．AF007415；5．AF441234；6．AF441235；7．AY244516；8．AY340581；9
DQ855081；10．DQ855082；l1．DQ855083；l2．DQ855084；13．DQ855085；14．DQ855086：15．DQ855087．
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7 期 王 建辉等 ： 葡萄 A 病毒 四川分离物的外壳蛋 白基 因克隆与原核表达 971
根据 序列 比对 同一 性大小 ， 16 个分离株分成两个变异组 ： 四川分离株 S L IO 与两 个南非分离株构
成 I 组 (与 Ⅱ组 的组 间 比对 只有 75 ． 9％ ～ 80． 1％ 同一 性 ； 而 I 组 内比对 有 92． 8％ ～ 97 ． 0％ 同 一 性 )，
其余分离株构成 Ⅱ组 (Ⅱ组 内分离株有高达 84 ． 4 ％ ～ 99 ． 5 ％ 同 一 性 )。 系统进化树分析把所 有分离株
分成两 个聚类群 (图 2)， 与序列 比对分类结果相似 。
2． 3 G V A - S L l0 分 离株 C P 蛋 白原核表达
N co I 和 E coR I 双 酶切鉴定 P E T ． 30 ． G V A cp 过 量表达 质粒 。 空 载体 P E T 一 30 无 目的 片段 ， 而 P F T 一
30 ． G V A cp 和 pM D — G V A cp 双 酶切有大约 600 bp 目的片段 (图 3 )。
通过优化诱导表达条件 (L B 培养基加 1 m m ol? L
～
IP T G ， 在 37 qC 诱导 0． 5 h) 后发现 ， B L 21 过
量表达融合 G V A 外壳蛋 白 。 S D S — P A G E 电泳后经 G 一 250 染色与空对照 比较 ， 在约 21kD 目的位置 多 了
一 条高表达融合蛋 白质条带 (图 4 )。 W estern 杂 交检测 ， 此 高表达 蛋 白有 G V A 外壳蛋 白免疫性 (数
据略 )。
bp
2 00(1 — - - ?卜
l000 — — 一
750 — - — 一
500 — ?
25(、 - - — ?
’00 — - - ?
图 3 重 组 质 粒 pE T - 30 一 G V A cp 的 E co R l和
N co I 双 酶切 鉴定
M ： D 12000 (T a K aR a )； l一 5 ： pE T 一 30 对 照 ，
pE T - 30 一 G X
。
A cp． pE T 一 30 一 G V A cp 重 复 ．
pE T 一 30 对照 重 复 ．
pM D I8- G V A cp 对照 。
F ig． 3 D ouble digestion patterns ofrecom binant
plasm id w ith E coR I and N co l
M ： D 12000 (T aK aR a )； 1 — 5 ： pE T 一 30 (contr0 1)，
pE T 一 30 一 G V A cp． pE T ? 30 一 G V A cp (repeat)。
pE T - 30 (con trolrepeat)．
pM D I8- G 、fA cp (contr0 1)．
kD
1 16 — +
66 2 — ?
4 5 ? - - - 一
1 S — — ●
25 — ?
184 — +
14 4 — +
图 4 B L 21 诱 导 表达 21 kD 大小 的 C P 融合蛋 白
S D S ． P A G E 电泳 图谱
M ： 蛋 白质 m arker (F en n en tas)； 1 ～ 5 ： 空 B 12 1 分别
培养 0 、 0． 5 、 1 、 2 、 3 h的蛋 白提取 物 ；
6 ～ 9 ： 转 pE T 一 30 一 G V A cp 的 B L 21 分别
培 养 0 、 0． 5 、 1 、 2 h的蛋 白提取 物 。
F ig． 4 S D S - P A G E pattern offusion protein w ith C P of
G V A ， 21 kD ， expressed by B L 21
M ： P rotein m olecular m arker (F erm entas)： 1 — 5 ： B L2 1 negative
con trolunder incu bation for 0 ， 0． 5 ， 1 ． 2 ， 3 houm ； 6 — 9 ： B L 21
~ansform ed w itta pE T ? ?30 ? - G V A cp u nder incubation
for 0 ． 0 ． 5 ． 1 ． 2 hou rs ．
3 讨论
G oszczynski和 J ooste (2003 a ) 对 8 个分 离株 的 G V A 基 因组 的 3 ’末 端 区 域序 列 (包 括 部 分 仰 ，
完整 C P ， O R F 5 和部分 3 ’U T R ) 进行 了序列 比对研究 ， 根据分离株间的序列 同一 性大小分成 3 个变异
组 ： I 组 、 Ⅱ组 和 Ⅲ组 ； 其 中Ⅲ组 由温 和致病株系组 成 ， P 163 ． 1 与 G T R l． 1 属 于 Ⅲ组 分离株 。 本研 究
中 ， 依据 16 个 分 离 株 cP 比 对 的 同 一 性 大 小 分 成 两 个 变 异 组 。 I 组 包 括 南 非 分 离 株 P 163 ． 1
(D Q 855088)， 南非分离株 G T R I ． 1 (D Q 787959 ) 和首次获得 的四川分离株 S L IO ， 这 3 个变异株与其
它分离株只有 75 ． 9 ％ ～ 80． 1％ 同 一 性 。 剩余 13 个分离株组 成 Ⅱ组 (组 内分离株间的比对高达 84 ． 4 ％
～ 99 ． 5 ％ 同一 性 )， 包 含 G oszczynski和 J ooste (2003 a ) 定义 的 I 组 、 Ⅱ组 分离株 。
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972 园 艺 学 报 35卷
GVA分离株、地理起源和感染品种三者之间可能没有相关性 (Murolo et a1．，2008)。木本作物
葡萄生产周期长且长期无性繁殖，自然界存在大量不同的昆虫介体传播病毒，这些因素都可能引起植
株混合感染不同的变异株。这造成单株体内积累多种变异株，甚至引起变异株之间重组产生嵌合体，
病毒种群可能逐渐进化成几个具有不同生物学特征的亚群。Goszczynski和Jooste(2003b)SSCP分析
发现，单株葡萄可以混合感染不同的 GVA变异株，其中存在一个数量占优势的变异株。在本研究中
发现 GVA种群结构可能主要由Ⅱ组变异株构成，占分析总分离株数的81．25％。
GVA分子检测的最主要问题是葡萄各种组织里富含多酚、多糖等成分，影响总 RNA的提取。本
研究中改进硅胶颗粒吸收法提取样品总核酸，利用简并引物 RT—PCR成功检测了 GVA，而 ELISA更
适用于大规模样本的检测。
GVA病毒在植株内分布不均匀，浓度低，病毒繁殖受季节性变化影响，而且植株混合感染率比
较高。因此，过量表达病毒CP蛋白制备免疫原与常规提取病毒颗粒相比更方便，并且抗原特异高。
这为未来抗血清制备打下了基础，有助于改善葡萄无病毒苗木生产体系建设。
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